硅膠固相萃取結合氣相色譜-質譜法同時測定淡水魚中的4種土腥味物質

我國淡水魚產量是水產品產量最大的一個品類，占淡水產品總產量的 80% 以上，占全國水產總產量的 40% 以上，是我國水產的支柱產業。目前，土腥味問題已嚴重影響淡水魚的品質，尤其是夏秋季，池塘[1]、水庫[2]及循環水養殖系統[3-4]產出的淡水魚都存在此問題，而且循環水養殖等集約化的養殖模式使得此問題更加嚴重[46]，甚至在低鹽度循環水養殖的海水魚體內也存在土腥味物質[7]。能夠產生土腥味的化合物主要包括土臭素（Geosmin，GSM）、2-甲基異冰片（2-Methylisoborneol，MIB）、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪（2-Isopropyl-3-methoxypyrazine，IPMP）和2-異丁基-3-甲氧基吡嗪（2-Isobutyl-3-methoxypyrazine，IBMP）等[8-11]，這些物質主要來源于藍藻[1，12-14]和細菌[15-18]等的次級代謝產物。人體感官對土腥味比較敏感，虹鱒中GSM的閾值為 0.9μg/kg^[19] ，斑點叉尾中MIB的閾值為 0.7μg/kg^[19] 。目前關于魚體中土腥味物質的檢測方法主要是針對GSM和MIB，對于IPMP和IBMP的研究很少，因此亟需建立檢測范圍更廣的可靠方法以滿足相關檢測需求。

目前，土腥味物質的檢測方法主要是氣相色譜-質譜法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[20]，氣相色譜法（Gas chromatography，GC）[21]使用較少。淡水魚中 GSM和MIB 的富集方法主要是微波蒸餾結合頂空固相微萃取法[22-23]，也有研究采用微波輔助吹掃捕集法[20]、攪拌棒吸附法[24]和分散固相萃取法[25]等。目前報道最多的微波蒸餾-固相微萃取法和微波輔助吹掃捕集法，其富集系數高，但用同一吸附材料吸附多個樣品易造成交叉污染；同時，由于土腥味物質不易從魚肉中揮發出來，需要借助微波加熱促使其揮發，但微波蒸餾裝置復雜，不易實現批量處理。攪拌棒吸附法操作簡單，但回收率低且處理多個樣品時易交叉污染；分散固相萃取法無需微波蒸餾且易批量處理，但濃縮倍數低。

基于目前檢測方法存在的問題，本研究針對淡水魚中土腥味物質GSM、MIB、IPMP和IBMP的提取、凈化和濃縮等步驟進行了優化。基于正己烷提取、石墨化炭黑凈化和硅膠SPE凈化濃縮，結合GC-MS法，建立了一種同時測定淡水魚中4種土腥味物質GSM、MIB、IPMP和IBMP的分析方法，為開展淡水魚質量評價、土腥味物質含量與感官關系的評估及脫腥效果的研究提供了有效的手段，也為其它環境和生物體中土腥味物質的檢測提供了新思路。

1 實驗部分

1. 1 儀器與試劑

TSQQUANTUMGC氣相色譜-質譜聯用儀（美國賽默飛世爾科技公司）；半自動固相萃取儀（美國Supelco公司）；CF16RXⅡ離心機（日本HITACHI公司）；硅膠固相萃取柱（ 500mg/3mL ）和石墨化炭黑（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

正己烷和乙酸乙酯（色譜純，美國J.T.Baker公司）；MIB、GSM、IPMP和IBMP標準溶液（ 100μg/mL ，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。實驗用草魚購于上海江陽水產批發市場。

1.2 標準溶液配制

分別準確吸取 100μg/mL 的GSM、MIB、IPMP和IBMP標準溶液各 0.5mL ，用正己烷定容至 50mL ，配制成 1.0μg/mL 的混合標準中間液，于 -18°C 保存。

分別準確吸取適量混合標準中間液，用正已烷稀釋成一系列質量濃度（0.5、1、2、5、20、50、100和 200ng/mL ）的混合標準工作液，于 -18°C 保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取濃縮

淡水魚去除頭、骨及內臟，取肌肉部分均質混合均勻后備用。稱取 5.00g 樣品，加人 10mL 正己烷充分振蕩，超聲 15min ， 8000r/min 離心 8min ，取上清液至 50mL 離心管中，用 10mL 正已烷重復提取1次，合并提取液。

在提取液中加入 0.5g 石墨化炭黑，振蕩 5min ， 4000r/min 離心 5min 。所得上清液全部加入到用正己烷活化后的硅膠SPE柱中，用 3mL 正已烷淋洗，然后吹干固相萃取柱，采用 1.5mL 正己烷-乙酸乙酯（4：1，V/V）洗脫，擠干SPE柱，洗脫液漩渦混合后，用GC-MS測定，外標法定量。

