黑脛病對大寧曬煙轉錄組和代謝組的影響

中圖分類號：S435.72 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）06-0037-11

AbstractDaning sun-cured tobacco is a species of good-quality yelow sun-cured tobacco in Hezhou， Guangxi，and it is the excellent raw material for cigarette production.However，it has extremely low resistance to black shank disease.This study investigated the response mechanism of Daning sun-cured tobacco to black shank disease by comparing the diferentially expressed genes and metabolites between healthy and black shank-infected leaves through transcriptomic and metabolomic analyses.The results showed that a total of 7 194 significantly diferentially expressed genes were identified through transcriptomic analysis，and 198 significantly diffrent metabolites were detected through metabolomic analysis.The combined transcriptomic and metabolomic analysis revealed that ： ① Plant hormone signal transduction and phenylpropanoid biosynthesis pathways played important roles in the defense of Daning sun-cured tobacco against black shank infection. ② 二 was speculated that metabolic pathways such as aminoacyl-tRNA biosynthesis，cyanogenic amino acid metabolism，valine，leucine and isoleucine degradation，cysteine and methionine metabolism，and arginine and proline metabolism were related to the response of Daning sun-cured tobacco to black shank stress.This study elucidated the major gene transcriptional regulatory networks and metabolic pathways of Daning sun-cured tobacco in response to black shank infection，which could provide a theoretical basis for research on improving the resistance of Daning sun-cured tobacco to black shank disease.

KeywordsDaning sun-cured tobacco；Black shank disease；Transcriptome；Metabolome；Plant hormone signal transduction; Phenylpropanoid biosynthesis

曬黃煙在我國有數百年的栽培歷史，目前已形成多個具有獨特香氣特征的品種[1]。優質的曬黃煙具有吃味純凈、勁頭適中、刺激性小等特點，一些地方性曬黃煙有顯著的香型特點，是卷煙配方中替代香料煙的良好原料[2]。研究表明，將曬黃煙適量添加在低檔卷煙配方中，既能增加填充能力，又能適當降低香煙的焦油含量，減少對身體的傷害，同時還能使卷煙的吃味、香氣濃度和勁頭保持不變[3]。于建軍等4研究顯示，將曬黃煙加入烤煙中，可以彌補由于卷煙降焦減害所致的香氣不足、味道淡的缺點，還能豐富協調卷煙產品的香氣質，“中式卷煙”的發展離不開我國特有的曬黃煙資源[5] O

廣西賀州是我國曬黃煙較大的種植區，以大寧曬煙最為著名。大寧曬煙屬茄科煙草屬紅花煙，是一種優質特香型曬黃煙，以葉厚膠多、馥郁芳香、煙氣醇和、香味濃郁著稱[6-7]。大寧曬煙種植于新墾坡陡山地，采用傳統種植方式栽培[8]難以擴大種植范圍和提高產量，因此異地種植是推廣和發展大寧曬煙的必然趨勢。目前關于大寧曬煙異地栽培的研究較多，但在異地栽培過程中發現其對黑脛病的抗性極低，導致大面積種植時產量較低。目前對于大寧曬煙響應煙草黑腔病的關鍵基因及差異代謝物尚不清楚，本試驗通過對大寧曬煙健康植株與感染黑脛病的植株葉片進行轉錄組和代謝組聯合分析，解析差異基因的表達及差異代謝產物調控機制，為提高大寧曬煙黑脛病抗性的研究提供理論依據

材料與方法

1.1 試驗材料

煙草品種為大寧曬煙，由廣西壯族自治區煙草公司提供。煙草黑脛病病原菌由河南農業大學煙草學院微生物實驗室提供

1.2 試驗設計

試驗于2023年5月在河南農業大學許昌校區進行。采用盆栽試驗，設試驗組和對照組2個處理。大寧曬煙煙苗于5月1日移栽到盆內（ 49cm×31.5cm ，裝土量為 15kg ），移栽后 45d 試驗組煙苗接種疫霉菌，根據文獻「9并稍作修改，將煙草疫霉菌株接種于 10% V8液體培養基中，置于培養箱中 25^°C 培養 3d 后，將 10% V8培養基更換為無菌水培養，每 12h 更換無菌水；培養 ^48h 后制成 1×10⁶cfu/mL 孢子懸浮液，取10mL 懸浮液灌根接種。對照組以等量無菌水代替。接種病原菌5d后采集每株煙苗的第4到第6片葉中部，除去葉脈后混合作為一個生物學重復，每處理3次重復，其中對照組記作DN，試驗組記作DNi。樣品裝入無菌取樣袋，液氮冷凍后 -80°C 保存，用于轉錄組和代謝組分析。

