人造肉發色劑微膠囊化亞鐵血紅素肽的制備及在3D打印中的應用

Abstract：Plant-basedartificial meat，as anovel meat analogue，has been widelyadopted inindustrial food production.However，due tothe absenceofanimal-derived heme，itfailstoreplicate thecharacteristiccolorofreal meat，making colorsimulationasignificantchallngeinthedevelopmentofartificialmeattechnologies.Toachieveplant-basedartificial meat with colorand texturecomparable toanimal meat，this studyfocusedonthechromogenic mechanismof heme proteins. We optimized the enzymatic hydrolysis method for extracting ferrous heme peptides，prepared structurallstable and colorefective microencapsulated ferrous hemepeptides，nd incorporated themasacoloring agent intoplant protein-based materials.Byapplying3Dprinting technology，weimprovedthetextureand mouthfeloftheartficial meat，achievingsatisfacto

收稿日期：2024-04-10

基金項目：國家重點研發計劃項目（2022YFD2100505）；現代農業（克氏原螯蝦）產業技術體系質量安全與加工創新團隊項目[（JATS（2023）402]；省自然科學基金面上項目（BK20211141）

作者簡介：夏春月（1997-），女，山東莘縣人，碩士，研究方向為生物與醫藥。（E-mail）1571829917@qq.com

通訊作者：吳本剛，（E-mail）wubg@ujs.edu.cn;孫沖，（E-mail）sun-chong0106@163.com

rymeat-like coloration.The findings of this study provide novel insights for developing safeand efficient colorants for artificial meat，whilesimultaneouslyachievinghigh-value utilizationofchickenblood.

Keywords： artificial meat colorant；ferrous heme peptide；microencapsulation；3D printing technology

肉類含有優質蛋白質和各種微量營養素（如鐵、鋅、煙酸、維生素 B₆ 等），是人類飲食中不可或缺的一部分[1]。中國統計年鑒2023年的數據顯示，自“十四五”規劃實施以來，中國牛肉、羊肉和豬肉的產量呈上升趨勢，2022年肉類產量約為 9.3×10⁷1 ，同比增加約 3.76%^[2] 。近年來，中國肉類產品供需缺口逐漸增大[3-5]，以畜牧養殖業和傳統肉類生產方法為基礎的傳統畜牧業將面臨巨大挑戰。開發綠色環?？沙掷m的肉類替代品，滿足日益增長的肉類需求已經成為全社會關注的熱點之一。人造肉由于在安全、營養、健康、環保等方面較傳統養殖類動物肉具有顯著優勢[6]，作為肉類替代品，有望緩解養殖業造成的環境污染、食品安全和公共衛生問題[7-8]

目前，人造肉制品主要有兩種生產途徑：一是動物干細胞體外增殖分化生產的細胞培養肉，由動物體分離得到全能干細胞或成肌細胞[8]，通過細胞黏附可食用性支架（微纖維明膠、膠原蛋白、酵母蛋白支架等）培養增殖得到肌肉纖維束[9]，再經過對肌肉纖維束定型、修飾和烹飪加工，得到細胞培養肉制品；二是以植物蛋白質為基礎的人造肉制品，常以大豆蛋白質、豌豆蛋白質、花生蛋白質或小麥蛋白質等植物基蛋白質為原料[1]，加入淀粉、纖維素、油脂等混合[]，調配成肉類口感和風味后壓制成型，并經過熟制加工而成[9，12]。由于細胞培養肉成本較高，大規模生產存在諸多挑戰[9]。而植物基人造肉則具有成本低、工藝簡單等優勢，同時植物基人造肉可以減少飽和脂肪酸和膽固醇的攝入，避免因脂肪攝入過多而導致健康問題[13]，是人造肉領域關注的重點，已逐步開始商業化生產。

由于植物基人造肉與動物肉的顏色差距較大，發色劑的添加尤為重要[14]。相比人工合成著色劑（如胭脂紅、辣椒紅等），天然提取物尤其是富含血紅素的血紅素蛋白，在人造肉發色應用中引起廣泛關注[15-16]。然而，血紅素蛋白穩定性較差[17]，在加工、貯藏過程中易受溫度、 ??pH 、離子強度、酶等因素影響，導致血紅素蛋白構象發生改變，血紅素輔基暴露甚至脫落[18]。因此，肉色模擬是人造肉技術的一個難點。此外，由于植物蛋白質與動物肌肉纖維蛋白質形成的三維網狀結構不同[13，19]，使得其在口感和風味上與傳統肉類仍有較大差距[20]。如何模擬肉類纖維結構是植物基人造肉另一個難點[5，21]。3D打印技術通過螺旋柱塞擠壓形成細絲纖維[22]，逐層堆積成完整的3D打印圖案和結構，具有模擬肉類質地結構的優勢[7，23]。因此，本研究從血紅素蛋白發色機制出發，以雞血為原料制備了結構穩定、色澤良好的微膠囊化亞鐵血紅素肽，并作為人造肉發色劑添加進植物蛋白質基礎材料中，利用3D打印技術開發出色澤穩定、適口性好、滋味與雞胸肉糜相似的植物基人造肉，實現副產物雞血等的高價值利用，同時獲得滿意的肉色效果（圖1）。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設備