1.3.2 儀器分析條件

采用HP-5MS熔融石英毛細管柱 （30m×0.25mm×0.5μm ）分離目標物。氣相色譜條件為：以氮氣（純度 599.99% ）為載氣，恒流模式，不分流進樣，柱流量為 1.0mL/min ，進樣口溫度為 250^qC 。升溫程序：初始溫度 50^qC ，保持 1min ；以 升至 180^qC ，保持 1min ；以 升至 280°C ，保持 5min 0

在質譜分析中，采用電子轟擊離子源（Electron impactionsource，EI），電子能量為 70eV ，離子源溫度為 250^qC ，傳輸線溫度為 280^°C 。采用選擇離子監測（Selected ionmonitor，SIM）模式采集數據，各目標物的選擇離子見表1。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

進樣口溫度和柱初始溫度對GC-MS測定GSM、MIB、IPMP和IBMP的信號都有影響，因此需要對其進行優化。

采用 50ng/mL 的4種土腥味物質標準溶液進行儀器分析，對比了不同進樣口溫度（200、230、250和 270°C ）時的檢測結果，發現不同進樣口溫度對4種土腥味物質的檢測信號有不同影響。GSM和MIB在此范圍內峰面積和峰高變化不大，但IPMP和IBMP的峰面積和峰高均先隨著進樣口溫度升高而增大，隨后又下降，在 250^qC 時達到最大。因此，選擇 250^°C 作為進樣口溫度。

考察不同初始柱溫（40、50、60、70、80和 100^°C ）對檢測的影響，發現不同柱初始溫度對4種土腥味物質的檢測信號影響表現一致，各物質峰面積隨著柱初始溫度升高而增大，在 50^qC 之后增加緩慢；峰高先增大后減小，在 50^qC 時最高。因此，選擇柱初始溫度為 50^qC 。

2.2QuEChERS凈化材料的選擇

常用的QuEChERS凈化材料有 C₁₈ ！ N. -丙基乙二胺（Primary secondaryamine，PSA）、石墨化炭黑（Graphitizing of carbonblack，GCB）和無水 MgSO₄ 。考察了 0.5gC₁₈ 、PSA、GCB和 無水 MgSO₄ 對50ng/mL 的GSM、MIB、IPMP和IBMP正已烷溶液的吸附性能，結果見圖1。GCB對4種目標物的吸附率均小于 1% ; C₁₈ 不吸附GSM和MIB，對IPMP和IBMP的吸附率分別為 19.8% 和 24.5% ；PSA 對GSM、IPMP和IBMP的吸附率小于 4% ，對MIB的吸附達到 14.2% ；無水 MgSO₄ 基本不吸附GSM和MIB，對IPMP和IBMP的吸附率分別達到 64.3% 和 90% ；4種凈化材料的組合對GSM、MIB、IPMP和IBMP的吸附率分別為 11.4% 、 24.6% ！ 46.2% 和 78.3% 。綜上，除GCB外，其它常用的QuEChERS凈化材料對4種目標物均有較明顯的吸附。為了減少目標物損失，本研究選擇GCB作為凈化材料。

2.3 濃縮材料的選擇

通過 0.5g 中性氧化鋁、弗羅里硅土和硅膠在正己烷和乙酸乙酯中對 50ng/mL 的GSM、MIB、IPMP和IBMP的吸附回收實驗發現，中性氧化鋁在乙酸乙酯中對4種目標物的回收率均可以達到 92.6% 以上，但是在正已烷中的吸附率不同，其可以完全吸附GSM和MIB，但是對IPMP和IBMP的吸附率分別只有 39.4% 和 48.4% 。弗羅里硅土在乙酸乙酯中對4種目標物的回收率為 92.8%～99.1% ，在正已烷中對

IPMP和IBMP的吸附率分別為 97.5% 和 98.8% ，但對GSM和MIB的吸附率只有 66.7% 和 79.8% 。硅膠在乙酸乙酯中對4種目標物的回收率為 95.0%～99.3% ，在正已烷中對4種物質的吸附率為 99.5%～100% ，實驗結果見圖2。綜上，中性氧化鋁、弗羅里硅土和硅膠在乙酸乙酯中對4種目標物的回收率均大于92.6% ，但在正己烷中表現出不同的吸附性能，其中，中性氧化鋁對IPMP和IBMP的吸附率低于 50% ，弗羅里硅土對GSM和MIB的吸附率低于 80% ，硅膠對4種目標物的吸附率均高于 99.5% 。綜合上述結果，最終選擇硅膠作為濃縮材料。