1.3 測定指標及方法

1.3.1葉片RNA提取與測序將樣本在裝有液氮的研缽中磨碎，使用TRlzol試劑盒提取總RNA，用NanoDrop2000分光光度計和Agilent2000Bioanalyzer測定RNA純度、濃度并評估RNA完整性。將檢測合格的樣品委托上海歐易生物技術有限公司進行測序。

1.3.2 轉錄組測序分析利用llumina Novaseq6000測序平臺進行測序，使用fastp軟件去除低質量 reads 獲得Clean reads，使用HTSeq-count 得到基因的Reads計數后使用 R（v3.2.0） 對基因計數進行PCA分析并繪圖。利用DESeq軟件篩選P_adjlt;0.05 且 ∣log₂ （fold change） |gt;1 的基因定義為差異表達基因（DEGs）。基于超幾何分布算法將DEGs注釋到GO、KEGG數據庫中對其進行GO功能注釋和KEGG代謝通路富集分析。

1.3.3代謝組分析稱取 60mg 樣本并加人 600μL 甲醇-水（ V：V=7：3 進行研磨，冰水浴超聲提取30min ， -20^°C 靜置過夜后 離心 10min ，取上清液過濾后進行LC-MS分析。采用 Waters ACQUITY UPLCI-Class plus/Thermo QE超高效液相串聯高分辨質譜儀組成的液質聯用系統（ACQUITYUPLCHSST3）配備色譜柱（ 100mm× 2.1mm，1.8μm） ）進行分析。色譜條件為柱溫：45^°C ；流動相：A為 0.1% 甲酸水溶液，B為乙腈；流速為 0.35mL/min ;進樣體積為 4μL 。使用Progenesis QIv3.0 軟件（Nonlinear Dynamics，New-castle，UK）對原始數據進行處理，使用Lipidmaps（v2.3）和METLIN數據庫對化合物進行鑒定分析。采用無監督的主成分分析（PCA）觀察各樣本之間的總體分布和分析過程的穩定性。依據物質在不同樣本的表達量信息，采用層次聚類方法對物質和樣本進行分類。基于KEGG數據庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 健康煙株與感病煙株外觀差異

大寧曬煙感染黑脛病后，葉片萎蔫，下部葉片變黃枯萎，植株根基部或莖部變為黑色，維管束遭到破壞，髓部干縮成褐色碟片狀，碟片之間有白色菌絲（圖1）。維管束的破壞導致煙株不能正常運輸生長所需的養分和水分，最終引起煙株整體萎蔫死亡

2.2 轉錄組分析

2.2.1轉錄組數據質量評估由表1可知，每個樣品產生 （46.8～47.3）×10⁶ 條Clean Reads，GC含量為42.13%～42.67% ，且沒有出現AT/GC分離，Q30達到96% 以上。將CleanReads與煙草基因組比對后發現平均有 96.7% 的序列與煙草參考基因組序列相匹配，其中平均 87.32% 的序列比對到唯一位置，表明測序數據的質量和比對效果較好。PCA分析結果（圖2）顯示，大寧曬煙DN與DNi兩組樣本被明顯區分開，DN組和DNi組在第一主成分（PC1）存在顯著差異，解釋總變量的 67.65% 。

2.2.2差異表達基因聚類分析根據基因的表達量（FPKM值）進一步計算其在不同樣本間的差異表達倍數，對DN和DNi組RNA-seq數據進行對比，共篩選到7194個DEGs，其中DNi組有3250個顯著上調基因，占總DEGs的 45.18% ，有3944個顯著下調基因，占總DEGs的 54.82% （圖3）。對所有DEGs進行水平聚類分析（圖4）發現，大寧曬煙感染黑脛病之后表達量低的基因在未感病的葉片材料中表達量升高，而感染黑脛病后表達量高的基因在健康煙株樣本中表達量降低

