群體感應(yīng)淬滅活性生防菌GXMZU-5對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的生物防治及其機(jī)制研究

摘""要：為探究具有群體感應(yīng)淬滅活性的伯克霍爾德菌（Burkholdria）GXMZU-5生物防治的能力及其機(jī)制，通過(guò)對(duì)香蕉果實(shí)及盆栽苗細(xì)菌性軟腐病病菌Dickeya"zeae"GR-1的防治試驗(yàn)驗(yàn)證其生物防治效果，通過(guò)測(cè)定生物膜含量、胞外多糖清除能力、生物膜代謝活性抑制能力及QQ酶同源基因PCR擴(kuò)增驗(yàn)證其生物防治機(jī)制。結(jié)果表明：GXMZU-5可有效降解酰基高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子（acyl-homoserine"lactones，"AHLs），具有AHLs淬滅能力；在香蕉果實(shí)上進(jìn)行的生物防治試驗(yàn)中，GXMZU-5的混菌處理組果實(shí)表面相較于對(duì)照組更健康，未出現(xiàn)明顯黑斑和軟腐跡象，香蕉果實(shí)橫切和縱切結(jié)果表明，處理組的病斑擴(kuò)散面積大幅度減少；盆栽防治試驗(yàn)中，混菌處理組的香蕉假莖注射處無(wú)明顯腐爛跡象，自然株高相比病原菌組恢復(fù)了56%，表明GXMZU-5具有顯著抑制病原菌發(fā)病的作用。對(duì)其生物防治機(jī)制探究表明，混菌體系下的生物膜總含量、胞外多糖含量小于2種菌單獨(dú)培養(yǎng)；MTT法測(cè)定生物膜代謝表明，GXMZU-5可有效地降低GR-1的生物膜代謝活動(dòng)，且在混菌體系內(nèi)占主要優(yōu)勢(shì)位置。說(shuō)明GXMZU-5可通過(guò)淬滅效應(yīng)降低GR-1生物膜生物量及活力，從而獲得生物防治能力；對(duì)QQ酶同源基因進(jìn)行擴(kuò)增表明，GXMZU-5具有aiiA內(nèi)脂酶基因，可淬滅AHLs信號(hào)分子。本研究驗(yàn)證了GXMZU-5的生物防治能力，并初步探究了其防治機(jī)制，為淬滅菌防治植物細(xì)菌性病害提供一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：群體感應(yīng)淬滅；伯克霍爾德菌；香蕉細(xì)菌性軟腐病；生物防治中圖分類(lèi)號(hào)：S476.1;"S436.68""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Biocontrol"of"Banana"Bacterial"Soft"Rot"by"Quorum"Quenching"Bacterium"GXMZU-5"and"Its"Mechanism"Study

QIN"Tianhan1，3，"YANG"Jinxin1，3，"WANG"Lu1，"DUAN"Yingze1，"WEI"Jing1，"LI"Jiahui1，"ZHU"Yingzhi1，2，3*，"LI"Zhanbiao2，4，5*

1."School"of"Marine"and"Biotechnology，"Guangxi"Minzu"University"/"Guangxi"Key"Laboratory"of"Polysaccharide"Materials"and"Modification，"Nanning，"Guangxi"530008，"China;"2."Guangxi"Key"Laboratory"of"Biology"for"Crop"Diseases"and"Insect"Pests，"Nanning，"Guangxi"530007，"China;"3."Key"Laboratory"of"International"Cooperation"for"Exploitation"and"Utilization"of"Marine"Bio-resources，"Nanning，"Guangxi"530008，"China;"4."Plant"Protection"Research"Institute，"Guangxi"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanning，"Guangxi"530007，"China;"5."Key"Laboratory"of"Green"Prevention"and"Control"on"Fruits"and"Vegetables"in"South"China，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Nanning，"Guangxi"530007，"China