三黃雞由立華牧業股份有限公司提供；堿性蛋白酶（ 200 000U/g ）、中性蛋白酶（100000U/g^? ）、木瓜蛋白酶（ 800 000U/g ）購自上海源葉生物科技有限公司。食品級豌豆蛋白粉購自臨邑禹王植物蛋白有限公司；食品級谷朊粉購自山東谷碩生物科技有限公司。檸檬酸三鈉、檸檬酸、異抗壞血酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、氯化鈉購自西隴化工股份有限公司；阿拉伯膠 ??β -環糊精、Fe²⁺ 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

FE-28pH 計（瑞士METTLERTOLEDO公司產品），Ultra-turaxT-25數顯勻漿機（德國IKA公司產品），Stratos臺式高速離心機（德國Heraeus公司產品），DK-S22恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司產品），WSC-S色差儀（上海精密科學儀器有限公司產品），FOODBOT-D1食品3D打印機（杭州時印科技有限公司產品），TMS-TOUCH質構儀（美國FTC公司產品），一體式超聲波細胞破壁儀（上海微彌超聲波有限公司產品），ECLIPSEE2OO顯微鏡（日本Nikon公司產品），Gen5酶標儀（美國Bio-Tek有限公司產品），AA-7000原子吸收分光光度計（日本島津公司產品），EVO-LS10掃描電子顯微鏡（德國CarlZeiss有限公司產品），PEN3電子鼻（德國AIRSENSE公司產品），SA402B電子舌（日本IN-SENT公司產品），NicoletiS50傅里葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司產品），TG/DTA7200熱重分析儀（日本HITACHI公司產品）。

1.2 試驗方法

1.2.1亞鐵血紅素肽酶解及純化工藝雞血細胞收集與破壁：選取成年三黃雞現場宰殺，收集新鮮抗凝雞血，經紗布過濾除雜后離心，取沉淀并加入2倍體積生理鹽水洗滌，離心2＼～3次，收集沉淀血細胞，離心條件： 離心 10min 。離心后采用凍融法對血細胞破壁處理。

亞鐵血紅素肽酶解工藝：分別稱取 10g 凍融破壁血細胞，選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，按酶活力計算，添加相應量的蛋白酶制劑，使得每 血細胞中酶活力為10000U，在各酶最適 pH 和溫度下進行酶解[20.24]：木瓜蛋白酶pH為7，溫度

55^°C ；中性蛋白酶 pH 為7.5，溫度 45^°C ；堿性蛋白酶 ΔpH 為8.5，溫度 。酶解后于冰浴下靜置20min后離心，初步去除相對分子量較大的蛋白質（避免超濾膜堵塞、破裂）。取上清液用相對分子量10000蛋白質能通過的超濾管在 下離心提純，收集濾液經冷凍干燥后備用。

1.2.2微膠囊化亞鐵血紅素肽制備工藝取一定量 β -環糊精溶于 30mL 水中，再加入 300mg 亞鐵血紅素肽粉末，作為微膠囊芯材料，于 40% 下水浴吸附 ^1h 后，取一定濃度的阿拉伯膠溶液，按不同芯壁比加入芯材料溶液中，240W超聲乳化 15min ，冷凍干燥后備用。

1.2.3微膠囊化亞鐵血紅素肽發色劑在3D打印中的應用將豌豆蛋白粉（ 10g?Σ 和不同質量（ _0g，0.5 的谷粉攪拌 5min ，少量多次加入微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液混勻， 600r/min 均質 下反應過夜后，進行3D打印。打印參數：噴嘴內徑 0.84mm 、移動速率 30mm/s ，打印模板為直徑 20mm 、高 10mm 的圓柱體。另外，以雞胸肉糜作為3D打印樣品對照處理，將 5g 雞胸肉攪碎制作成直徑約 20mm. 高約 10mm 的樣品，測定其質構、色差和微觀結構。

1.3 工藝優化試驗

1.3.1亞鐵血紅素肽酶解提取工藝

1.3.1.1單因素試驗凍融法：分別取 10g 血細胞置于 -20^°C 環境下冷凍 ，自然解凍后于顯微鏡下對血細胞計數，計算破壁率。血細胞計數參考林曉楠[24]的方法，在顯微鏡下觀察破壁的血細胞數量并計算破壁率，破壁率計算公式如下：

酶的選擇：選用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶3種蛋白酶在最適 pH 、溫度，每 血細胞中酶活力為 10000U 條件下，水浴酶解 6h ，冰浴后5000r/min 離心 10min ，測定水解度和 Fe²⁺ 含量。

料液比優化：選用堿性蛋白酶，取料液比（血細胞：水，質量比）為 1：2，1：4，1：6，1：8，1：10 1：12 ，在最適 ΔpH 和溫度下水浴酶解 ⁶h ，冰浴后5000r/min 離心 10min ，測定水解度和 Fe²⁺ 含量。

酶解時間優化：選用堿性蛋白酶，料液比（血細胞：水，質量比） 1：10 ，在最適 ΔpH 和溫度下分別酶解 2h.4h.6h.8h.10h 冰浴后于 5000r/min 離心

