壞死性凋亡在病毒感染性疾病中的研究進展

Abstract：Necrotic apoptosis is a regulated mannerof celldeath，usuall triggered by the binding of death re ceptors and tumor necrosis factors or viral infection. Unlike cell apoptosis，necrotic apoptosis is characterized by cell sweling，membrane rupture，and the release of cytoplasmic contents，which may trigger an inflammatory response and surrounding tissue damage. The discovery process and molecular mechanism of necrotic apoptosis are reviewed，and the TNF- α signaling pathway and the formation of receptor interacting protein kinase 1（RIPK1）/receptor interacting protein kinase 3（RIPK3） complex are focused on discussing. At the same time，the central role of active oxygen in RIPK1-mediated necrotic apoptosis is emphasized and the key role of necrotic apoptosis in host antiviral defense is explained.This review providesa reference of the biological function of necrotic apoptosis and also a theoretical basis for the development of new therapeutic strategies.

Keywords： necrotic apoptosis；virus；programmed cell death；active oxygen

壞死性調(diào)亡的發(fā)現(xiàn)

壞死性凋亡是一種受調(diào)控的細胞死亡過程，其受細胞外及細胞內(nèi)的信號調(diào)控，包括死亡受體-配體結合、病原體感染等，是不同于細胞凋亡、焦亡與自噬的細胞死亡方式。壞死性凋亡機制在形態(tài)學上與細胞凋亡存在顯著差異，這種機制不形成凋亡小體，特征是細胞腫脹、膜破裂，以及細胞質(zhì)內(nèi)容物的釋放，這些過程會引發(fā)炎癥反應和周圍組織損傷。

最初壞死性凋亡是作為死亡結構域受體參與后凋亡的替代方法，1988年，Laster等[1]發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子（TNF）可觸發(fā)細胞凋亡及細胞壞死，但當時人們還沒有意識到細胞壞死是一個可調(diào)控的過程。2000年，Holler等[2發(fā)現(xiàn)Fas/FasL可誘導一種細胞壞死，這個細胞壞死的過程必須依賴受體相互作用蛋白（RIP），即第一次發(fā)現(xiàn)細胞壞死的過程具有蛋白依賴性，但此時仍未發(fā)現(xiàn)細胞壞死可有程序性調(diào)控過程。直到 2005年，Degterev等[3]發(fā)現(xiàn)受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）抑制劑（Nec-1）可觸發(fā)一種RIPK1依賴的壞死，這種壞死可受嚴格的程序性調(diào)控。2005年，壞死性凋亡被正式定義，即由 RIPK1介導的程序性死亡方式。隨著研究的進一步深人，Cho等[4發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡的一些相關蛋白，如受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）。2O12年，Sun等[5」發(fā)現(xiàn)RIPK3可對混合譜系激酶結構域樣蛋白（MLKL）進行磷酸化和激活，生成p-MLKL，并最終執(zhí)行細胞壞死性凋亡，p-MLKL也成為現(xiàn)今壞死性凋亡的檢測標志物之一。

至此，壞死性凋亡通路的基礎已經(jīng)建立，此后的研究均基于此通路的理論與假說。壞死性凋亡已成為當下研究前沿與熱點，其機制亟待進一步探索。

2 壞死性調(diào)亡的發(fā)生機制

目前，對壞死性凋亡研究主要集中于探討TNF- ?α 受體系統(tǒng)的作用和機制。 TNF-α 是一種多效性分子，能夠激發(fā)基于順序但相互排斥的細胞死亡復合物組裝的存活、凋亡或壞死性凋亡反應。凋亡依賴于半胱天冬酶（caspase）的激活，當抑制caspase-8的活性表達以后， TNF-α 與腫瘤壞死因子受體1（TNFR-1）相結合，RIPK1募集并RIPK3 磷酸化，形成一種壞死體的復合物[4，6]。壞死體復合物包含具有死亡結構域的RIPK1、RIPK3和Fas 相關蛋白，蛋白使細胞能夠通過RIPK3直接磷酸化MLKL，從而發(fā)生壞死性凋亡[5，-8]。

