指狀青霉拮抗放線菌R2A-77的鑒定及發酵條件優化

摘" 要：柑橘是我國優勢水果產業，對推動鄉村振興具有重要意義。但柑橘表面存在許多自然孔口，在采后貯藏和運輸過程中極易受到病原菌的侵染而發生病害。其中，柑橘綠霉病是由指狀青霉（Penicillium digitatum）侵染而成，發病過程快，傳染性強，造成果實采收后品質嚴重下降，給柑橘產業帶來巨大的經濟損失。本團隊以柑橘綠霉病病原菌為靶標菌，從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株的根部土壤中分離篩選出1株對柑橘綠霉病病原菌具有良好拮抗作用的放線菌R₂A-77，對菌株進行形態學觀察、生理生化特征和分子生物學鑒定，采用生長速率法對靶標菌生長圈直徑判斷發酵液的抑菌活性，采用單因素和交叉組合試驗優化菌株發酵條件，以提高發酵液抑菌活性。結果表明：放線菌R₂A-77初步鑒定為鏈霉菌屬（Streptomyces）；最優發酵培養基為蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨35 g/L、蒸餾水1000 mL；最優發酵條件為發酵初始pH 7.0、發酵時間為6 d、接種量為3%、裝液量為150 mL/250 mL；放線菌R₂A-77發酵條件優化后，其發酵液的抑菌活性比優化前提高15%，抑菌率為98%。結果說明，放線菌R₂A-77對指狀青霉具有較好的拮抗效果，有較好的實際應用前景，該研究結果為綠色防控柑橘綠霉病積累了資源，為后期規模化發酵以及生防菌劑的開發奠定基礎。

關鍵詞：指狀青霉；鏈霉菌屬；分類鑒定；抑菌活性；發酵優化中圖分類號：S436.66；S476.1 """""文獻標志碼：A

Identification and Optimization of Fermentation Conditions of Antagonistic Actinomycete R₂A-77 by Penicillium digitatum

HUANG Jili， LUO Dongcheng， CHEN Yuanling， TANG Shi， CHEN Zhenfeng， LIANG Jiazhen，YANG Chunmin， XIE Yuxuan^*

Guangzhou College of Technology and Business， Foshan， Guangdong 528135， China

Abstract： Citrus is a dominant fruit industry in China， which is of great significance for promoting rural revitalization. However， there are many natural pores on the surface of citrus fruits. During post-harvest storage and transportation， they are highly susceptible to infection by pathogens， leading to diseases. Among them， citrus green mold is caused by the infection of Penicillium digitatum. The disease progresses rapidly and is highly contagious， severely deteriorating the quality of fruits after harvest and causing huge economic losses to the citrus industry. Our research team targeted the pathogen of citrus green mold. An actinomycete strain， R₂A-77， which exhibits excellent antagonistic effects against the pathogen of citrus green mold， was isolated and screened from the rhizosphere soil of red-orange plants in the Jiuzhoujiang Red-orange Orchard in Lianjiang， Zhanjiangy， Guangdong. The strain was characterized through morphological observation， physiological and biochemical tests， and molecular biological identification. The antibacterial activity of the fermentation broth was determined by measuring the diameter of the growth inhibition zone of the target bacteria according to the growth rate method. Single-factor and cross-combination experiments were conducted to optimize the fermentation conditions of the strain， aiming to enhance the antibacterial activity of the fermentation broth. The results indicated that the actinomycete R₂A-77 was preliminarily identified as the genus Streptomyces. The optimal fermentation medium was sucrose 10 g/L， soybean peptone 35 g/L， and distilled water 1000 mL. The optimal fermentation conditions were as follows： initial pH of 7.0， fermentation time of 6 days， inoculum size of 3%， and liquid volume of 150 mL in a 250 mL flask. After optimization， the antibacterial activity of the fermentation broth of actinomycete R₂A-77 increased by 15% compared to that before optimization， with an antibacterial rate of 98%. The results suggest that actinomycete R₂A-77 has a good antagonistic effect against P. digitatum， demonstrating promising practical application prospects. It would accumulate resources for the green prevention and control of citrus green mold and lays a foundation for large-scale fermentation and the development of microbial agents in the future.