10min ，測定水解度和 Fe²⁺ 含量。

離心速率優化：采用堿性蛋白酶，料液比（血細胞：水，質量比） 1：10 ，酶解 6h ，冰浴后分別以4000r/min.5000r/min.6000r/min.7000r/min 、8000r/min.9000r/min 離心 10min ，測定水解度和Fe²⁺ 含量。 Fe²⁺ 含量采用 Fe²⁺ 試劑盒測定，水解度的測定根據秦春青[25]所用方法，水解度計算公式如下：

式中， DH 為水解度， T_v 表示血紅蛋白溶液中總氮含量，按照國標 GB5009.5-2016 測定 _，AN 表示酶解液中氨基態氮含量，采用甲醛電位滴定法測定。

1.3.1.2正交試驗在酶解制備亞鐵血紅素肽單因素試驗的基礎上，以酶種類、料液比和酶解時間為考察因素， Fe²⁺ 含量為指標，設計正交試驗，確定亞鐵血紅素肽最優提取參數。正交試驗設計因素和水平見表1。

1.3.2微膠囊化亞鐵血紅素肽制備工藝

1.3.2.1單因素試驗 β -環糊精添加量：分別取0.5g_s1.0g_s1.5g_s2.0g_s2.5gβ -環糊精于 40% 水浴吸附亞鐵血紅素肽，在阿拉伯膠含量 6% ，芯壁比 1：1 條件下，2 4 0 ～ ＼mathrm { ＼textW }$ 超聲乳化 10min ，測定包埋率。

阿拉伯膠含量：分別取 2%4%6%8%10% 阿拉伯膠溶液，按芯壁比 1：1 （體積比）加入芯材料（ -環糊精， 亞鐵血紅素肽）溶液中，240W超聲乳化 10min ，測定包埋率。

芯壁比：取 1.0：0.4，1.0：0.6，1.0：0.8，1.0： 1.0，1.0：1.2 （體積比）芯壁比，將 6% 阿拉伯膠溶液加入芯材料（ -環糊精， 300mg 亞鐵血紅素肽）溶液中，240W超聲乳化 10min ，測定包埋率。

其中，包埋率測定參考林曉楠[24]的方法，并稍作修改，其計算公式如下：

未包埋亞鐵血紅素含量包埋率= ?×100% 包埋亞鐵血紅素含量

式中，未包埋亞鐵血紅素含量的測定：稱取50.0mg 的亞鐵血紅素肽微膠囊，加入 5mL 酸性甲基異丁基酮（ pH 為2.0），渦旋 1min ，棄去上層有機試劑，下層溶液定容至 10mL ，于 50^cC 條件下水浴8min ，測定未包埋亞鐵血紅素含量。包埋亞鐵血紅素含量的測定：稱取 50.0mg 的亞鐵血紅素肽微膠囊，加入適量蒸餾水充分溶解，渦旋 1min ，定容至10 水浴 8min 。參照測定包埋亞鐵血紅素含量。

1.3.2.2正交試驗根據微膠囊化亞鐵血紅素肽制備單因素試驗結果，以 β -環糊精添加量、阿拉伯膠含量和芯壁比為考察因素，以包埋率為指標設計正交試驗（表2）。

1.3.33D 打印人造肉工藝谷胱粉添加量：取 0g 、0.5g.1. 0g.1.5g.2. 0g 谷粉與 10g 豌豆蛋白混勻，加人 65% 超純水 （ 22mL ）， 600r/min 轉速下均質， 4^°C 冰箱中反應過夜后打印，打印溫度 25^°C ，以變形率為指標，確定谷骯粉最優添加量。

變形率根據 Kim 等[26]的方法，測定計算公式如下：

變形率

式中 H₀ 表示設計對象高度（ cm ） H₁ 表示實際打印高度 （cm） 。

微膠囊化亞鐵血紅素肽添加量：取 10g 豌豆蛋白和 谷骯粉，分別添加 8.8mL，13.2mL，17.6 mL，22.0mL 微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液，再分別加入 13.2mL，8.8mL，4.4mL，0mL 超純水，使水分含量不低于 65% 600r/min 下均質， 冰箱中反應過夜后打印，3D打印溫度 25^°C 。以雞胸肉肉糜為對照，以色差為考察指標，確定微膠囊化亞鐵血紅素肽的最優添加量。

3D打印溫度：取 10g 豌豆蛋白和 _lg 谷骯粉，加入 22mL 微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液混勻，600r/min 轉速下均質，于 4^°C 冰箱中反應過夜。分別采取 25^°C，35^°C，45^°C，55^°C 打印溫度，以變形率為指標，肉糜色差為參照，確定最佳打印溫度。

1.4 指標測定及性能分析

1.4.1 亞鐵血紅素肽性能

1.4.1.1短肽含量測定參考唐開永等[27]雙縮脲法稍作修改。取 0mL.0.2mL.0.4mL.0.6mL 、0.8mL 、 1.0mL 牛血清白蛋白溶液（BSA，10mg/mL ）置于6支試管中，分別加入 1.0mL，0.8 mL，0.6mL，0.4mL，0.2mL，0mL 超純水，再滴加4mL 雙縮脲試劑，搖勻后 37^°C 水浴 30min ，以1號管為調零管，測定 540nm 的吸光值并獲得標準曲線 。樣品測定：取5mL 超濾后的樣品溶液，加 5mL 15% 三氯乙酸（W/V），混勻后靜置 20min ，于 3000r/min 離心10min ，并將濾液定容至 25mL ，取 1mL 上述溶液，加人 4mL 雙縮脲試劑，搖勻后 37^°C 水浴 30min ，以5mL 超純水加 5mL15% 三氯乙酸（W/V）為空白，測定 540nm 處吸光值，按公式（5）計算短肽質量濃度。