2.2.3 差異表達基因的GO和KEGG分析DNvsDNi的差異表達基因GO富集分析共注釋到3123個條目，首先篩選出GO三大分類中DEGs數目大于5的條目，然后按照 P 值從小到大進行排序。基因產物功能描述分為3個層面：生物過程（biological process）、細胞組成（cellular compo-nent）和分子功能（molecularfunction）。根據DEGs數目和 P 值篩選出每個分類下TOP10的條目（圖5）。其中，在生物學過程中，DEGs主要參與光合作用（photosynthesis）和還原性戊糖-磷酸循環（reductive pentose-phosphate cycle）;在細胞組分方面，DEGs主要涉及葉綠體類囊體膜（chlo-roplast thylakoid membrane）和類囊體（thylakoid）;在分子功能方面，DEGs主要涉及DNA結合轉錄因子（DNA-binding transcription factor activity）。

KEGG通路富集分析結果（圖6）顯示，DEGs （Plant hormone signal transduction）、MAPK 信號通主要富集的信號通路為：植物激素信號轉導 路（MAPK signalingpathway-plant）、光合作用（Photosynthesis）、光合固碳（Carbonfixationinphotosyntheticorganisms）、亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism）、Phenylalaninemetabolism（苯丙氨酸代謝）、磷酸戊糖途徑（Pentosephosphatepathway）、 α- 亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism）及纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation）等。

2.2.4植物激素信號轉導相關差異表達基因植物防御反應通過復雜的植物激素介導的信號網絡進行調控，這些激素通過不同的信號轉導途徑相互作用，共同調節植物的生長發育。在本研究中，與健康煙株相比，感病煙株中茉莉酸（JA）信號轉導途徑的酰氨基合成酶基因JARI（Nitab4.5_0000305g0060 ）、關鍵轉錄抑制因子基因JAZ（Nit- Nit-4 . 5 -0 0 0 0 0 7 3 g 0 2 7 0 ） 和轉錄因子基因MYC2（Nit-ab4.5_000804g0160）均顯著上調；有4個DEGs參與水楊酸（SA）信號轉導途徑，其中轉錄因子基因TGA（ Nitab4.5 _ 0001472g0070、Nitab4.5_0000672g0160）、PR－1蛋白基因（Nitab4.5_ 均顯著上調；在脫落酸（ABA）信號轉導途徑中，蛋白磷酸酶基因PP2C（Nitab4.5_0005537g0010、Nitab4.5_0005632g0010、Nitab4.5_000714g0020、Nitab4.5_0008967g0020、Nitab4.5_0000153g0190、Nitab4.5_0000647g0160、Nitab4.5_0001231g0090、Nitab4.5_0000463g0070、Nitab4.5_0005987g0010）均顯著上調，PP2C去磷酸化后絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因SnRK2有 5 個 DEGs（Nitab4.5_0001684g0050、Nitab4.5_0002604g0060、Nitab4.5_0025725g0010、Nitab4.5_0008722g0010、Nitab4.5_0000786g0150）

顯著上調，而有2個 DEGs （Nitab4.5_0000905g0170、Nit-"a b"4 . 5_ 0 0 0 6 4 8 4 "g "0 0 1 0 ）"顯著下調；ABA反應元件結合因子基因！ ABF（Nitab4.50002760g0050） 、Nitab4.5_0007480g0030、Nitab4.5_0002543g0050、Nitab4 . 5 _ 0 0 0 3 0 8 0 g0 0 8 、 N i t a b "4 . 5 _ 0 0 0 2 8 7 g 0 2 4 0 ） 均顯著上調（圖7A）。

