溫嶺小洋薯組培快繁技術(shù)

中圖分類號：S532 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2096-9902（2025）15-0050-05

DOI：10.20028/j.zhnydk.2025.15.012

Abstract：Asthefourth largestglobalfoodcrop，potatoholdssignificantimportanceinensuring foodsecurityand promoting agriculturalidustrializatioTradioaltuberpropgationfacschallngessuchaslongycles，loencandsuscetiblito pestanddiseasetransmisio.Inontrast，theinvitrorapidpropagationtechnologyenablestherapidmuliplicationandlargscale productionofvirus-freesedlingsthroughtisueculture.TopreservethequalityoftheWenling Xiaoyangshupotatothisstudy utilizedWenlingXiaoyangshuasexperimentalmaterialtoinvesigatesterilizationmethods，dferentiationmediumfoulatiosnd subculture medium formulations.Theresultsdemonstrated that the optimal sterilizationprotocol involved 75% ethanol for 30 s combined with 0.1% HgC ¹² for 7 min，achieving the lowest contamination rate of 1.67% for explants.The optimized conditions for stem tip callus induction were MS medium supplemented with 6.5g?L^-1 agar， 30g?L^-1 sucrose， 0.3 mg·L ^-1 NAA （Naphthaleneacetic acid），and 1.5 mg ·L ^{-1 6} -BA （6-benzylaminopurine），yielding the highest induction rate of 91.67% .For subculture，the optimal medium was MS+6.5 g·L ^-1 agar+ 30g 山 ^-1 sucrose+0.1 mg·L ^-1 NAA+0.1 mg·L ^-1 6-BA.

Keywords： potato; tissue culture; rapid propagation; germplasm resource protection; breeding

馬鈴薯是茄科茄屬一年生草本植物，其塊莖可供食用，是僅次于小麥、水稻、玉米的第四大重要糧食作物。傳統(tǒng)馬鈴薯繁殖依賴薯塊無性繁殖，但存在周期長、病毒累積、種質(zhì)退化及病蟲害傳播風(fēng)險高等問題，成薯的產(chǎn)量和質(zhì)量受到影響，這大大制約了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[2-3]。此外，四倍體馬鈴薯基因組高度雜合，遺傳改良難度大，傳統(tǒng)雜交育種效率低下，品種更新周期長達10～15年4。在此背景下，馬鈴薯快繁技術(shù)應(yīng)運而生，旨在通過組織培養(yǎng)、脫毒處理及遺傳改良，實現(xiàn)種苗高效生產(chǎn)與品質(zhì)提升，為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)提供可持續(xù)解決方案[4-5]。

溫嶺小洋薯是臺州溫嶺當(dāng)?shù)貎?yōu)勢微型薯種質(zhì)資源，人選2024年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種業(yè)管理司發(fā)布的“十大全國優(yōu)異農(nóng)作物種質(zhì)資源推介和典型開發(fā)案例”。其具有薯塊迷你而整齊、皮薄光滑、結(jié)薯率高、營養(yǎng)豐富、口感軟糯和耐貯藏等特點。但在實踐生產(chǎn)中，營養(yǎng)塊栽培及多年連作，造成品種退化，品質(zhì)下降。本研究以溫嶺小洋薯為試材，對外植體消毒方式、培養(yǎng)基配方、繼代培養(yǎng)基配方等進行了優(yōu)化，篩選出適宜的溫嶺小洋薯快繁條件，建立了溫嶺小洋薯快繁技術(shù)體系，為實現(xiàn)溫嶺小洋薯的工廠化育苗及種薯快繁提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1 試驗材料

供試溫嶺小洋薯由臺州默梵農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1培養(yǎng)方法將溫嶺小洋薯種薯放至室溫 23±0.5°C 進行催芽，

待芽長出 3～4cm 后，取頂端約 1cm 的芽作為外植體材料。試驗所涉及培養(yǎng)基 pH 為5.6～5.9，培養(yǎng)環(huán)境保持溫度 23±1^°C ，光照強度 2500Lx ，光照時間每天 16h^[6]