式中 X 表示短肽質量濃度（ mg/mL ）； C 表示標準曲線測得蛋白質含量（ mg/mL ）；25表示樣品溶液稀釋體積（mL）;1.0表示樣品稀釋液用量 （mL ）；5.0表示樣品稀釋的體積倍數。

1.4.1.2亞鐵血紅素含量測定參照林曉楠[24]氫氧化鈉-吡啶顯色法略有修改。通過 5% （體積分數）氨水配制不同質量濃度 μg/mL.8μg/mL.10μg/mL. 氯化血紅素標準液。取1mL 標準液，加人2mL吡啶-NaOH（V33%吡啶：V_0.1molLNaOH=1：1 ） 3mg 亞硫酸鈉，靜置 30min 后測定 A₅₅₇ 吸光度值，獲得標準曲線： Y=17.540 0x- 。樣品的測定： 1mL 樣品溶液加入 2mL 吡啶-氫氧化鈉溶液后，再加入 3mg 亞硫酸鈉，靜置 30min 后測定 A₅₅₇ 吸光度值，計算亞鐵血紅素含量。

1.4.1.3總鐵、 Fe²⁺ 含量測定 Fe²⁺ 含量測定同方法1.3.1.1，標準曲線為： Y=0.008 2x-0.009 4 ， R²= 0.9990，總鐵含量的測定采用原子吸收光譜法，并測得標準曲線為 樣品溶液參照GB5009.90-2016《食品中鐵的測定》對過濾膜后的酶解液進行消解，原子吸收光譜參數為：燈電流 12mA ，空氣-乙炔 2.2L/min ，氬氣流量15L/min ，波長 248.3nm ，狹縫 0.2nm 。

1.4.2微膠囊化亞鐵血紅素肽性能研究

1.4.2.1微觀結構分析微膠囊化亞鐵血紅素肽冷凍干燥后，使用導電膠粘取少量樣品粉末并固定于載物臺，于真空室中噴金，電壓 10kV ，放大倍數10 000倍。

1.4.2.2傅里葉變換紅外光譜分析通過傅里葉變換紅外光譜儀分析亞鐵血紅素肽和微膠囊化亞鐵血紅素肽的結構組成，掃描范圍為 500～4000cm^-1 。

1.4.2.3穩定性分析首先，采用熱重分析儀對微膠囊化亞鐵血紅素肽的熱穩定性進行分析。稱?。?10±0.1? ？ mg 的微膠囊化亞鐵血紅素肽放入坩堝中， N₂ 流速為 50mL/min ，熱重分析儀的測試溫度為35-800^°C ，加熱速率 。其次，將微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液于室溫下暴露于自然光下貯藏15d，通過紫外-可見光光譜監測微膠囊化亞鐵血紅素肽，紫外-可見光譜掃描范圍為 200～800nm 。另外，對比研究牛血紅蛋白、甜菜紅、亞鐵血紅素肽和微膠囊化亞鐵血紅素肽在紫外光照射下的穩定性。配置上述溶液（質量濃度為 0.5mg/mL ）置于紫外光下照射 0～5h ，記錄紫外-可見光譜。

1.4.2.4生物相容性分析通過人MCF-7細胞的細胞成像試驗結果來評估微膠囊化亞鐵血紅素肽的生物相容性[28]。在含 15% 胎牛血清的RPMI1640培養基中，將MCF-7細胞接種在 35mm 共聚焦培養皿中，置于 CO₂ 恒溫培養箱 ）培養24h。棄去培養基并用PBS洗滌細胞后，將 1mL 微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液（ 50mg/mL ）與新鮮培養基按體積比 1：1 混合，并與MCF-7細胞孵育 10min 和 30min 。隨后，用PBS洗滌3次去除過量的微膠囊化亞鐵血紅素肽，采用LiveDye/NucleiDye熒光染料染色，并用倒置熒光顯微鏡觀察MCF-1細胞熒光圖像。

1.4.33D打印人造肉性能

1.4.3.1表觀性質分析通過質構儀進行質地剖面分析（TPA），比較3D打印人造肉樣本和雞胸肉肉糜的硬度、黏附性、彈性、內聚性和咀嚼性[11]。采用兩次壓縮循環測試打印對象，測試參數設置如下：探頭直徑 30mm ，測試速度為 1mm/s ，觸發力為 5N 壓縮量為原始高度的 50% ，2次按壓時間間隔為1so

1.4.3.2色差分析采用色差儀記錄人造肉和雞胸肉肉糜樣品的亮度 ）、紅綠值（ ?a^? ）、黃藍值（ b^* ）和色差值 （ΔE） 。

1.4.3.3氣味測定將 物料置于小燒杯中封口，室溫下平衡 30min ，采用德國AIRSENSEPEN3電子鼻，將頂空中的氣味成分傳入傳感器陣列室中解析 60s ，空氣流速為 0.6L/min ，對比分析添加亞鐵血紅素肽前后人造肉樣本和雞胸肉肉糜的氣味，每個樣品重復3次。