2.4 洗脫劑的優化

采用 1mL 不同體積比的正己烷-乙酸乙酯（1：2、1：1、2：1、3：1、4：1）對吸附了 50ngGSM 、MIB、IPMP和IBMP的硅膠SPE柱進行洗脫，洗脫率結果見圖3。不同體積比的正已烷-乙酸乙酯對4種土腥味物質目標物的洗脫率均大于 85% ，隨著洗脫劑中正己烷比例增加，洗脫率逐漸增大。采用正己烷/乙酸乙酯（4：1，V/V）作為洗脫劑時，4種目標物的洗脫率在 98.1%～99.0% 之間，洗脫率高且均衡。

2.5 硅膠SPE柱填料量的選擇

SPE的吸附量與填料的量呈正比，將目標物全部洗脫的最小洗脫劑用量與填料量呈正比，濃縮倍數與洗脫劑用量呈反比，所以為了獲得更高的濃縮倍數，需要選擇可以將目標物全部吸附的最小填料量的SPE柱，再采用最小量的洗脫液對目標物進行洗脫，從而獲得更大的濃縮倍數。通過柱前加標的方式對比了不同填料量（ 100mg/1mL 、200和 500mg/3mL ）SPE柱對實際加標樣品的回收率，發現 100mg/1mL 和 200mg/3mL 兩種型號的SPE柱對GSM、MIB、IPMP和IBMP的回收率均小于 72.9% ，對于GSM的回收率只有 26.6% ，這可能是由于實際樣品中存在很多的雜質，會競爭目標物的結合位點，而GSM的結合比較弱，所以當填料量不足時，其穿透比較嚴重，導致回收率偏低，因此需要繼續增加硅膠 SPE柱的填料量。實驗結果表明， 500mg/3mL 填料量的SPE柱對4種目標物的回收率均大于 92.8% 。因此，本研究選擇 500mg/3mL 填料量的SPE柱進行后續實驗。

2.6 基質效應

前處理方法是影響基質效應的重要因素，凈化越徹底，雜質越少，基質效應也相應降低；凈化步驟太多，會導致目標物在操作過程中損失，所以需要平衡基質效應和凈化方法。本研究選擇草魚為對象研究基質效應。對草魚進行前處理時，分別采用硅膠SPE（S）、 GCB+ 硅膠 SPE（G+S） 和 C₁₈+GCB+MgSO₄+ 硅膠SPE（ C+G+M+S， 進行凈化濃縮，得到不同的草魚空白基質液，用其配制 100ng/mL 的基質標準溶液與同濃度的純溶劑標準溶液進行基質效應對比。如圖4所示，IBMP的基質效應比較小，GSM、MIB和IPMP的基質抑制效應隨著凈化材料使用增多而減小。以S得到的空白基質液配制的標準溶液，GSM、MIB和IPMP均存在不同程度的基質抑制效應，分別為 14.6% 、 3.5% 和 5.0% 。與以S得到的空白基質液配制的標準溶液的基質效應相比，4種目標物以 G+S 得到的空白基質液配制的標準溶液的基質效應，IBMP變化不大，GSM、MIB和IPMP的基質抑制效應減小了 1.6%～8.0% ，表明實驗過程中有必要采用GCB凈化。

2.7 方法驗證

采用GC-MS測定以正已烷配制的系列混合標準工作液，以目標物濃度為橫坐標、目標物色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算相關系數，采用空白基質加標，以 S/N?3 和 S/N?10 所對應的土腥味物質的濃度為方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。GSM、MIB、IPMP 和IBMP的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限見表2。結果表明，4種土腥味物質在 0.5～200ng/mL 濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數 （R²） 均大于0.997。GSM和MIB的LOD和LOQ分別為0.6和 1.0μg/kg ， IPMP 和IBMP 的LOD和LOQ分別為0.2和 0.6μg/kg 。

以空白草魚為基質，進行5個濃度水平（0.6、1.0、2.0、10和 20μg/kg ）的加標回收實驗，加標色譜圖見圖5，結果見表3。GSM的回收率為 77.5%～103.0% ，相對標準偏差（RSD）為 2.04%～9.42% ；MIB的回收率為 85.8%～103.0% ，RSD為 2.26%～5.54% ；IPMP的回收率為 81.3%～96.2% ，RSD為 1.56%～4.16% ；IBMP的回收率為 82.2%～112.0% ，RSD為 2.74～6.19% 。結果表明，本方法對4中土腥味物質的回收率在77.5%～112.0% 之間，RSD在 1.56%～9.42% 之間，說明本方法具有較高的準確性、可重復性和可行性，方法檢出限低于人體感官閾值，可用于測定淡水魚體中的土腥味物質。