Keywords： Penicillium digitatum; Streptomyces; classification and identification; antimicrobial activity; fermentation optimization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.08.017

放線菌是一類極具開發潛力的生物資源，在空氣、土壤以及水體中均可生存，且具有生長速度快和代謝產物多等特點，已被廣泛應用于食品、藥品和農業等領域^[1-2]。目前，利用生防放線菌與病原菌的競爭關系或拮抗作用來控制病害已成為研究熱點^[3-4]。已有研究表明，放線菌發酵液對辣椒白絹病菌（Sclerotium rolfsii）^[5]、山茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）^[6]、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）^[7]等植物病原菌具有良好的抑菌活性。在公眾對食品安全關注度持續攀升的當下，利用生物手段防治農作物病害，已成為農業微生物領域的關鍵研究課題^[8-9]。

指狀青霉（Penicillium digitatum）是一種壞死營養型的病原真菌，可通過果實表面的損傷入侵果實內部組織，導致宿主細胞死亡，進而利用營養進行生長^[10]。柑橘在田間生長、采收及貯藏運輸過程中極易受到物理損傷而產生傷口^[11]，這為病原微生物的入侵創造了條件，最終導致果實腐爛，造成嚴重的經濟損失。長期以來，國內外對水果病害的防治主要依賴化學殺菌劑，但長期使用化學殺菌劑不僅會導致病原菌產生耐藥性而降低防治效果，還會嚴重危害人體健康和環境^[12]。而生物防治法采用具有安全性、有效性、環保性和高經濟效益優勢的拮抗微生物，可實現農業的安全生產^[13]。NAJMEH等^[14]從農田土壤中分離出的110株鏈霉菌菌株對指狀青霉具有良好的抑制作用。林書華等^[15]揭示了鏈霉菌X33發酵提取物（SLFE）對柑橘綠霉病菌具有防治效果。本團隊從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株根部土壤中分離篩選出1株對指狀青霉具有較好拮抗活性的放線菌R₂A-77，本研究對該菌株進行鑒定以及發酵條件優化，為廉江紅橙土壤微生物資源及活性物質的開發奠定基礎。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 供試菌株和病原真菌 "從廣東省湛江市廉江九州江紅橙園紅橙植株根部土壤分離篩選出放線菌R₂A-77。指狀青霉由西南大學食品科學學院曾凱芳教授惠贈。

1.1.2" 培養基" 菌株鑒定固體培養基：ISP系列培養基（ISP1～ISP7）^[16]、PDA培養基、R₂A培養基^[17]、GA培養基^[18]、改良G2培養基^[19]、MS培養基^[20]、NA培養基^[21]、黑色素培養基、硫化氫培養基、明膠液化培養基、牛奶凝固與胨化培養基^[22]。

菌株液體發酵培養基：ISP系列培養基（ISP1～ISP7）、PDA培養基、GA培養基、改良G2培養基、MS培養基。

生長培養基：改良G2培養基。

1.2" 方法

1.2.1" 菌株鑒定" （1）形態學觀察。將菌株劃線接種至ISP3固體培養基，28"℃條件培養5 d，用掃描電鏡觀察菌絲特征及孢子形態。

采用固體培養基（固體培養基見1.1.2）劃線接種菌株，在28"℃下培養10 d。在第3、5、7、10天采用平皿插片法和光學顯微鏡觀察菌株菌體形態，篩選出菌株最優生長培養基作為基礎培養基。

（2）生理生化特征測定。參考文獻[22]中的方法對菌株的生理生化特性進行測定。測定內容包括：最適溫度、最適鹽濃度、最適培育pH、過氧化氫酶的產生、黑色素/硫化氫的產生、明膠液化、牛奶凝固或胨化。