1.4.3.4滋味測定取 25g 樣品與 100mL 超純水混勻后， 3000g 離心 10min ，取上清液過濾，采用日本INSENT電子舌對比檢測添加亞鐵血紅素肽前后人造肉樣本和雞胸肉肉糜的滋味。參比溶液為30mmol/LKCl和 0.3mmol/L 酒石酸溶液，選用ETS程序進行檢測。

1.4.3.5微觀結構表征將3D打印人造肉樣品、雞胸肉和雞胸肉肉糜置于冰箱（ -40^°C ）預凍 ^12h 后，再放入真空冷凍干燥機中干燥 24h ，將其固定在樣品臺真空室中噴金，電壓 10kV ，采用SEM放大100倍觀察樣品微觀結構。

1.5 數據處理與分析

單因素試驗采用OriginPro進行分析作圖，顯著性分析采用SPSS軟件處理，正交試驗數據采用Excel軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 工藝優化

2.1.1亞鐵血紅素肽酶解工藝

2.1.1.1單因素試驗結果凍凍時長的確定：如圖2A所示，雞血細胞于 -20^°C 冷凍 后自然解凍，其血細胞破壁率均達到 90.00% 以上。其中，冷凍 ^4h 破壁率為 90.73%±3. 11% ，冷凍 ^10h 破壁率 94.32%±2.33% 與冷凍 6h 破壁率（ 93.25%± 2.65% ）無顯著性差異（ Pgt;0.05） ，考慮到冷凍效率，故選擇 6h 為最佳冷凍時長。

酶的確定：不同蛋白酶單因素試驗結果如圖2B所示，水解度從高到低分別是：木瓜蛋白酶處理（ 27.74%±0.74% 、堿性蛋白酶處理（ 23.57%± 1.21% ）、中性蛋白酶處理 （20.12%±1.10% 。 Fe²⁺ 含量與水解度趨勢相反，中性蛋白酶處理 Fe²⁺ 含量最高，為（ 30.46±1.20 ） μmol/L ，堿性蛋白酶處理Fe²⁺ 含量次之，為 （24.83±0.90） ） μmol/L ，木瓜蛋白酶處理 Fe²⁺ 含量最低。這是由于中性蛋白酶水解度較低，難以水解血紅蛋白復雜的球形封閉結構[24，29]；雖然木瓜蛋白酶水解度較高，但其 Fe²⁺ 含量較低，因此，選擇堿性蛋白酶進行料液比和酶解時間的單因素試驗。

料液比與酶解時間的確定：堿性蛋白酶的料液比（質量比）試驗結果如圖2C所示，在堿性蛋白酶總添加量100000U，酶解時間6h，料液比從1：2到 1：10 ，隨著水量增加其水解度逐漸上升， Fe²⁺ 含量逐漸下降，在料液比為 1：10 時水解度達到最高值（ 28.11% ）， Fe²⁺ 濃度降到 22.37μmol/L 。這是由于堿性蛋白酶的活性中心三維結構隨著料液比的下降逐漸舒展，可以與底物更好地結合，從而快速酶解血紅蛋白[18]。但是在料液比為 1：12 時水解度出現下降，這是因為加水量過多時，蛋白酶活性中心無法完全被血紅蛋白占據，所以水解速度變慢，水解度降低。水解度的增加意味著更多的血紅蛋白被酶解，亞鐵血紅素肽暴露于水溶液中導致其部分被氧化， Fe²⁺ 含量下降[30]。從圖2D可見，隨著酶解時間的增加水解度不斷提高， Fe²⁺ 含量逐漸降低。酶解 ^10h 時水解度達到最高值（ 25.10% ），此時 Fe²⁺ 濃度為 21.28μmol/L 。同時，隨著酶解時間增加， Fe²⁺ 與空氣接觸時間增加，導致其被氧化，含量下降。

離心速率的確定：離心速率優化結果如圖2E所示，隨著離心速率的提高， Fe²⁺ 濃度逐漸降低，這與林曉楠24的研究結果一致。其中， 4000～7000 r/min 時 Fe²⁺ 濃度無顯著性差異（ Pgt;0.05 ），8 000r/min 時 Fe²⁺ 濃度顯著低于 ，9000r/min 時 Fe²⁺ 濃度顯著低于其他速率。在4 000～9 000r/min 離心速率下，水解度在22. 30% ＼～24.45% 之間；離心速率達 9000r/min 時，水解度最高，同時 Fe²⁺ 濃度達到最低（ 20.34μmol/L ）?？紤]到 4000r/min 時水解度（ 22.30% 與 5000r/min （ 23.56% ）有顯著性差異，故采用5 為亞鐵血紅素肽制備的離心速率。

ΔA ：不同冷凍時間對血細胞破壁率的影響;B：不同蛋白酶對血紅蛋白水解度和 Fe²⁺ 濃度的影響;C：不同料液比處理血紅蛋白水解度和 Fe²⁺ 濃度；D：不同酶解時間血紅蛋白水解度和 Fe²⁺ 濃度;E：不同離心速率下血紅蛋白水解度和 Fe²⁺ 濃度。圖柱上不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（ （Plt;0.05） 。