Abstract："In"order"to"investigate"the"biocontrol"ability"and"mechanism"of"Burkholderia"GXMZU-5"with"quorum"quenching"activity，"the"biocontrol"effect"was"verified"through"experiments"on"bacterial"soft"rot"of"banana"fruits"and"potted"seedlings"（Dickeya"zeae"GR-1），"and"the"biocontrol"mechanism"was"verified"by"measuring"the"content"of"biofilm，"the"ability"to"remove"extracellular"polysaccharides，"the"ability"to"inhibit"the"metabolic"activity"of"biofilm，"and"PCR"amplification"of"QQ"enzyme"homologous"genes."The"results"showed"that"GXMZU-5"could"effectively"degrade"acyl-"homoserine"lactone"（AHLs）"signal"molecules"and"had"AHLs"quenching"ability."In"the"biocontrol"experiment"on"banana"fruits，"the"surface"of"the"mixed"bacteria"experimental"group"was"healthier"than"that"of"the"control"group，"with"no"obvious"black"spots"or"soft"rot"signs."The"cross-section"and"longitudinal"section"results"of"banana"fruits"showed"that"the"lesion"area"of"the"treatment"group"was"significantly"reduced."In"the"potted"plant"control"experiment，"there"were"no"obvious"signs"of"rot"at"the"injection"site"of"the"mixed"bacteria"group，"and"the"natural"plant"height"recovered"by"56%"compared"with"the"pathogen"group，"indicating"that"GXMZU-5"had"a"significant"inhibitory"effect"on"the"disease"caused"by"Dickeya"zeae"GR-1."The"results"for"exploring"of"the"biocontrol"mechanism"showed"that"the"total"content"of"biofilm"and"the"content"of"extracellular"polysaccharides"in"the"mixed"bacteria"system"were"lower"than"those"of"the"two"bacteria"cultured"separately."The"MTT"method"for"measuring"biofilm"metabolism"indicated"that"GXMZU-5"could"effectively"reduce"the"biofilm"metabolic"activity"of"Dickeya"zeae"GR-1"and"occupied"a"dominant"position"in"the"mixed"bacteria"system."The"exploration"of"the"biocontrol"mechanism"indicated"that"GXMZU-5"could"reduce"the"biomass"and"vitality"of"Dickeya"zeae"GR-1"biofilm"through"quenching"effect，"thereby"obtaining"biocontrol"ability."The"amplification"of"QQ"enzyme"homologous"genes"showed"that"GXMZU-5"had"the"aiiA"lactonase"gene"and"could"quench"AHLs"signal"molecules."This"study"verified"the"biocontrol"ability"of"GXMZU-5"and"preliminarily"explored"its"biocontrol"mechanism，"providing"a"certain"reference"basis"for"the"use"of"quenching"bacteria"to"control"plant"bacterial"diseases.

Keywords："quorum"quenching;"Burkholderia;"banana"bacterial"soft"rot;"biological"control

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.019

群體感應(yīng)（quorum"sensing，"QS）是一種微生物間進(jìn)行通信的機(jī)制，細(xì)菌通過(guò)自發(fā)產(chǎn)生并釋放信號(hào)分子到環(huán)境中[1]，種群隨后根據(jù)信號(hào)分子的濃度來(lái)調(diào)控諸如生物發(fā)光、生物膜形成、酶的產(chǎn)生等生理活動(dòng)[2]。QS信號(hào)分子有很多種類(lèi)，如酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acyl-homoserine"lactones，"AHLs）[3]、順式-11-甲基-2-十二烯酸（diffusible"signaling"factor，"DSF）[4]、烷基喹啉分子（alkyl-quinolones，"AQ）[5]等，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，部分植物病原菌也通過(guò)利用群體感應(yīng)完成侵染活動(dòng)，例如胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium"carotovorum"subsp."caro tovorum，"Pcc）通過(guò)感知AHLs，調(diào)控產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶和果膠酸鹽裂解酶，從而破壞植物細(xì)胞壁完成侵染[6]，野油菜黃單胞菌（Xanthomonas"campestris"pv."campestris，"Xcc）依賴(lài)DSF調(diào)控各種胞外多糖的產(chǎn)生及各類(lèi)致病因子的產(chǎn)生[7]。

細(xì)菌性病害是植物主要病害之一，常引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]，目前主要通過(guò)化學(xué)農(nóng)藥和微生物源農(nóng)藥進(jìn)行防治，但過(guò)度使用農(nóng)藥可導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性[9-11]。群體感應(yīng)淬滅（quorum"quenching，"QQ）是切斷微生物種群間交流的一種機(jī)制，通過(guò)形成信號(hào)分子類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)性地與受體結(jié)合[12]；或形成可特異性降解信號(hào)分子的酶[13]等形式切斷病原微生物的群體交流，使病原菌的毒力因子表達(dá)水平下降從而達(dá)到生物防治的效果[14]。KALIA等[15]研究發(fā)現(xiàn)二酮哌嗪（diketopiperazine，"DKP）作為一種競(jìng)爭(zhēng)類(lèi)似物，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)與AHLs受體結(jié)合，從而引起群體感應(yīng)水平下降并減弱病原菌致病能力。ZHANG等[16]發(fā)現(xiàn)Acinetobacter"sp.對(duì)Pcc具有明顯的防治效果，GC-MS分析表明該菌可有效降解AHLs，從而干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，有效抑制病原菌的致病性。

香蕉細(xì)菌性軟腐病是我國(guó)香蕉主要病害之一，病原為Dickeyanbsp;zeae，主要引起香蕉葉片枯黃，球莖或球莖與假莖交界處出現(xiàn)黑褐色斑點(diǎn)，隨后迅速擴(kuò)散至整株植株，并開(kāi)始腐爛，直至植株死亡[17]，我國(guó)香蕉每年均遭受細(xì)菌性軟腐病的大面積侵害，且侵害范圍不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以香蕉細(xì)菌性軟腐病菌為防治對(duì)象，探究一株具有群體感應(yīng)淬滅活性的伯克霍爾德菌（Burkholdria）GXMZU-5對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的生物防治效果，以期為防治香蕉細(xì)菌性軟腐病提供一種新型防治方式，也為伯克霍爾德菌GXMZU-5在植物細(xì)菌性病害防治中的合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試菌株""AHLs指示菌紫色桿菌CV026、伯克霍爾德菌（Burkholdria）GXMZU-5、大腸桿菌（Escherichia"coli）均由本課題組保存，Dickeya"zeae"GR-1（GR-1）由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院付崗老師課題組饋贈(zèng)。