（3）16S rRNA基因序列測定與分析。將菌株送至北京擎科生物科技有限公司進行16S rRNA基因序列測定。測序結果與EzBioCloud數據庫進行比對，篩選相似菌株。采用MEGA 11軟件進行鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）系統發育分析，設置1000次bootstrap評估拓撲結構，構建16S rRNA基因的系統發育樹，確定菌株的種屬。

1.2.2" 菌株抑菌能力測定" （1）菌種活化和制備種子液。菌種活化：將菌種接種至改良G2固體培養基中，于28"℃培養5 d。

制備種子液^[23]：將菌株接種至150"mL/250"mL的改良G2液體培養基中，于28"℃、180 r/min搖床培養3 d。

（2）制備菌株無菌發酵液。將3%的種子液加入到150 mL/250 mL發酵培養基中，于28"℃、180"r/min培養5"d。取發酵上清液，于10 000 r/min離心15 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾后得到無菌發酵濾液^[24]。

（3）發酵液抑菌活性測定。采用生長速率法^[25]測定菌株發酵液對靶標菌的抑菌活性。發酵液與PDA培養基按1∶10（V/V）制成平板。將8 mm靶標菌菌餅置于平板中央，于28"℃培養5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算平均值和抑菌率。抑菌率=[（對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/（對照病原菌菌落直徑–菌餅直徑）]× 100%^[26]。

1.2.3" 菌株發酵培養基優化及發酵條件優化" （1）菌株發酵培養基的優化。將11種不同的液體培養基各100 mL分別添加至250 mL 錐形瓶中，然后加入種子液發酵，參照1.2.2-（3）的方法測定抑菌活性，篩選出最優的培養基作為后續試驗的基礎培養基。

采用單因素試驗法，在篩選出的基礎培養基上，以葡萄糖、大米、小米、玉米面、蔗糖、燕麥、麥芽糖、淀粉、乳糖、甘露醇作為碳源；以酸水解酪蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、硫酸銨、酵母膏、胰蛋白胨、大豆粉、魚蛋白胨、麥芽粉、蛋白胨作為氮源，參照1.2.2-（3）的方法測定抑菌活性，篩選出3種較好的氮源和碳源。

利用交叉組合試驗，將篩選出的3個碳源和3個氮源進行交叉組合，確定最優的碳源和氮源組合，參照1.2.2-（3）的方法進行抑菌活性測定，得到最優碳氮源組合。

以最優碳氮源組合固定碳源或氮源，將氮源或碳源濃度分別設置為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，參照1.2.2-（3）的方法測定抑菌活性，確定最優碳源、氮源濃度為最優發酵培養基配方。

（2）菌株發酵條件的優化。在最優發酵培養基下，優化菌株的發酵條件。采用單因素試驗，分別選擇不同的發酵初始pH：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；不同的發酵時間：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d；不同的接種量：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；250 mL錐形搖瓶中不同的裝液量：75、100、125、150、175、200 mL^[27]。參照1.2.2-（3）的方法測定抑菌活性，確定最優發酵初始pH、發酵時間、接種量和裝液量。

1.3" 數據處理

采用Excel 2019軟件進行數據統計，采用IBM SPSS Statistics 27軟件進行顯著性分析。

2" 結果與分析

2.1" 形態學觀察

在ISP3培養基上，放線菌R₂A-77單菌落形態呈圓形，氣生菌絲生長繁茂，產生密集孢子堆，菌落呈現灰棕色。通過掃描電鏡觀察可知，菌株菌絲眾多，孢子鏈伸展，形狀為長圓形（圖1）。

放線菌R₂A-77菌株在不同鑒定培養基上的生長存在明顯差異，其氣生菌絲、基內菌絲的生長狀況等方面均有差異，在ISP1、ISP2、ISP6、ISP7培養基上產生可溶性黃色色素，在ISP1、ISP3、R₂A、MS培養基上生長旺盛（表1）。