2.1.1.2正交試驗結果正交試驗結果如表3所示，各因素影響大小順序為水解時間 （Z）gt; 酶種類（X）gt; 料液比（Y），通過極差分析得到酶解條件的最優組合為 Z₃Y₃X₂ 。為進一步驗證酶解方案，對最佳方案 Z₃Y₃X₂ 和次優方案 Z₂Y₃X₂ 進行同法提取驗證，重復3次（表4）。從表4可見，次優方案 Z₂Y₃X₂ 中Fe²⁺ 含量略低于最佳方案 Z₃Y₃X₂ ，因此，選擇 Z₃Υ₃ X₂ 作為最優酶解方案。

2.1.2微膠囊化亞鐵血紅素肽制作工藝如圖3所示，隨著 β -環糊精添加量和芯壁比的增加，亞鐵血紅素肽微膠囊的包埋率逐漸增大，隨著阿拉伯膠含量增加，亞鐵血紅素肽微膠囊的包埋率呈先增加后趨于平穩的態勢。 β -環糊精添加量為 1.0g 時，包埋率顯著高于 0.5g 添加量（ Plt;0.05 ；添加量在 1.5g 以上時， β -環糊精溶解度達到飽和，包埋率趨于平穩，故選取 1.5gβ -環糊精添加量為最佳試驗條件。阿拉伯膠含量從 2% 增加到 6% 時，包埋率顯著升高（ Plt;0.05. ），在含量為 6% 時包埋率 （91.24%±1.35% 達到最高值；阿拉伯膠含量從 6% 增加到 10% 時，包埋率沒有顯著變化，這是因為含量增大，阿拉伯膠分子間相互纏繞，芯材料難以包埋至壁材料分子內，故選取 6% 阿拉伯膠為最佳試驗條件。芯壁比（體積比） 1.0：0.4～1.0： 1.0時，包埋率顯著升高（ Plt;0.05 ），從 54.82%± 1.53% 提升至 88.62%±1.64% ；而芯壁比（體積比）在 1.0：1.0 至 1.0：1.2 范圍時，包埋率無顯著性差異，故選取芯壁比（體積比） 1.0：1.0 為最佳試驗條件。

對微膠囊化亞鐵血紅素肽包埋率進行正交試驗，結果如表5所示。通過正交試驗結果得到因素主次為阿拉伯膠含量 （Y）gt; 芯壁比 （Z）gt;β. -環糊精添加量（X），對最佳方案 Y₂Z₃X₂ 和次優方案 Y₂Z₁X₂ 進行驗證，結果如表6所示，最佳方案 Y₂Z₃X₂ 的平均包埋率（ 94.88% ）高于次優方案 Y₂Z₁X₂（92.33%） ，因此，選擇 Y₂Z₃X₂ 為微膠囊化亞鐵血紅素肽的最優條件，即 β -環糊精添加量為 1.5g 、阿拉伯膠含量6% 、芯壁比 1.0：1.0 （體積比）。

2.2 亞鐵血紅素肽性能指標

對超濾后的亞鐵血紅素肽理化性質進行測定，亞鐵血紅素肽的亞鐵血紅素含量、總鐵含量、 Fe²⁺ 含量、短肽含量結果如表7所示。

2.3微膠囊化亞鐵血紅素肽性能

2.3.1結構由圖4A可見，微膠囊化亞鐵血紅素肽的外觀結構為球形，表面光滑，囊壁結構完整，無裂縫，表明能夠對芯材料起到保護作用。部分小顆粒微膠囊黏附在大顆粒膠囊上，存在附聚現象[25]2.3.2傅里葉變換紅外光譜傅里葉變換紅外光譜儀可鑒定未知物的官能團，測定化學結構。如圖4B所示， 3300cm^-1 處及1 500～1650cm^-1 處的信號峰為亞鐵血紅素肽的 ΔN-H 鍵的拉伸和振動。3070cm^-1 處為不飽和烷基中C-H鍵的拉伸信號峰，1500cm^-1 和 1000～1200cm^-1 對應于亞鐵血紅素肽C-O和 C=0 鍵[31]。相比于亞鐵血紅素肽，微膠囊化亞鐵血紅素肽的3 000cm^-1 處的信號峰消失，這是不飽和烷基C-H鍵斷裂所致[32]；此外， C=0 信號峰紅移，這可能是亞鐵血紅素肽和芯壁材料形成氫鍵造成其 C=0 信號峰向低波數移動[25]。這些結果表明微膠囊化亞鐵血紅素肽的成功制備。