活性氧（ROS）在RIPK1依賴的壞死性凋亡中起關鍵作用，盡管其具體機制尚未完全明了[9-11]。最新研究表明，由TNF或某些化療藥物引發(fā)的ROS水平上升形成了一個正反饋機制，具體來說，ROS 促進了RIPK1在 Ser161位點的自磷酸化，促進了RIPK1的寡聚化，以及RIPK1與RIPK3之間的相互作用[12]。這表明，ROS在壞死體的形成中通過RIPK1的正反饋機制發(fā)揮作用。然而，值得注意的是，在壞死性凋亡過程中，ROS 的產(chǎn)生也發(fā)生在RIPK1的信號通路下游[9]。因此，深人研究ROS與 RIPK1在壞死性凋亡過程中的相互作用及其調(diào)控機制，對于理解這一生物學過程至關重要。除了 TNF-α 受體系統(tǒng)外，其他細胞受體的激活也能觸發(fā)壞死性凋亡，如死亡受體（Fas/FasL）、Toll樣受體3（TLR3）、TLR4，以及胞質(zhì)核酸傳感器（RIG-I和 STING），這些受體的激活可以誘導型干擾素（IFN-I）和 的產(chǎn)生，進而促進自分泌反饋回路，增強壞死性凋亡的效應。

目前尚不完全清楚壞死性凋亡通路中的下游介質(zhì)，但推測質(zhì)膜通道參與了壞死性凋亡細胞的快速腫脹，從而導致細胞膜破裂。RIPK3可以通過存在于RIPK1和RIPK3中的RIP同型相互作用基序（RHIM）與其他蛋白相互作用。迄今為止，已鑒定出4種含RHIM的蛋白，包括RIPK1、RIPK3、DNA依賴性激活劑（DAI）和含 TIR 結構域的銜接子誘導干擾素-β（TRIF）。TRIF 能夠在連接 TLR3 和TLR4 后觸發(fā)壞死性凋亡[13]，DAI將病毒信號整合到壞死性凋亡通路中[1]。

免疫系統(tǒng)已經(jīng)進化出一種方法繞過 RIPK3上游的抑制，能夠快速阻止病毒的傳播[15-20]。DAI通過RHIM 結構域直接與RIPK3 結合，幾乎繞過了RIPK1[16.21]。當RIPK3或 MLKL 缺失時，能夠彌補小鼠因 RIPK1缺失引發(fā)的缺陷，RIPK1非依賴性壞死性凋亡得到進一步的證明[17]。最新研究表明，一定閾濃度的DAI是執(zhí)行促生存功能必需的[22]，根據(jù)具體情況，DAI可作為壞死性凋亡的激活劑或抑制劑[23]，但如何調(diào)節(jié)DAI相反功能還有待闡明。值得注意的是，DAI并不是唯一一種在缺乏RIPK1 時能夠激活 RIPK3的含有RHIM 結構域的蛋白。在沒有 RIPK1的情況下，TRIF 會與 RIPK3 相互作用并直接激活 RIPK1^[24-25] 。RHIM結構域蛋白觸發(fā)RIPK3的具體機制依賴于細胞的具體環(huán)境和初始的激活途徑，而要徹底理解這一現(xiàn)象，需要對導致壞死性凋亡的調(diào)控機制進行更深入的研究。

3 壞死性凋亡與病毒性疾病

盡管壞死性凋亡的分子機制已逐步清晰，其在病毒感染中的雙重作用（宿主防御與免疫病理損傷）仍是當前研究的焦點，壞死性凋亡已被認為是對抗許多病毒的重要反應。病毒感染會激活宿主中依賴RHIM的壞死性凋亡，從而導致抗病毒炎癥。同時，病毒通過編碼具有競爭性RHIM結合能力的抑制劑，調(diào)節(jié)壞死性凋亡途徑。不同病毒干擾壞死性凋亡的靶點和機制，如表1所示。表1中：牛痘病毒、痘苗病毒、鼠巨細胞病毒、單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2為DNA病毒;甲型流感病毒、寨卡病毒、仙臺病毒、柯薩奇病毒A6型、柯薩奇病毒B3型、呼腸孤病毒、新型冠狀病毒為RNA病毒。

3.1DNA病毒與壞死性凋亡

3.1.1痘病毒 多種痘病毒能夠編碼 caspase-1和 caspase-8 的抑制劑，其中，對 caspase-8 的抑制可能會為壞死性凋亡提供自然啟動信號[25]。

牛痘病毒（CPXV）通過表達細胞因子反應調(diào)節(jié)因子A（CrmA），從而抑制半胱天冬酶FLICE，進而阻斷由各種刺激引發(fā)的程序性細胞死亡[26]。