相較于其他培養基，放線菌R₂A-77菌株在MS培養基上的生長狀況較好（圖2），菌落顏色為灰白色，形狀為圓形，菌落易挑起，氣生菌絲呈灰白色，基內菌絲呈乳黃色，無可溶性色素。因此，確定放線菌R₂A-77菌株的最適生長培養基為MS培養基。

2.2" 生理生化特征

放線菌R₂A-77菌株在37"℃時生長狀態最佳，低于19"℃和高于40"℃時菌株停止生長。NaCl的濃度為0%時，生長狀態最佳，培養4 d便有大量孢子覆蓋于菌落表面，形成表面干燥、凸起、灰白色的圓形菌落；NaCl濃度為0%～1%時菌株生長，2%時完全停止生長。菌株在pH為5.0～12.0時均能生長，且pH為5.0時菌落較大，產孢子豐富，生長狀況最佳。

放線菌R₂A-77菌株可使明膠液化，可產過氧化氫酶，但無法使牛奶凝固或胨化，同時也不產硫化氫和黑色素。

2.3 "16S rRNA基因測序結果

通過序列測定，放線菌R₂A-77菌株的16S rRNA基因長度為1446 bp，且完整性為99.8%。通過EzBioCloud平臺對放線菌R₂A-77菌株進行16S rRNA基因序列比對，與該菌株高度同源的菌株均來自鏈霉菌屬（Streptomyces）。其中，與放線菌R₂A-77最相似的菌株為S. salinarius SS06011，相似度為99.93%，其GenBank登錄號為LC430995。

基于16S rRNA基因序列建立系統發育樹中（圖3），經過1000次聚類，菌株與S. salinarius SS06011進化關系最近。經形態學觀察、生理生化特征檢測，結合16S rRNA序列測序與系統進化分析，確定放線菌R₂A-77為鏈霉菌（Streptomyces）。

2.4 "放線菌R₂A-77菌株發酵培養基的優化

2.4.1" 基礎培養基 "通過對11種不同的液體培養基發酵液進行抑菌活性測定（圖4），結果表明，放線菌R₂A-77菌株在不同的發酵培養基中的抑菌活性具有一定差異，在MS培養基中的抑菌活性最優，指狀青霉生長圈平均直徑為20.54"mm。基于此，選定MS培養基作為基礎培養基。

2.4.2" 碳源" 以MS培養基作為基礎培養基，分別采用10種不同碳源進行抑菌活性測定（圖5）。結果表明，在以玉米面、蔗糖、淀粉為碳源發酵液中，指狀青霉生長圈平均直徑分別為16.58、16.37、16.79 mm，具有較強的抑菌活性，因此選用玉米面、蔗糖、淀粉作為進一步研究的碳源。

2.4.3" 氮源" 以MS培養基作為基礎培養基，分別采用10種不同氮源進行抑菌活性測定（圖6）。結果表明，以大豆蛋白胨、大豆粉、蛋白胨為氮源的發酵液中，指狀青霉生長圈平均直徑分別為11.20、22.10、24.24 mm，具有較強的抑菌活性，因此選用大豆蛋白胨、大豆粉、蛋白胨作為進一步研究的氮源。

2.4.4" 碳源與氮源組合" 根據篩選的氮源和碳源對放線菌R2A-77菌株進行交叉組合發酵培養（圖7）。結果表明，蔗糖+大豆蛋白胨組合的發酵液表現出最優的抑菌活性，指狀青霉生長圈平均直徑為10.87 mm；蔗糖+大豆粉組合的抑菌活性次之，指狀青霉生長圈平均直徑為16.54"mm。因此確定蔗糖與大豆蛋白胨作為放線菌R2A-77菌株發酵的最優氮源、碳源組合。