2.2.5苯丙烷類生物合成相關差異表達基因苯丙烷類生物合成途徑產生的次級代謝物在植物的生長發育和適應環境中均發揮重要作用。本研究中苯丙氨酸解氨酶基因PAL（Nitab4.5_0005320g0020 、Nitab4.5_0000101g0270）顯著上調，4-香豆酸輔酶a連接酶基因4CL（Nitab4.5_ 、肉桂醇脫氫酶基因CAD/SAD（Nitab4.5_0005392g0080、Nitab4.5_0003027g0020、Nitab4.5_0002815g0020）等關鍵基因在感染黑脛病的植株中強烈表達。查耳酮合成酶基因CHS（Nitab4.5_0002920g0060）、查耳酮-黃酮異構酶基因CHI（Nitab4.5_ 、黃酮醇合成酶基因 ）、類黃酮 3^′- 單加氧酶基因 F3^′H （Nitab4.5_ 也在感染黑脛病的植株中上調表達（圖7B）。

2.3 代謝組分析

2.3.1 樣本主成分分析 利用主成分分析法（principlecomponentanalysis）對代謝組數據進行降維，以盡可能多地反映原有的變量信息。PCA分析結果（圖8）顯示，兩個處理組組內3個樣本之間較為聚集，表明試驗結果較為穩定、重復性較好，兩組間數據在第一主成分PC1上存在顯著差異，解釋總變量的 91.1% 。

2.3.2差異代謝物分析DNvsDNi之間共檢測到3665個代謝物，以 ΔVIPgt;1 且 Plt;0.05 作為差異代謝物篩選標準，共有198個差異代謝物，其中有117個顯著上調，81個顯著下調，顯著上調差異代謝物較多（圖9）。

2.3.3 差異代謝物KEGG富集及關鍵代謝物分

析如圖10所示，大寧曬煙健康植株煙葉和感病植株煙葉差異代謝物的TOP20條代謝途徑中，其主要富集通路為氨酰基-tRNA生物合成（Amino-acyl-tRNA biosynthesis）、氰基氨基酸代謝（Cyano-aminoacidmetabolism）、ABC轉運蛋白（ABCtransporters）、芥子油苷生物合成（Glucosinolatebi-osynthesis）、苯丙烷類生物合成（Phenylpropanoidbiosynthesis）等。

在198個差異代謝物中，有11個在KEGG數據庫中得到注釋（圖11A），其中L-脯氨酸（L-Proline）、L-纈氨酸（L-Valine）、L-組氨酸（L-Histidine）L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、山奈酚（Kaempferol）、17-羥基亞麻酸（17-Hydroxylino-lenicAcid）、2S-氨基-3S-甲基戊酸（2s-Amino-3s-Methylpentanoic Acid）9s-hpotre、5-羥基-L-色氨酸（5-Hydroxy-L-Tryptophan）在感病煙葉中顯著積累，而亞精胺（Spermidine）和L-天冬氨酸（L-AsparticAcid）則顯著減少。

共檢測出9種苯丙烷類生物合成途徑產生的次級代謝物（圖11B），苯丙氨酸（L-Phenylala-nine）、3，4-Dihydro-2h-1-Benzopyran-2-One、Oleandolide、山奈酚（Kaempferol） ，2^′，7 -Dihydroxy -4^′- Methoxy-8-Prenylflavan 2^′ ，7-Diglucoside、Querce-tin 7-Methyl Ether 3-Alpha-L-Arabinopyranosyl-（1-gt;3） -Galactoside、蕓香苷（MarmesinRutino- 均顯著積累。side）、15，16-DihydrosacrolideA等在感病煙株中

2.4轉錄組學和代謝組學聯合分析

為解析煙草黑脛病的致病機制，對DNvsDNi的轉錄組和代謝組數據進行聯合分析，KEGG顯著富集的通路途徑主要包括氰基氨基酸代謝（Cyanoaminoacidmetabolism），芥子油苷生物合成（Glucosinolatebiosynthesis），氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine deg-radation）， ∝- 亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacid me-tabolism），精氨酸和脯氨酸代謝（Arginineand pro-linemetabolism），見圖12。由KGML網絡圖（圖13）可以看出大寧曬煙在疫霉侵染下功能蛋白和代謝物的網絡關系，差異表達基因和差異代謝物主要富集在光合生物中的碳固定（Carbon_fixation_in_photosynthetic_organisms）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（Cysteine_and_methionine_metabolism）、苯丙素生物合成（Phenylpropanoid_biosynthesis）等代謝途徑中。