2.8 不同方法的對比

將已報道的關于魚體中土腥味物質檢測的不同方法與本方法進行對比，結果見表4。MAE-SPME-GC-MS 法[23]富集系數高，檢測靈敏度高，是應用于土腥味物質GSM和MIB檢測研究最多的方法，但由于微波蒸餾和 SPME吸附的局限性，該方法在實際應用中受限。MA-PT-GC-MS 法[20]需要專用設備，費用昂貴，所以普及性也不高。SBSE-GC-MS法[24]不采用微波蒸餾，回收率低于 30% 。DSPE-GC-MS法[25]采用乙腈提取凈化后直接測定，方法簡單易操作，但未采用濃縮方法，富集倍數小。目前已報道的土腥味物質檢測方法中的目標物只有GSM和MIB，本研究建立了檢測GSM、MIB、IPMP和IBMP的方法，適用范圍更寬，且本方法采用正已烷提取凈化濃縮后測定，濃縮倍數是DSPE-GC-MS[25]的8.3倍，方法的準確度、精密度和靈敏度均滿足測定要求，操作簡單，易實現批量操作，在淡水魚中4種土腥味物質的測定方面具有潛在的應用價值。

3 結論

本研究將正己烷提取、石墨化炭黑凈化和硅膠SPE濃縮相結合，建立了可同時測定淡水魚中4種土腥味物質GSM、MIB、IPMP和IBMP的GC-MS法，為擴大淡水魚土腥味物質研究對象提供了方法基礎。

本方法中的硅膠SPE除了具有凈化作用外，還起到濃縮作用，解決了半揮發性物質在常用濃縮方法氮吹和旋轉蒸發中易揮發的難題。為了保證對實驗過程進行有效監控，可以通過陽性質控樣品或者空白樣品加標的方式對實驗過程進行質量控制，確保實驗結果的準確性。本方法準確度好、精密度高、重復性好，可以實現淡水魚中土腥味物質的批量測定，同時也為其它半揮發性物質的測定提供了新思路。

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Simultaneous Determination of Four Off-flavors in Freshwater Fish by Gas Chromatography-Mass Spectrometry Combined with Silica Solid Phase Extraction

TIAN Liang-Liang1，HUANG Dong-Mei2， WANG Yuan2，HUANG Xuan-Yun2， SHI Yong-Ful，YE Hong-Li*1

¹ （Key Laboratory of Oceanic and Polar Fisheries，Ministry of Agriculture and Rural Affirs， East China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Shanghai 2Ooo90， China） （204號 ² （Key Laboratory of East China Sea Fishery Resources Exploitation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， East China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Shanghai 2Ooo90， China）

AbstractAn effective method for simultaneouslydetecting four semivolatileearthy-musty odors in freshwater fish by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was developed. The concurrent extraction of geosmin （GSM），2-methylisoborneol （MIB），2-isopropyl-3-methoxypyrazine （IPMP），and2-isobutyl-3-methoxypyrazine （IBMP） in fish tissue was conducted with n -hexane. The optimized QuEChERS material was implemented， and it was found that C₁₈ ， primary secondary amine （PSA） and MgSO could adsorb the target analytes in n -hexane. So only the graphitized carbon black （GCB）could be used to purify the extraction.The adsorption rates of different materials for the four kinds of odors materials were explored in n -hexane and ethyl acetate. The experimental results revealed that the adsorption rates of silica for the four targets were 99.5%-1O0% in n -hexane and 0.7%- （20 5.0% in ethyl acetate respectively. Then the silica solid phase extraction （SPE） method was utilized to eluent the compounds using 1.0mLn -hexane/ethyl acetate in different proportions.The results of the comparative analysis demonstrated that n -hexane/ethyl acetate （4：1，V/V） was the optimized eluent.Based on the obtained results， （204 n -hexane extraction and GCB purification combined with silica SPE were used to isolate GSM，MIB，IPMP and IBMP from fish and the method was validated.It was found that the method showed good linearity in the range of （2號 0.5-200ng/mL ，and with detection limits of 0.6μg/kg for GSM and MIB， 0.2μg/kg for IPMP and IBMP. The limits of quantitation （LOQ） were 1.0μg/kg for GSM and MIB， 0.6μg/kg for IPMP and IBMP. Good recoveries （ 77.5%- 1 （204號 112.0% ）and relative standard deviations （1.56%- 9.42% ）were also obtained. The use of silica SPE greatly mitigated the issue that the off-flavor compounds were easily lost in the gas blowing concentration process.There was no cross contamination in this method because the sample pretreatments were conducted separately，which was different with the most commonly used HS-SPME methodfordetecting semi-volatile substances.The sensitivity of this method was high enough to produce good quantitative results below the odor thresholds of the examined offflavor compounds.

KeywordsOdors; n -Hexane; Silica solid phase extraction; Gas chromatography-mass spectrometry; Fresh water fish