2.4.5" 碳源與氮源濃度 "基于最優碳源、氮源組合，將碳源和氮源濃度分別設置為10個不同濃度梯度對放線菌R2A-77菌株進行發酵培養（圖8）。結果表明，碳源濃度為10 g/L時，發酵液的抑菌活性最優，指狀青霉的生長圈平均直徑為9.07"mm；氮源濃度為35"g/L時，發酵液的抑菌活性最優，指狀青霉生長圈平均直徑為9.46"mm。因此碳源濃度選用10 g/L，氮源濃度選用35 g/L。

2.5" 放線菌R₂A-77菌株發酵條件的優化

2.5.1" pH" 指狀青霉生長圈隨發酵初始pH的增大呈先緩慢減小后增大的趨勢（圖9）。pH為7.0時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為10.27 mm；發酵初始pH低于7.0時，菌圈呈現出

逐步擴張的態勢；而隨著pH不斷增大，指狀青霉的生長圈隨之增大。說明放線菌R₂A-77菌株在強酸或強堿條件下，并不適宜產生具有活性的物質。因此，確定pH為7.0作為放線菌R₂A-77菌株發酵的最優初始pH。

2.5.2" 發酵時間" 指狀青霉生長圈隨發酵時間的延長呈先下降后上升的趨勢（圖10）。發酵至第6天時指狀青霉生長圈最小，生長圈平均直徑為10.85"mm。故發酵時間選用6"d作為放線菌R₂A-77菌株的最優發酵時間。

2.5.3" 接種量" 指狀青霉生長圈隨放線菌R₂A- 77接種量的增加呈先降后升的趨勢（圖11）。當接種量為3%時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為10.75 mm；其他接種量均導致放線菌R₂A-77菌株的抑菌活性下降。在接種量逐漸增加的初期階段，放線菌R₂A-77菌株產生的代謝物含量隨之上升，使得抑菌活性逐漸增強；接種量大于3%，發酵液中的營養物質難以滿足過量細胞的需求，細胞活性成分的合成過程受到限制，最終導致抑菌活性降低。因此，確定3%作為放線菌R₂A-77菌株的最優接種量。

2.5.4" 裝液量" 指狀青霉的生長圈隨裝液量的增加呈先降后升的趨勢（圖12）。當250 mL錐形瓶的裝液量為150 mL時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為9.83"mm；在裝液量逐漸增加的初始階段，由于錐形瓶內營養物質隨之增多，為放線菌R₂A-77菌株提供了更豐富的原料，使其產生抑菌活性物質的能力增強，然而，隨著裝液量的進一步增加，錐形瓶內的氣體空間被壓縮，氧氣含量逐漸減少難以滿足放線菌R₂A-77有氧呼吸的需求，當氧氣不足時，放線菌R₂A-77的生長與代謝活動受到抑制，進而影響其產生抑菌活性物質的能力。因此，確定放線菌R₂A-77菌株的最優裝液量為150 mL/250 mL。