痘苗病毒（VACV）是天花疫苗的活性成分，具有高度免疫原性，但會引起相對良性的疾病。VACV具備雙重機制，能夠阻斷壞死性凋亡的啟動。VACV可以編碼CrmA樣直系同源物B13R（又名 Spi2）以抑制caspase-8，從而阻止感染細胞。壞死性凋亡[27-28]還可以編碼含 Z_α 的蛋白 E3L、E3L與 DAI競爭結合配體，抑制 DAI的激活，進而阻止壞死性凋亡[29]。缺乏RIPK1或RIPK3的小鼠無法控制VACV 復制，甚至有病毒誘導的組織嚴重壞死和炎癥反應發(fā)生，表明壞死性凋亡在小鼠抵抗VACV 感染過程中的重要作用。E3L 病毒蛋白是目前已知的唯一一種不具有RHIM 結構域卻能夠抑制細胞壞死性凋亡的蛋白，這一點揭示了病毒可能采用了多種機制來實現(xiàn)免疫逃逸。

3.1.2皰疹病毒RHIM突變的M45小鼠巨細胞病毒（MCMV-M45mutRHIM）感染成纖維細胞后，DAI通過其RHIM結構域與RIPK3發(fā)生同型互作，進而誘導程序性壞死[16]。為了逃避壞死性凋亡介導的病毒復制抑制作用，鼠巨細胞病毒（MCMV）表達一種含有RHIM的蛋白，稱為RIP 激活病毒抑制劑（vIRA），作為壞死性凋亡抑制劑抵消DAI和RIPK3之間的相互作用[30]。除 MCMV以外，另外一種皰疹病毒，單純皰疹病毒1（HSV-1）也已被證明可以被 DAI感知。與 MCMV 類似，HSV-1也可抑制DAI引發(fā)的壞死性凋亡，HSV-1編碼含 RHIM 的蛋白 ICP6，在人類細胞中，ICP 是一種 RHIM 信號抑制因子，可阻斷 TNF誘導的壞死性凋亡[31]。但在小鼠細胞中，HSV-1誘導的細胞死亡分為ICP6 依賴性與非依賴性兩種方式，其中，ICP6 非依賴性細胞死亡與DAI密切相關[32]，RHIM介導 ICP6 和RIPK3之間的相互作用驅(qū)動壞死性凋亡[33]。

Liu 等[25]發(fā)現(xiàn)部分正痘病毒中存在一種病毒抑制劑 RIPK3 降解的病毒誘導劑（vIRD），vIRD 能夠觸發(fā)泛素化和蛋白酶體介導的RIPK3 降解，并抑制壞死性凋亡。雖然 MCMV、HSV-1和 HSV-2 等皰疹病毒都可以編碼阻斷caspase 依賴性細胞凋亡和RIP 激酶介導的壞死性凋亡的抑制劑，但其具體編碼蛋白有所不同。MCMV通過激活 vIRA，干擾RIPK3磷酸化，以防止壞死性凋亡[16]；HSV-1 和HSV-2 通過核糖核苷酸還原酶的大亞基、HSV-1編碼的ICP6 蛋白和 HSV-2 編碼的ICP1O 蛋白抑制壞死性調(diào)亡[34]。

3.2 RNA病毒與壞死性凋亡

甲型流感病毒（IAV）產(chǎn)生的Z-RNA作為配體在感染IAV的細胞中激活DAI，激活RIPK3后，誘發(fā)細胞發(fā)生壞死性凋亡[35]。除IAV外，正粘病毒、柯薩奇病毒 A6型（CVA6）、寨卡病毒（ZIKV）和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）也通過 RIPK3 誘導細胞發(fā)生壞死性凋亡[35]。ZIKV 是一種蚊媒黃病毒，可感染人類并引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明，人類星形膠質(zhì)細胞易受寨卡病毒感染，且在感染后不發(fā)生細胞凋亡，而是發(fā)生不依賴于 RIPK1的壞死性調(diào)亡[36]。

敲除RNA感應分子RIG-I或RIP1去泛素蛋白（CYLD）可阻斷仙臺病毒（SeV）誘導的壞死性凋亡，這說明 SeV誘導的壞死性凋亡需要RIG-I激活，以及病毒編碼蛋白Y1Y2的存在，Y1/Y2蛋白通過下調(diào)cIAP1表達促進壞死性凋亡[37-38]。研究證明，CVA6 通過自身表達的3D蛋白上調(diào)壞死性凋亡信號分子 RIPK3 的表達，誘導細胞壞死性凋亡[39]。壞死性凋亡在柯薩奇病毒 B3 型（CVB3）引起的病毒性心肌炎（VMC）中起重要作用，并且是急性VMC 細胞死亡的重要途徑。RIP1/RIP3在急性 VMC小鼠模型的心肌細胞中高表達，壞死性凋亡通路特異性阻滯劑Nec-1通過下調(diào)RIP1/RIP3的表達顯著降低心肌損傷。現(xiàn)有研究表明，CVB3同時也存在抑制壞死性凋亡的機制，在感染CVB3的極化上皮細胞中，RIPK3 因被病毒蛋白酶切割而失去壞死性凋亡誘導功能[40]。與CVB3 類似，SARS-CoV-2 與呼腸孤病毒（Reovirus）也可同時誘導和抑制壞死性凋亡。呼腸孤病毒通過激活IFN1信號轉(zhuǎn)導及新合成病毒dsRNA來誘導壞死性凋亡[41]。由于病毒外衣殼蛋白 μ1 的敲除會增加壞死性凋亡[42]，因此，呼腸孤病毒外衣殼蛋白 μ1 通過限制RNA合成負調(diào)控呼腸孤病毒誘導的壞死性凋亡[43]。