2.3.3發色劑穩定性發色劑穩定性的評價在實際應用中尤為重要，熱穩定性和光穩定性是衡量其能否實際應用的重要因素[3-34]。如圖4C所示，微膠囊化亞鐵血紅素肽存在兩個熱分解階段。第一階段，微膠囊化亞鐵血紅素肽在 30.0～101.9^°C 的范圍內出現 5.72% 左右的重量損失，這是由于其水分揮發引起的；第二階段，在 約有71.17% 的重量損失，這主要是由于微膠囊化亞鐵血紅素肽發生了脫水、斷裂和分解反應，導致其重量損失。由圖4D可以看出，微膠囊化亞鐵血紅素肽最大熱失重溫度為 318.2^qC ，這表明其具有較高的熱力學穩定性[28]。此外，微膠囊化亞鐵血紅素肽在室溫條件下、自然光照射下貯存 15d 的穩定性通過紫外-可見光譜進行了評估，結果如圖4E顯示，微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液的兩個紫外吸收峰（ 280nm 和327nm ）幾乎未發生變化，吸光度變化小于0.1，表明其在貯存期間保持了較好的穩定性。 280nm 的吸收峰與亞鐵血紅素肽中的芳香族氨基酸殘基（如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）相關，反映了肽鏈的結構穩定性； 327nm 的吸收峰與鐵配位中心（ Fe²⁺ ）及其周圍配體之間的電子轉移有關，穩定的吸光度表明鐵離子及其配位環境未發生明顯變化。因此，微膠囊化亞鐵血紅素肽在自然光照和熱條件下均表現出較好的穩定性。

為了研究不同發色劑在植物基人造肉中的穩定性，本研究對比了紫外光照射下，不同發色劑如動物源血紅蛋白（牛血紅蛋白）天然發色劑（甜菜紅）、亞鐵血紅素肽和制備的微膠囊化亞鐵血紅素肽的穩定性。由圖4G、圖4H、圖4I可見，牛血紅蛋白、甜菜紅和未包埋的亞鐵血紅素肽的吸光度隨照射時間的增加而降低，表明這些發色劑的穩定性較差，紫外光對其有較強的降解作用，導致其發色基團分解。圖4J中微膠囊化亞鐵血紅素肽在紫外光照射 5h 內的吸光度變化較小，顯示出一定的穩定性，表明微膠囊化處理有效提高了亞鐵血紅素肽的抗紫外光降解能力。這可能是由于微膠囊外殼的保護作用，減少了紫外光對亞鐵血紅素肽分子的直接損傷。總之，與其他發色劑（牛血紅蛋白、甜菜紅及未包埋的亞鐵血紅素肽）相比，微膠囊化亞鐵血紅素肽在紫外光照射下表現出較好的穩定性，具有更大的應用潛力。

A：掃描電子顯微鏡圖;B：傅里葉紅外光譜圖;C：TG曲線;D：DTG曲線;E：紫外可見光譜圖;F：最大吸光度值變化；G：牛血紅蛋白紫外可見光譜圖；H：甜菜紅紫外可見光譜圖；I：亞鐵血紅素肽紫外可見光譜圖；J：微膠囊化亞鐵血紅素肽紫外可見光譜圖。

2.3.4生物相容性細胞毒性是評價制備材料安全性的重要指標之一，通過MCF-7細胞評估了微膠囊化亞鐵血紅素肽的安全性[28.35]。如圖5所示，高質量濃度的微膠囊溶液（ 50mg/mL ）與MCF-7細胞孵育不同時間后，其細胞活力均可達到 80% 以上，表明所制備的微膠囊化亞鐵血紅素肽具有良好的生物相容性。

2.4微膠囊化亞鐵血紅素肽在3D打印人造肉中的應用效果

2.4.1表觀性能變形率是判斷物料打印性能的指標之一，低變形率表明物料在擠出后可以自行支撐自重[21，26]。3D打印要求物料易于擠出，且擠出后必須能夠支撐自重不塌陷[36]。如圖6A所示，隨著谷骯粉添加量的增加，3D打印人造肉的變形率逐漸增大；在谷骯粉添加量低于 1.0g 時，打印樣品變形率幾乎為0，當添加量為 1.5g 時變形率顯著增高，添加量為 2.0g 時，變形率顯著高于 1.5g ，達到了 8%±0.5% ，這說明過量添加谷航粉容易導致3D打印樣品塌陷。表8質地剖面分析（TPA）結果顯示，隨著谷粉含量的增加，3D打印人造肉的硬度逐漸降低，咀嚼性先增加后降低，彈性和膠黏性逐漸增大。這可能是由于谷骯粉中的醇溶蛋白和麥谷蛋白具有吸水性、持水性和黏彈性，其吸水率約為150%～200% ，谷航粉添加過量會導致打印物料的吸水性增大，導致3D打印樣品的變形率增大，易塌陷[37]。另外，根據表8中的色差分析，不同谷胱粉添加量對樣品色差的影響表明， ?L^*?a^*?b^* 和 ΔE 值與雞肉肉糜的色差差異較大。因此，選擇與雞胸肉肉糜硬度最為接近的谷骯粉添加量 （1.0g） 作為最佳添加量，以獲得最佳的3D打印效果。