2.6" 驗證試驗

綜合以上優化結果，以10"g/L蔗糖、35"g/L大豆蛋白胨、1000"mL蒸餾水的改良MS發酵培養基，以發酵初始pH為7.0，接種量為3%，裝

液量為150 mL/250 mL，發酵6 d，對發酵液的抑菌活性進行測定，結果表明，優化后的發酵液抑菌率為98%，優化前的抑菌率為83%。抑菌效果見圖13。

3" 討論

放線菌是一個豐富的微生物類群，已鑒定出至少有180個屬2000多個種^[28]。而放線菌合成抗生素物質是人們關注的焦點之一，據研究統計，70%的抗生素來自放線菌，50%來自鏈霉菌^[29]。除了產生抗生素外，放線菌發酵產物在農業病蟲害防治及醫學抗真菌藥物研制方面也是重要材料^[30]。國內外學者通過對多種鏈霉菌進行了深入研究。例如，王寧等^[31]通過形態學觀察、生理生化特征以及16S rRNA序列分析等手段成功鑒定出蘋果樹腐爛病生防菌株A144為婁徹氏鏈霉菌；蔣冬陽等^[32]篩選到對引起大豆根腐病的多種病原菌以及大豆白絹病菌、草莓灰霉病菌、稻瘟病菌等均有很好抑制作用的弗吉尼亞鏈霉菌IRHB 47；HAMED等^[33]從海洋沉積物中分離到1株對白色念珠菌ATCC 10231具有極強拮抗活性的放線菌菌株MK388207，經鑒定，該菌株為鏈霉菌屬。而較少有關鏈霉菌防治指狀青霉的研究報道。本研究從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株的根部土壤中分離的放線菌R₂A-77屬鏈霉菌，對指狀青霉具有良好的抑制作用。

已有研究表明，優化活性菌株的發酵培養基和發酵條件可提升抑菌活性物質的作用^[34-35]。劉一賢等^[36]通過研究表明，發酵培養鏈霉菌17-7菌株的最適合碳源為玉米粉10"g/L和葡萄糖10"g/L，最適氮源為大豆粉25 g/L和酵母粉2 g/L。劉芳等^[37]優化的鏈霉菌SZF-179最適發酵培養基中的碳源為麥芽糖15.86"g/L和土豆淀粉10.00"g/L，氮源為酵母膏8.15"g/L。由此可知，不同的鏈霉菌在發酵中會受碳源、氮源的種類及其濃度的影響。此外，適當的發酵初始pH、發酵時間、發酵裝液量和接種量能促進發酵活性物質的產生^[38]。例如，對多種植物真菌具有拮抗作用的鏈霉菌FIM- B0711的最佳發酵條件：pH為7.0，接種量為3%，裝液量為30 mL/250 mL，發酵時間為96 h，在該發酵條件下發酵物產量提升了57.69%^[39]。高加索鏈霉菌（S. ciscaucasicus）SS9-1的最佳發酵條件：裝液量為150"mL，接種量為3%，pH為8.0，發酵時間為7 d，在該發酵條件下發酵物對番茄灰霉病的拮抗效果提高到98.43%^[40]。因此不同的鏈霉菌有不同的營養要求和發酵條件。本研究對放線菌R₂A-77菌株的發酵培養基與發酵條件進行優化。通過優化，該菌株的抑菌率提升15%，抑菌率達到98%。

本研究的放線菌R₂A-77與前期研究的放線菌R₂A-15^[19]同屬于鏈霉菌，但是16S rRNA基因序列不同，通過在NCBI上進行blastn比對，發現2株菌的16S rRNA基因序列相似性僅為95.29%。在進化關系上，與放線菌R₂A-77最相似菌株為S. salinarius SS06011，與放線菌R₂A-15最相似菌株為S. virginiae NRRL ISP-5094。放線菌R₂A-15在MS培養基上形成的菌落較大，氣生菌絲呈粉色，基內菌絲呈米黃色，表型特征明顯與放線菌R₂A-77不同。本研究采用生長速率法測定放線菌R₂A-77發酵液對靶標菌的抑菌活性，篩選獲得的最優發酵培養基僅含蔗糖、大豆蛋白胨和蒸餾水，而放線菌R₂A-15的最優發酵培養基包含玉米面、酸水解酪蛋白、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉和蒸餾水，表明放線菌R₂A-77的發酵培養基原料種類更簡單、成本更低廉。但在發酵條件上放線菌R₂A-15的發酵時間僅需37.54 h，搖瓶裝液量減少至100 mL/250 mL，因此其發酵效率更高。研究表明，放線菌R₂A-15和放線菌R₂A-77對指狀青霉均有較高的抑菌活性，因此，這2株放線菌均具有重要的的研究價值和應用潛力。后續研究重點將聚焦于其發酵活性物質的分離與鑒定。

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