3討論

3.1 植物激素信號轉導轉錄組分析

近年來，高通量技術的迅速發展為了解不同生物體分子調控機制和代謝調控網絡提供了技術支撐。轉錄組是某些特定組織或細胞在某種狀態下轉錄出來的所有RNA之和，轉錄組測序能夠在整體水平上研究差異基因的表達、種類和數量[10]，有助于深人了解大寧曬煙感病煙株與健康煙株在分子水平的差異。在逆境下，植物激素會在植物體內重新分布，通過運輸到達需要的位置，調節植物的生理過程。Caarls等[1]研究表明JA在植物抵御動物攝食和病原菌侵染過程中發揮著重要作用。本研究中，與健康煙株相比，感病煙株中JA信號轉導通路的酰氨基合成酶基因JARI、關鍵轉錄抑制因子基因 JAZ 和轉錄因子基因MYC2均上調表達。越來越多的研究表明SA是一類重要的抗逆因子，在植物抗逆中發揮著重要作用。SAR是植物獲得抗性的重要內源信號分子。霍瑞等[12]研究表明，通過激發子誘導煙草葉片后，SAR信號轉導途徑中的關鍵調控因子NPR1和EDS1均上調表達。本研究中有4個DEGs參與SA信號轉導途徑，其中轉錄因子基因TGA、PR-1蛋白基因均上調表達；在ABA信號轉導途徑中，蛋白磷酸酶基因PP2C均上調表達，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因SnRK2有5個DEGs上調表達而有兩個DEGs下調表達，ABA反應元件結合因子基因ABF均上調表達。大寧曬煙感病葉片中ABA的積累，促進了葉片的氣孔關閉，防止過多的水分散失，促進脅迫響應基因的表達，誘導滲透調節物的積累，從而降低滲透勢以維持水分獲取。Lackman 等[13]對JA誘導的ABA受體PYL4的鑒定證明，ABA和JA信號途徑存在一定的聯系。據Long等[14|研究表明ABA-JA的相互作用在植物抗病和抗逆性反應過程中都有重要的作用，發現ABA可能通過調節易感柑橘中JA的合成，促進晚錦橙對潰瘍病菌的易感性。此外，敲除擬南芥中的MYC2后，發現突變體中JA應答基因和ABA響應基因的表達均受到抑制，降低了突變體對干旱的耐受能力，說明JA-ABA在非生物脅迫反應和耐受中存在相互作用[15]。本研究證明大寧曬煙響應煙草疫霉侵染過程中激活了JA、SA和ABA信號途徑，這與孫嘉曼等[16的研究結果一致。

3.2 轉錄組與代謝組聯合分析

氨酰基-tRNA是蛋白質合成的重要中間體，能夠將氨基酸傳遞到核糖體上合成蛋白質，是一種與對應氨基酸相結合的 tRNA[17]。在植物受到非生物脅迫時，氨酰基-tRNA的合成和轉運對于植物的應激反應和適應能力至關重要。氰基氨基酸代謝主要包括氮類與氰基氨基酸的合成、氰基氨基酸的水解轉化以及產物的吸收與分布[18] O孫濤等[19]研究表明，枸杞接種尖孢鐮刀菌后產生的顯著差異代謝物主要富集在氨酰基-tRNA生物合成和氰基氨基酸代謝通路中。Yang等[20]研究證明，芥菜在鎘脅迫環境下，會通過調節氨酰基-tRNA生物合成、ABC轉運蛋白和氰基氨基酸代謝等通路來抵抗逆境脅迫。本研究中差異代謝物KEGG富集分析結果顯示，大寧曬煙感染黑腔病與健康煙株的顯著差異代謝物主要富集在氨酰基-tRNA生物合成、ABC轉運蛋白、氰基氨基酸代謝等通路中，這與上述研究結果一致。