1.1.2""供試藥劑""N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子（acyl-homoserine"lactones，"AHLs）CHL-6、5-（4，6-二氯三嗪基）氨基熒光素（5-DTAF）均購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.1.3""植物材料""香蕉購(gòu)自廣西海吉星農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際物流水果批發(fā)市場(chǎng)，香蕉幼苗（威廉斯品種）采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.1.4""供試培養(yǎng)基與儀器""LB（Luria?Bertani）培養(yǎng)基、NB（nutrinet"broth）培養(yǎng)基、TSB（trypticase"soy"broth）培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物科技有限公司。MSM（minimal"salt"medium）基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：硫酸銨2"g，七水合硫酸鎂0.2"g，二水合氯化鈣0.01"g，七水合硫酸亞鐵0.001"g，十二水合磷酸氫二鈉1.5"g，磷酸二氫鉀1.5"g，蒸餾水1000"mL，pH"6.8。T100-PCR儀為美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)，正置熒光顯微鏡BX51TRF為奧林巴斯公司產(chǎn)品，Eproch酶標(biāo)儀為美國(guó)伯騰公司生產(chǎn)，其余均為常規(guī)試劑。

1.2""方法

1.2.1""群體感應(yīng)淬滅能力驗(yàn)證""取菌株GXMZU-"5、CV026于液體LB培養(yǎng)基中活化，在30"℃、200"r/min條件下培養(yǎng)24"h，培養(yǎng)結(jié)束后以此為種子液，按10%接種量將GXMZU-5接種至1"mL"MSM培養(yǎng)基中，并添加10"μL的CHL-6為唯一碳源。CV026接種至LB培養(yǎng)基中，在30"℃、200"r/min條件下培養(yǎng)24"h，培養(yǎng)結(jié)束后取1"mL"CV026均勻涂布于LB平板，晾干后取無(wú)菌2.5"cm圓形模具制作圓餅，再使用無(wú)菌200"μL槍頭倒扣在圓餅中央挖洞。取發(fā)酵GXMZU-5"MSM培養(yǎng)液，利用0.22"μm過(guò)濾器進(jìn)行除菌過(guò)濾，取濾液進(jìn)行點(diǎn)樣。設(shè)立空白MSM培養(yǎng)液+CHL-6，以及大腸桿菌+CHL-6為對(duì)照，每組均點(diǎn)樣10"μL，在30"℃條件下培養(yǎng)24"h，觀察平板內(nèi)CV026菌株產(chǎn)生的紫色色素情況。

1.2.2""GXMZU-5與Dickeya"zeae"GR-1平板對(duì)峙試驗(yàn)""菌株GXMXU-5和GR-1在NB平板上進(jìn)行活化，然后分別挑取單菌落接種至NB培養(yǎng)基中，在30"℃、200"r/min條件下培養(yǎng)24"h，調(diào)節(jié)其OD600值至1.0。然后將GR-1均勻涂布于整個(gè)平板，待其晾干后，于平板中央放置牛津杯，并向牛津杯中加入200"μL"GXMZU-5菌液，觀察平板上的拮抗情況。

1.2.3""GXMZU-5對(duì)GR-1的生物防治試驗(yàn)""將培養(yǎng)24"h的GXMXU-5和GR-1菌液的OD600調(diào)節(jié)至1.0，然后選取健康、表皮無(wú)瑕疵且狀態(tài)一致的香蕉果實(shí)，使用1"mL無(wú)菌注射器穿透果肉表皮進(jìn)行注射，試驗(yàn)組注射1"mL"GXMZU-5+病原菌（1∶1等體積混合）混合液，對(duì)照注射1"mL空白培養(yǎng)液、病原菌，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。于28"℃保濕培養(yǎng)3"d，觀察果實(shí)發(fā)病情況。

1.2.4""GXMZU-5對(duì)GR-1的盆栽試驗(yàn)""將培養(yǎng)24"h的GXMXU-5、GR-1菌液的OD600調(diào)節(jié)至1.0，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康香蕉苗，使用無(wú)菌注射器于假莖處進(jìn)行注射，試驗(yàn)組注射1"mL"GXMZU-5+病原菌（1∶1等體積混合）混合液，對(duì)照注射1"mL無(wú)菌培養(yǎng)液、病原菌，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，接種后的香蕉苗于網(wǎng)室內(nèi)自然條件下培養(yǎng)。持續(xù)10"d觀察植株發(fā)病情況，并在10"d后測(cè)量植株的自然株高。

1.2.5""PCR擴(kuò)增GXMZU-5"QQ酶同源基因""參考KHALID等[18]的方法，合成AHLs內(nèi)脂酶（aiiA）基因的擴(kuò)增引物，引物序列為F（5?-3?）：GATGGCCTGGAGAATGAC；R（5?-3?）：GCGTGTAGGGTATGAGCC，擴(kuò)增片段大小為257"bp。擴(kuò)增條件：95"℃預(yù)變性5"min，95"℃變性30nbsp;s，59.9"℃退火40"s，72"℃延伸1"min，30次循環(huán)，然后在72"℃下延伸10"min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶是否存在，同時(shí)判斷PCR產(chǎn)物大小。