A：谷胱粉添加量與人造肉變形率的關系;B;溫度對人造肉變形率的影響。圖柱上不同小寫字母表示不同處理間差異達顯著水平 （Plt;0.05） U

本研究探討了不同添加量的微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液（ 8.8～22.0mL 對3D打印樣品性能的影響。隨著微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液的增加，樣品的硬度呈現先增加后減小的趨勢，而彈性則呈現相反的變化。這可能是由于隨著添加量的增加，微膠囊化亞鐵血紅素肽增強了樣品的交聯結構，使得樣品網絡剛性增加，而使彈性受到一定抑制。但當添加量達到某一閾值（ 17.6mL ）后，分子間的相互作用趨于飽和，導致部分交聯點或分子團塊的形成，從而降低了材料的剛性和硬度，彈性回升。色差分析結果顯示，隨著微膠囊化亞鐵血紅素肽濃度的增加，L^* 值逐漸降低， ΔE 值逐漸增大，表明樣品顏色逐漸變暗，且與未添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的樣品差異增大。 L^* 值的降低可能與微膠囊化亞鐵血紅素肽的深色特性有關，而 ΔE 值增大則反映微膠囊化亞鐵血紅素肽濃度升高時，樣品的顏色差異更為明顯。隨著人造肉3D打印溫度的升高（ ）， L^* 值、 ?a^* 值逐步增大（表8），變形率也逐漸上升（圖6B）。這是由于溫度升高導致豌豆蛋白的疏水基團暴露，增加了疏水性并提高了樣品的含水率，從而導致亮度（ L^* 值）增加。較高的溫度還促進了美拉德反應，進一步加劇了色差的變化，使a^* 值和 b^* 值增大。進一步試驗結果表明，當豌豆蛋白粉與谷粉質量比為 10：1 ，微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液添加量 22.0mL，3D 打印溫度 35^qC 時，人造肉在色差、硬度、彈性等方面取得了較好的平衡，同時提升了樣品的穩定性和感官質量。因此，以上條件被認為是人造肉3D打印最佳條件。

2.4.2滋味、氣味為研究3D打印人造肉的適口性，本研究對比了有無添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的3D打印樣本與雞胸肉肉糜在滋味和氣味方面的相似程度，3D打印條件為：豌豆蛋白粉：谷胱粉（質量比 ）=10：1，3D 打印溫度 ，微膠囊化亞鐵血紅素肽添加量為 0mL 和 22mL 。電子鼻測試結果如圖7A所示，不含微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉與添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉中烷烴類、酮、醇類等物質響應值與雞胸肉肉糜無顯著性差異，氮氧化物、有機硫化物和無機硫化物響應值顯著增大（ （Plt;0.05） 。添加微膠囊化亞鐵血紅素肽后有機硫化物的響應值最高（響應值為4.586），其次是氮氧化物（響應值為4.288）。其中，有機硫化物賦予人造肉芳香氣味[38]，不含微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉和添加微膠囊化亞鐵血紅素的人造肉中有機硫化物響應值相對于雞肉肉糜分別增加了0.86和2.50，可見微膠囊化亞鐵血紅素肽的添加可使人造肉中芳香氣味顯著增強。電子舌測試結果如圖7B所示，5種口味類別中，2種3D打印人造肉的滋味與雞胸肉肉糜幾乎沒有差別，所有傳感器響應值為-30＼～40，其中咸味響應值約為38，其次鮮味響應值約為11.5，酸味響應值約為8.5，苦澀味為負值，說明本研究開發的人造肉能夠較好模擬真實雞胸肉肉糜的滋味。

A：電子鼻雷達圖;B：電子舌柱狀圖。a為不含微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉樣品，b為添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉樣品，c為雞胸肉肉糜樣本。

2.4.3微觀結構由圖8可見，3D打印人造肉形成了致密的交聯結構。相對于未添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉（圖8A），添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉（圖8B）的凝膠網絡結構更致密。雞胸肉肉糜（圖8C）的肌肉纖維狀態相比于雞胸肉（圖8D）較為稀疏。由此可見，添加微膠囊化亞鐵血紅素肽3D打印人造肉致密的層狀結構更能模擬出真實雞胸肉的纖維結構。

A：未添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉;B：添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉;C：雞胸肉肉糜;D：雞胸肉。

3結論

本研究以利用率極低的禽血為材料，研究了亞鐵血紅素肽的酶解法提取和微膠囊化制備工藝，結合3D打印技術，將其應用于植物基人造肉發色中，開發了肉色穩定、質構和適口性良好的植物基人造肉。通過優化酶解雞血血紅蛋白的單因素試驗和正交試驗，選取堿性蛋白酶， pH8.5 ，總添加量100000U，反應溫度 50% ，在料液比 1：10 （質量比），酶解6h條件下， Fe²⁺ 濃度為 22.11μmol/L 。通過微膠囊化亞鐵血紅素肽的單因素試驗和正交試驗，選取 β 環糊精添加量 1.5g ，芯壁比 1：1 （體積比），壁材料含量 6% ，此時包埋率達 94.88% 。開發了3D打印人造肉的不同配方，研究了谷胱粉、微膠囊化亞鐵血紅素肽的添加量和3D打印溫度對植物基人造肉質構特性和色差的影響。當豌豆蛋白粉：谷胱粉 τ=10： 1（質量比）時，添加微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液后，在3D打印溫度為 35^°C 時，制備的人造肉具有較高的穩定性、較好的適口性，能模擬雞肉肉糜的色澤和滋味。本研究制備的微膠囊化亞鐵血紅素肽不僅可作為安全穩定的人造肉發色劑，還實現了雞血副產物的高價值利用，為人造肉肉色模擬和加工提供了新的思路與實現方式，未來可以根據產品的目標特性進一步熟化人造肉安全發色技術。

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