新陳代謝是一個由復雜的生化反應網絡組成的生理過程，涉及許多細胞內和細胞間的反應。植物代謝分為初級代謝和次級代謝：初級代謝是將簡單有機分子轉化為復雜有機化合物的過程，是植物生長發育的必需，參與基本生命功能；次級代謝則是植物產生適應環境的特殊有機化合物的過程，具有生物活性，在植物生長發育和適應環境方面發揮重要作用[21-22]。藜麥在受到逆境脅迫時產生苯丙氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和脯氨酸等氨基酸，是藜麥抗逆境脅迫的關鍵代謝物質[23]。張莫凡等[24]研究發現，紫花苜蓿在淹水脅迫下，差異代謝物主要富集在氨基酸代謝途徑。沈秉娜等[25]研究指出，植物在遭遇逆境脅迫時，其防御系統會通過對氨基酸的合成和降解來減輕脅迫帶來的傷害。本研究轉錄組與代謝組聯合分析顯示，KEGG通路富集在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝等氨基酸代謝途徑，推測氨基酸代謝可能與大寧曬煙抵抗黑脛病脅迫有關。

植物在遇到生物與非生物逆境時會激活自身的防御系統，包括相關防御基因的活化、細胞壁加固以及合成植保素和其他抗菌物質等次生代謝產物的多方面協同作用[26]。Huang等[27]研究表明，苯丙烷類生物合成途徑在植物抗病過程中起重要的調控作用。Beyer等[28]研究發現，擬南芥響應大豆銹病菌侵染時可激活苯丙烷類生物合成途徑相關基因的表達，表明該途徑在植物抵御病原菌侵染過程中發揮著重要作用[29]。本研究中苯丙氨酸解氨酶基因PAL上調表達，4-香豆酸輔酶a連接酶基因4CL、肉桂醇脫氫酶基因 CAD/SAD 等苯丙烷類生物合成途徑的關鍵基因在感染黑脛病的植株中強烈表達，這些基因參與木質素聚合物合成，在抗性反應激活過程中可加固植物的細胞壁，從而起到抵御病原菌侵染的作用。參與類黃酮合成途徑的查耳酮合成酶基因CHS、查耳酮-黃酮異構酶基因 CHI， 黃酮醇合成酶基因FLS、類黃酮3'-單加氧酶基因 F3^′H 也在感染黑脛病的植株中顯著上調表達，在植物應對逆境脅迫時發揮重要作用。苯丙烷類生物合成途徑產生的苯丙氨酸等9種次級代謝物在感病煙株中顯著積累。Zhang等[30]在抗黑脛病煙草品種和感病品種根系分泌物的研究中發現，苯丙烷以及水楊酸、脂肪酸、茉莉酸等物質在不同品種根系分泌物中有著顯著差異，表明這些物質可能參與了煙草防御反應。Jadhav等[31]研究表明，苯丙烷合成通路在植物抗病過程中具有重要地位，其中酚類、植物抗毒素、木質素以及類黃酮等主要的防御性化合物均需通過該通路合成。上述結果表明，在大寧曬煙應對煙草疫霉侵染的過程中，苯丙烷類生物合成途徑是植物防御機制的重要組成部分。

4結論

本研究對大寧曬煙健康煙株與感染黑腔病煙株的葉片進行轉錄組測序，篩選出7194個顯著差異表達基因，其中有3250個顯著上調和3944個顯著下調；代謝組學共檢測到3665個代謝物，共有198個差異代謝物（ VIP?1 且 Plt;0.05， ，有117種顯著上調，81種顯著下調，其中有9種苯丙烷類生物合成途徑的次級代謝物。通過轉錄組和代謝組聯合分析發現，氨酰基-tRNA生物合成，氰基氨基酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝等代謝途徑可能與大寧曬煙抵抗黑脛病脅迫相關。通過分析植物激素信號轉導和苯丙烷類生物合成途徑中差異基因的表達變化，發現調控茉莉酸、水楊酸、脫落酸信號轉導以及木質素、類黃酮等苯丙烷類生物合成的基因顯著上調表達。代謝組分析發現苯丙烷類生物合成產生的次級代謝物顯著富集，證明植物激素信號轉導和苯丙烷類生物合成在大寧曬煙響應疫霉侵染的過程中發揮著重要作用。

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