1.2.6""結(jié)晶紫法測(cè)定GXMZU-5與GR-1混菌體系生物膜總含量""將GR-1與GXMZU-5設(shè)置單獨(dú)、混菌培養(yǎng)，接種至5"mL"5%"NB培養(yǎng)基中，于30"℃下培養(yǎng)5"d，結(jié)束后棄培養(yǎng)基，加入無(wú)菌水清洗2遍后風(fēng)干15"min，風(fēng)干后滴加甲醇固定10"min，風(fēng)干，后向管內(nèi)加入0.1%結(jié)晶紫染色20"min，然后用無(wú)菌水漂洗，風(fēng)干10"min，加入33%冰醋酸沒(méi)過(guò)管壁溶解，于96孔板孔中加入200"μL溶解液，測(cè)定其OD595，以O(shè)D595表示生物膜含量。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7""混菌體系的胞外多糖含量測(cè)定""取培養(yǎng)24"h的菌液作為種子液，按1%接種量將GXMZU-5、GR-1接種至無(wú)菌NB培養(yǎng)基中，設(shè)置單一菌接種對(duì)照組、1∶1混菌試驗(yàn)組，于30"℃下培養(yǎng)30"h，培養(yǎng)結(jié)束后在5000"r/min條件下離心20"min，收集上清液，加入3倍無(wú)水乙醇于4"℃過(guò)夜，收集胞外多糖（EPS），收集結(jié)束后在8000"r/min條件下離心10"min，棄上清液后，置于烘箱中完全烘干后稱(chēng)重，設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.8""MTT法測(cè)定混菌體系的生物膜活性""參照齊龍升等[19]的方法，取培養(yǎng)24"h的菌液調(diào)整至對(duì)數(shù)期，然后按10%接種量接種至無(wú)菌5%"NB培養(yǎng)基中，充分混勻后轉(zhuǎn)接至96孔板內(nèi)，設(shè)置GXMZU-5、GR-1單一培養(yǎng)組以及1∶1混菌試驗(yàn)組，每孔200"μL。將96孔板置于25"℃下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5"d后去除孔內(nèi)懸浮細(xì)胞，用無(wú)菌磷酸緩沖液洗滌生物被膜2次，清除孔內(nèi)的浮游菌體，隨后采用MTT方法進(jìn)行染色，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD595，設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.9""混菌狀態(tài)的生物膜形成分析""參照齊龍升等[19]的方法進(jìn)行制片，并利用正置熒光顯微鏡觀察，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板板內(nèi)放置無(wú)菌蓋玻片（14"mm×14"mm），然后將過(guò)夜培養(yǎng)的2種菌液稀釋至其OD600為0.5，每孔加入2"mL菌液，混菌組按1∶1進(jìn)行混合，置于30"℃下培養(yǎng)48"h。吸去孔中懸浮菌液，用無(wú)菌生理鹽水沖洗玻片3次，避光條件下用4%多聚甲醛固定30"min，用無(wú)菌磷酸緩沖液沖洗3次，然后向玻片滴加5-（4，6-二氯三嗪基）氨基熒光素（5-DTAF）直至沒(méi)過(guò)玻片，避光下孵育2"h，然后用無(wú)菌磷酸緩沖液重復(fù)沖洗玻片，用錫紙將玻片包裹，防止玻片受光線照射，于正置熒光顯微鏡下觀察玻片。

2""結(jié)果與分析

2.1""群體感應(yīng)淬滅能力驗(yàn)證

CV026是一株人工突變菌株，主要用途為檢測(cè)環(huán)境內(nèi)是否存在AHLs分子，CV026自身不能產(chǎn)生AHLs，但當(dāng)檢測(cè)到外源的AHLs時(shí)會(huì)啟動(dòng)相關(guān)基因產(chǎn)生紫色色素。本研究中，經(jīng)添加外源CHL-6與GXMZU-5培養(yǎng)24"h后，菌板無(wú)紫色色素產(chǎn)生，對(duì)照則出現(xiàn)明顯的紫色，結(jié)果表明，GXMZU-5具有降解AHLs的能力（圖1）。

2.2""GXMZU-5與GR-1平板對(duì)峙試驗(yàn)

經(jīng)24"h培養(yǎng)后，GXMZU-5與GR-1混合培養(yǎng)后無(wú)明顯抑菌圈，證明GXMZU-5不是通過(guò)拮抗作用對(duì)GR-1產(chǎn)生抑制作用，可以用于群體感應(yīng)淬滅的后續(xù)研究（圖2）。

2.3""GXMZU-5對(duì)GR-1的生物防治試驗(yàn)

香蕉經(jīng)保濕培養(yǎng)后，混菌處理的病斑面積比病原菌單一處理的大幅度減少（圖3A）。沿注射處橫切后，淬滅菌本身未引起香蕉產(chǎn)生腐爛癥狀，而混菌處理后可明顯減少果肉腐爛面積（圖3B）。將果肉沿注射處縱切后，混菌處理后發(fā)病擴(kuò)散面積顯著減弱（圖3C）。結(jié)果表明，GXMZU-5對(duì)GR-1有較好的生物防治作用。