SARS-CoV-2引起的COVID-19疫情全球大流行，揭示了RNA 病毒感染與壞死性凋亡之間的復雜關系。COVID-19 作為由 SARS-CoV-2 引起的RNA病毒感染性疾病，其病理機制與壞死性凋亡的關聯(lián)已成為研究熱點。研究表明，SARS-CoV-2感染可通過多種途徑激活宿主細胞的壞死性凋亡通路。病毒 RNA 通過激活宿主蛋白 ZBP1，誘導RIPK1-RIPK3-MLKL 級聯(lián)反應，導致肺泡上皮細胞死亡[44];同時，SARS-CoV-2的RNA依賴性RNA聚合酶 NSPl2直接促進RIPK1磷酸化，其323L 突變顯著增強該效應[45]。此外，病毒通過干擾線粒體基因表達引發(fā)腺苷三磷酸（ATP）耗竭，進一步觸發(fā)壞死性凋亡并釋放促炎因子，加劇器官衰竭[46-47]。

壞死性凋亡與細胞焦亡在COVID-19 中具有協(xié)同作用。病毒核酸通過 TLR3/7/8等模式識別受體激活 ZBP1依賴的泛凋亡，同時，誘導gasderminD介導的膜孔形成和MLKL磷酸化，形成雙重細胞死亡模式[48-49]。研究對比發(fā)現(xiàn)，Delta 變異株比Omicron 更易引發(fā)壞死性凋亡與焦亡的協(xié)同效應，導致更高的炎癥反應和小鼠死亡率[50-51]。單細胞轉(zhuǎn)錄組學分析進一步顯示，COVID-19 重癥患者的支氣管肺泡灌洗液中的壞死性凋亡相關基因顯著上調(diào)，且促炎單核細胞是壞死性凋亡的主要發(fā)生場所[52]。

壞死性凋亡的核心分子機制涉及RIPK1-RIPK3-MLKL 級聯(lián)反應的激活。Liang 等[44]發(fā)現(xiàn)，RIPKl 感染 SARS-CoV-2后，在 Serl66位點的磷酸化促使RIPK3形成壞死復合物，最終導致 MLKL的 ser358 磷酸化及細胞膜破裂。臨床數(shù)據(jù)表明，COVID-19患者血清中磷酸化MLKL水平與疾病嚴重程度呈正相關，提示其作為預后標志物的潛力[51]。在治療策略上，靶向壞死性凋亡的關鍵分子已取得顯著進展：RIPK1抑制劑Nec-1s在小鼠模型中可減輕肺損傷和全身炎癥，并抑制病毒載量[44];地塞米松通過抑制RIPK1磷酸化調(diào)控壞死性凋亡，降低白細胞介素-6（IL-6）等促炎因子釋放[52]；而核苷酸結合寡聚化結構域樣受體含pyrin 結構域蛋白3（NLRP3）炎性小體抑制劑與RIPK1抑制劑的聯(lián)用可協(xié)同緩解肺纖維化患者的炎癥反應[49]。

4結束語

壞死性凋亡作為宿主抗病毒防御的關鍵機制，通過RIPK1-RIPK3-MLKL級聯(lián)反應介導的細胞死亡，有效限制病毒復制并激活免疫應答。然而，過度激活可導致組織損傷和炎癥風暴，形成雙刃劍效應。

在治療潛力方面，靶向壞死性凋亡關鍵分子已在小鼠模型中顯著減輕病毒性肺炎和急性呼吸窘迫綜合征的病理損傷。此外，聯(lián)合療法通過協(xié)同抑制炎癥通路，為COVID-19等重癥感染提供了新思路。值得注意的是，病毒逃逸機制提示未來需開發(fā)針對宿主-病毒互作界面的精準藥物。綜上，壞死性凋亡的調(diào)控平衡是抗病毒治療的核心挑戰(zhàn)，其分子機制的深人解析為開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)療法奠定了理論基礎。

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（責任編輯：陳志賢 英文審校：劉源崗）