2.4""GXMZU-5對(duì)GR-1的盆栽試驗(yàn)

香蕉盆栽經(jīng)持續(xù)澆水后，對(duì)葉片狀態(tài)、假莖注射處進(jìn)行觀察，病原菌對(duì)照組出現(xiàn)葉片明顯發(fā)黃變黑、植株較矮，且注射處有明顯腐爛黑斑癥狀（圖4）；混菌處理的發(fā)病癥狀明顯減弱，且自然株高高于病原菌單一處理（圖5）；假莖注射處無(wú)明顯黑斑（圖6）。與2.3生物防治試驗(yàn)結(jié)果吻合，表明GXMZU-5對(duì)GR-1在盆栽試驗(yàn)中也呈現(xiàn)一定的生物防治效果。

2.5""PCR擴(kuò)增GXMZU-5"QQ酶同源基因

內(nèi)脂酶是群體感應(yīng)淬滅環(huán)節(jié)中一類(lèi)重要的酶類(lèi)，本研究選定aiiA酶基因作為研究目標(biāo)，結(jié)果表明，在257"bp左右出現(xiàn)明顯且單一條帶（圖7），將單一條帶進(jìn)行切膠回收并送至奧克生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI進(jìn)行比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)與aiiA基因高度近似，證實(shí)GXMZU-5代謝產(chǎn)物中至少包含內(nèi)脂酶，可以有效阻止病原菌的群體感應(yīng)進(jìn)程。

2.6""結(jié)晶紫法測(cè)定GXMZU-5與GR-1混菌體系生物膜總含量

生物膜是微生物的一種天然屏障，通過(guò)生物膜的形式，病原菌可以在生物膜內(nèi)更為穩(wěn)定地增殖并提高抗逆性從而更有利地侵染植物，生物膜的生成受群體感應(yīng)的調(diào)控。本研究將GXMZU-5與GR-1單獨(dú)、混合培養(yǎng)5"d后，用結(jié)晶紫法對(duì)對(duì)照、混菌組的生物膜含量進(jìn)行提取并測(cè)定其OD595，結(jié)果表明，混菌組的生物膜含量較兩菌單獨(dú)培養(yǎng)組低（圖8），表明GXMZU-5不僅具有清除病原菌生物膜的能力，還會(huì)降低其自身生物膜的產(chǎn)生水平。

2.7""混菌體系的胞外多糖含量

胞外多糖是生物膜組成的重要物質(zhì)，為印證2.6中清除生物膜的結(jié)論，通過(guò)三倍醇沉法獲得胞外多糖進(jìn)行稱(chēng)重，GXMZU-5單獨(dú)處理的胞外多糖含量為0.0034"g，GR-1單獨(dú)處理的胞外多糖含量為0.0016"g，混菌處理的的胞外多糖含量為0.0018"g，總體低于兩菌單獨(dú)產(chǎn)量之和。證實(shí)在混菌體系下胞外多糖的產(chǎn)生量總體下降。此結(jié)論與2.6中生物膜總含量減少的結(jié)果一致，證明GXMZU-5對(duì)GR-1胞外多糖的產(chǎn)生有抑制作用。

2.8""MTT法測(cè)定混菌體系的生物膜活性

為反映混菌體系下2種菌的優(yōu)勢(shì)種群及其活性，本研究通過(guò)使用96孔板進(jìn)行MTT染色。結(jié)果顯示在5%"NB培養(yǎng)基中，GXMZU-5在培養(yǎng)1"d時(shí)活性最好，其OD595值為1.436，其生物膜代謝活性較高，混菌體系的OD595值幾乎接近單獨(dú)培養(yǎng)，而GR-1的代謝活性極低，其OD595僅為0.143，表明GXMZU-5在混菌初期為優(yōu)勢(shì)菌群；培養(yǎng)2"d時(shí)，GXMZU-5的生物膜代謝能力下降，但其活性仍高于GR-1；培養(yǎng)3～4"d時(shí)，GXMZU-5的生物膜代謝活性進(jìn)一步降低，推測(cè)此時(shí)GXMZU-5的生物膜代謝暫時(shí)到達(dá)飽和，呈下降趨勢(shì)，但與混菌組OD595值相差不大，仍然處于代謝優(yōu)勢(shì)狀態(tài)；培養(yǎng)5"d時(shí)，GXMZU-5的生物膜代謝重新開(kāi)始，始終高于GR-1的生物膜代謝活性，而混菌組的生物膜代謝活性與第4天的相近，第4天的OD595值為1.017，第5天的OD595值為1.0275，而GR-1的生物膜代謝活性持續(xù)增加（圖9），證實(shí)GXMZU-5具有顯著的抑制生物膜代謝的能力，符合2.6中生物膜清除、2.7中胞外多糖代謝的結(jié)論。

2.9""混菌狀態(tài)的生物膜形成分析

使用正置熒光顯微鏡觀察GXMZU-5與GR-1在混合培養(yǎng)下的生物膜形成情況，由圖10可以看出，GXMZU-5與GR-1單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，均有明顯、大片的熒光，能觀察到大量的生物膜生成。而在混菌狀態(tài)下，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度、生物膜面積均比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)明顯減少，進(jìn)一步驗(yàn)證自身及GR-1的生物膜產(chǎn)生具有一定影響。

3""討論

香蕉是我國(guó)重要的熱帶水果之一，深受大眾喜愛(ài)。廣西是我國(guó)香蕉主要種植區(qū)，其地表溫度高、高溫多雨的環(huán)境易生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)果，但相應(yīng)地也促進(jìn)各類(lèi)病原菌發(fā)病。近年來(lái)，由Dickeya"zeae導(dǎo)致的香蕉細(xì)菌性軟腐病使廣西香蕉產(chǎn)量大幅下降，且發(fā)病面積逐年擴(kuò)大，亟需尋找一種高效、綠色可持續(xù)發(fā)展的防治方式。研究發(fā)現(xiàn)，部分化學(xué)藥劑可有效防治香蕉細(xì)菌性軟腐病，如王銅和噻菌銅在防治香蕉細(xì)菌性軟腐病方面表現(xiàn)出較好效果[20]，但過(guò)度使用化學(xué)農(nóng)藥易導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)遭受破壞。已有針對(duì)Dickeya"zeae導(dǎo)致的香蕉細(xì)菌性軟腐病開(kāi)展了一定的防治研究，如番華彩等[21]通過(guò)篩選，將春雷霉素等藥劑應(yīng)用于田間，防治效果達(dá)到90.1%，在多種作物上表現(xiàn)出顯著的防治效果。周佳暖等[22]針對(duì)Dickeya"zeae導(dǎo)致的香蕉細(xì)菌性軟腐病致病機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)探究，表明致病性主要與胞外多糖、細(xì)胞壁降解酶等密切相關(guān)。群體感應(yīng)淬滅作為一種新型防治方法，其毒性和危險(xiǎn)性相對(duì)較低，但針對(duì)Dickeya"zeae的群體感應(yīng)淬滅研究極少。因此，本研究篩選到一株具有強(qiáng)淬滅AHLs信號(hào)分子能力的菌株GXMZU-"5，在香蕉軟腐病防治中取得明顯的生物防治效果，為使用群體感應(yīng)淬滅菌應(yīng)用于香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治提供了一定的思路與研究基礎(chǔ)。

本研究證實(shí)GXMZU-5對(duì)采用AHLs信號(hào)分子的病原細(xì)菌具有顯著的群體感應(yīng)淬滅效應(yīng)，并對(duì)由AHLs調(diào)控的生物膜相關(guān)的內(nèi)容進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，GXMZU-5可有效抑制Dickeya"zeae"GR-1的生物膜形成，此外胞外多糖的產(chǎn)量也大幅度下降。在混菌體系中，GXMZU-5的細(xì)胞活性占主導(dǎo)地位，表明該菌可能通過(guò)影響Dickeya"zeae"GR-1的生物膜代謝進(jìn)程導(dǎo)致病原菌在自然環(huán)境中抗逆性減弱進(jìn)而導(dǎo)致毒力下降。目前針對(duì)Dickeya"zeae的研究，還發(fā)現(xiàn)其具有一種控制菌體發(fā)揮毒力的新型信號(hào)通路Vfm[23]。本研究已證實(shí)GXMZU-5可有效降解群體感應(yīng)信號(hào)分子AHLs，并在防治試驗(yàn)中證實(shí)GXMZU-5可有效防治香蕉細(xì)菌性軟腐病，但GXMZU-5對(duì)Dickeya"zeae的Vfm信號(hào)分子是否具有淬滅作用的研究還在進(jìn)行中，已有學(xué)者研究表明淬滅菌可能同時(shí)具備淬滅多種信號(hào)分子的能力，如陳少華等[24]發(fā)現(xiàn)了一株溶蛋白芽孢桿菌具有同時(shí)淬滅DSF、AHLs兩種信號(hào)分子的能力。因此，推測(cè)GXMZU-5也可能通過(guò)同時(shí)淬滅多種信號(hào)分子，總體降低病原菌的毒力，從而達(dá)到有效防治香蕉細(xì)菌性軟腐病的作用。今后將對(duì)GXMZU-5的生物防治機(jī)理進(jìn)行深入探究，或?qū)ζ浯銣缧盘?hào)分子的通路進(jìn)一步拓寬探索，以期為群體感應(yīng)淬滅應(yīng)用于生物防治提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1]"劉鵬，"張?jiān)戮辏?趙廷昌."細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]."中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，"2007（6）："467-472.LIU"P，"ZHANG"Y"J，"ZHAO"T"C."Research"progress"in"bacterial"quorum"sensing"systems[J]."Chinese"Agricultural"Science"Bulletin，"2007（6）："467-472."（in"Chinese）

[2]"程古月，"郝海紅，"戴夢(mèng)紅，"劉振利，"袁宗輝."病原菌的群體感應(yīng)及其抑制劑的研究進(jìn)展[J]."科學(xué)通報(bào)，"2012，"57（21）："1964-1977.CHENG"G"Y，"HAO"H"H，"DAI"M"H，"LIU"Z"L，"YUAN"Z"H."Quorum"sensing"of"pathogenic"bacteria"and"quorum-sensing"inhibitors[J]."Chinese"Science"Bulletin，"2012，"57（21）："1964-1977."（in"Chinese）

[3]"張煉輝."微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]."華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，"2019，"40（5）："50-58.ZHANG"L"H."Research"progress"of"microbial"quorum"sensing"systems[J]."Journal"of"South"China"Agricultural"University，"2019，"40（5）："50-58."（in"Chinese）

[4]"王立燕，"劉永生."細(xì)菌群體感應(yīng)種類(lèi)及其信號(hào)分子的研究進(jìn)展[J]."中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，"2015，"37（4）："318-320.WANG"L"Y，"LIU"Y"S."Research"progress"of"bacterial"quorum"sensing"species"and"their"signaling"molecules[J]."Chinese"Journal"of"Preventive"Veterinary"Medicine，"2015，"37（4）："318-320."（in"Chinese）

[5]"郭冰怡，"董燕紅."細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑研究進(jìn)展[J]."農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，"2018，"20（4）："408-424.""GUO"B"Y，"DONG"Y"H."Research"progress"on"inhibitors"toward"quorum"sensing"system[J]."Chinese"Journal"of"Pesticide"Science，"2018，"20（4）："408-424."（in"Chinese）

[6]"王巖，"于雅萌，"張靜靜，"張曉華."海洋微生物群體感應(yīng)與群體感應(yīng)淬滅的開(kāi)發(fā)利用[J]."生物資源，"2017，"39（6）："413-422.""WANG"Y，"YU"Y"M，"ZHANG"J"J，"ZHANG"X"H."Exploitation"and"application"of"quorum"sensing"and"quorum"quenching"in"marine"microorganisms[J]."Biotic"Resources，"2017，"39（6）："413-422."（in"Chinese）

[7]"周蓮，"王杏雨，"何亞文."植物病原黃單胞菌DSF信號(hào)依賴(lài)的群體感應(yīng)機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[J]."中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2013，"46（14）："2910-2922.ZHOU"L，"WANG"X"Y，"HE"Y"W."DSF"signal-dependent"quorum"sensing"in"plant"pathogenic"bacteria"Xanthomonas[J]."Scientia"Agricultura"Sinica，"2013，"46（14）："2910-2922."（in"Chinese）

[8]"曹坳程，"劉曉漫，"郭美霞，"王秋霞，"李園，"歐陽(yáng)燦彬，"顏冬冬."作物土傳病害的危害及防治技術(shù)[J]."植物保護(hù)，"2017，"43（2）："6-16.CAO"A"C，"LIU"X"M，"GUO"M"X，"WANG"Q"X，"LI"Y，"OUYANG"C"B，"YAN"D"D."Incidences"of"soil-borne"diseases"and"control"measures[J]."Plant"Protection，"2017，"43（2）："6-16."（in"Chinese）

[9]"王文橋，"馬志強(qiáng)，"張小風(fēng)，"張文吉."植物病原菌對(duì)殺菌劑抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]."農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，"2001（1）："6-11.WANG"W"Q，"MA"Z"Q，"ZHANG"X"F，"ZHANG"W"J."Evaluation"of"risk"of"resistance"in"plant"pathogenous"fungi"to"fungicides[J]."Chinese"Journal"of"Pesticide"Science，"2001（1）："6-11."（in"Chinese）

[10]"邱德文."我國(guó)植物病害生物防治的現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J]."植物保護(hù)，"2010，"36（4）："15-18，"35.QIU"D"W."Current"status"and"development"strategy"for"biological"control"of"plant"diseases"in"China[J]."Plant"Protection，"2010，"36（4）："15-18，"35."（in"Chinese）

[11]"陳菲菲，"王勇，"王以光，"赫衛(wèi)清."海洋微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J]."應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，"2011，"17（2）："287-294.CHEN"F"F，"WANG"Y，"WANG"Y"G，"HE"W"Q."Advance"in"research"and"development"of"natural"products"from"marine"microorganisms[J]."Chinese"Journal"of"Applied"and"Environmental"Biology，"2011，"17（2）："287-294."（in"Chinese）

[12]"MURUGAYAH"S"A，"GERTH"M"L."Engineering"quorum"quenching"enzymes："progress"and"perspectives[J]."Biochemical"Society"Transactions，"2019，"47（3）："793-800.

[13]"PIEWNGAM"P，"CHIOU"J，"CHATTERJEE"P，"OTTO"M."Alternative"approaches"to"treat"bacterial"infections："targeting"quorum-sensing[J]."Expert"Review"of"Anti-infective"Therapy，"2020，"18（6）："499-510.

[14]"RODRíGUEZ"M，"TORRES"M，"BLANCO"L，"BéJAR"V，"SAMPEDRO"I，"LLAMAS"I."Plant"growth-promoting"activity"and"quorum"quenching-mediated"biocontrol"of"bacterial"phytopathogens"by"Pseudomonas"segetis"strain"P6[J]."Scientific"Reports，"2020，"10（1）："4121.

[15]"KALIA"V"C，"PUROHIT"H"J."Quenching"the"quorum"sensing"system："potential"antibacterial"drug"targets[J]."Critical"Reviews"in"Microbiology，"2011，"37（2）："121-140.

[16]"ZHANG"W"P，"LUO"Q"Q，"ZHANG"Y"Y，"FAN"X"H，"YE"T，"MISHRA"S，"BHATT"P，"ZHANG"L"H，"CHEN"S"H."Quorum"quenching"in"a"novel"Acinetobacter"sp."XN-10"bacterial"strain"against"Pectobacterium"carotovorum"subsp."caro tovorum[J]."Microorganisms，"2020，"8（8）："1100.

[17]"杜嬋娟，"楊迪，"付崗，"葉云峰，"潘連富，"張晉."廣西香蕉細(xì)菌性軟腐病病原鑒定及生物學(xué)特性研究[J]."植物保護(hù)，"2019，"45（5）："148-156."DU"C"J，"YANG"D，"FU"G，"YE"Y"F，"PAN"L"F，"ZHANG"J."Identification"and"biological"characteristics"of"the"pathogen"causing"banana"bacterial"soft"rot"disease"in"Guangxi[J]."Plant"Protection，"2019，"45（5）："148-156."（in"Chinese）

[18]"KHALID"S"J，"AIN"Q，"KHAN"S"J，"JALIL"A，"SIDDIQUI"M"F，"AHMAD"T，"BADSHAH"M，"ADNAN"F."Targeting"Acyl"Homoserine"Lactones"（AHLs）"by"the"quorum"quenching"bacterial"strains"to"control"biofilm"formation"in"Pseudomonas"aeruginosa[J]."Saudi"Journal"of"Biological"Sciences，"2022，"29（3）："1673-1682.

[19]"齊龍升，"孫博，"韓志東，"汪倫記."不同溫度單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)生物被膜的形成[J]."農(nóng)產(chǎn)品加工，"2024（5）："75-78，"82.""QI"L"S，"SUN"B，"HAN"Z"D，"WANG"L"J."Biofilm"formation"by"mixed"culture"of"Listeria"monocytogenes"and"Staphylococcus"aureus"at"different"temperatures[J]."Farm"Products"Processing，"2024（5）："75-78，"82."（in"Chinese）

[20]"沈會(huì)芳，"蒲小明，"楊祁云，"張景欣，"孫大元，"林壁潤(rùn)."香蕉細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選試驗(yàn)[J]."廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2020，"47（1）："98-104.""SHEN"H"F，"PU"X"M，"YANG"Q"Y，"ZHANG"J"X，"SUN"D"Y，"LIN"B"R."Selection"of"bactericides"for"controlling"bacterial"soft"rot"of"banana[J]."Guangdong"Agricultural"Sciences，"2020，"47（1）："98-104."（in"Chinese）

[21]"番華彩，"曾莉，"李衛(wèi)雁，"丁云秀，"郭志祥，"李舒，"徐勝濤，"鄭泗軍，"王永斌."香蕉細(xì)菌性軟腐病防控藥劑篩選及田間應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[J]."中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，"2022，"38（31）："113-118.PAN"H"C，"ZENG"L，"LI"W"Y，"DING"Y"X，"GUO"Z"X，"LI"S，"XU"S"T，"ZHENG"S"J，"WANG"Y"B."Bactericides"screening"and"field"application"for"banana"bacterial"soft"rot[J]."Chinese"Agricultural"Science"Bulletin，"2022，"38（31）："113-118."（in"Chinese）

[22]"周佳暖，"姜子德，"張煉輝."細(xì)菌性軟腐病菌Dickeya致病機(jī)理的研究進(jìn)展[J]."植物病理學(xué)報(bào)，"2015，"45（4）："337-349."ZHOU"J"N，"JIANG"Z"D，"ZHANG"L"H."Research"progress"in"the"pathogenic"mechanism"of"Dickeya"spp.[J]."Acta"Phyto pathologica"Sinica，"2015，"45（4）："337-349."（in"Chinese）

[23]"許佳晶."VFM信號(hào)—一種來(lái)自Dickeya"dadantii的新型群體感應(yīng)信號(hào)的分離及性質(zhì)探討[D]."廣州："華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2017.XU"J"J."Solation，"properties"and"structural"characterization"of"VFM，"a"new"quorum"sensing"signal"of"Dickeya"dadantii[D]."Guangzhou："South"China"Agricultural"University，"2017."（in"Chinese）

[24]"陳少華，"李綺婷，"范興輝，"葉田，"李欣，"梁梓僑."溶蛋白芽孢桿菌在防治依賴(lài)群體感應(yīng)信號(hào)分子的致病菌及病害方面的應(yīng)用："201910843482[P]."2024-11-20.CHEN"S"H，"LI"Q"T，"FAN"X"H，"YE"T，"LI"X，"LIANG"Z"Q."Application"of"proteolytic"bacillus"in"the"control"of"pathogens"and"diseases"dependent"on"quorum"sensing"signaling"molecules："201910843482[P]."2024-11-20."（in"Chinese）