1.2.2 消毒處理

以單獨用 75% 酒精30s進行消毒處理組（消毒完畢后用無菌水沖洗3～4遍）作為對照組（CK），分別設(shè)置不同的消毒劑、消毒濃度、消毒時間對溫嶺小洋薯莖尖進行消毒處理，具體見表1。先用 75% 酒精消毒

30s后，用無菌水沖洗3～4遍后，再結(jié)合其余消毒劑進行消毒。并于消毒結(jié)束后繼續(xù)用無菌水沖洗3～4遍，方可進行后續(xù)操作。在超凈工作臺上利用解剖刀剝離出帶1～2個葉原基的莖尖約 0.2±0.1mm ，接至MS 培養(yǎng)基中。每瓶接入10個外植體，各統(tǒng)計10瓶。

溫嶺小洋薯莖尖接種至MS培養(yǎng)基 15d 后，統(tǒng)計染菌率和成活率。

表1溫嶺小洋薯莖尖消毒方案

染菌率 污染個數(shù)/接種總數(shù) ×100% 成活率 成活個數(shù)/接種總數(shù) ×100% 。

1.2.3莖尖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

將消毒后的剝離出的溫嶺小洋薯莖尖接種在不同的培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)愈傷組織，以1/2MS培養(yǎng)基作對照組（CK），分別設(shè)置3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MS、MT、WPM），見表2。培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ^?+ 蔗糖（ 30g?L^-1）+ 瓊脂 （6.5g?L^-1） ，每瓶接10個外植體，各統(tǒng)計10瓶。

表2溫嶺小洋薯莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

1.2.4激素水平的選擇

將消毒后的溫嶺小洋薯莖尖外植體接種在培養(yǎng)基進行愈傷誘導(dǎo)。以未加激素的MS培養(yǎng) ?MS+30g?L^-1 蔗糖 +6.5g?L^-1 瓊脂）為對照組（CK），分別設(shè)置不同濃度的6-BA濃度和NAA濃度誘導(dǎo)愈傷組織，具體見表3。每瓶接入10個外植體，各統(tǒng)計10瓶。

6-BA濃度和NAA濃度誘導(dǎo)愈傷組織分化，具體見表4。每瓶接入10個外植體，各統(tǒng)計10瓶。愈傷組織培養(yǎng)30d后，觀測根、芽分化、褐化情況，并統(tǒng)計愈傷組織分化下根分化率、芽分化率、褐化率，篩選出芽分化培養(yǎng)基。

溫嶺小洋薯莖尖培養(yǎng) 30d 后，觀測愈傷量，計算誘導(dǎo)率。

褐化率 褐化個數(shù)/接種總數(shù) ?×100% 。

愈傷組織（根或芽）分化率 L= 分化個數(shù)/接種總數(shù) ?x 100% ，

愈傷組織誘導(dǎo)率 誘導(dǎo)個數(shù)/接種總數(shù) ×100% 。

表4溫嶺小洋薯愈傷組織分化成苗培養(yǎng)基方案

表3溫嶺小洋薯莖尖誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基方案

1.2.5愈傷組織分化培養(yǎng)基篩選

將1.2.4最優(yōu)下誘導(dǎo)出的愈傷組織用解剖刀分解成為 1cm³ 體積大小，接種到分化培養(yǎng)基。 30d 后統(tǒng)計分化情況。以未加激素的MS培養(yǎng)（ MS+30g?L^-1 蔗糖 + 6.5g?L^-1 瓊脂）為對照組（CK），分別設(shè)置不同濃度的

1.2.6繼代培養(yǎng)基的篩選

將分化的無菌小苗剪成帶一個腋芽的莖段，將其接種在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以未加激素的MS培養(yǎng)為對照組（CK），分別設(shè)置3個濃度NAA（0.1、0.2和0.3mg?L^-1 ）3個濃度6-BA（0.1、0.2和 0.3mg^?L^-1 ）共9個不同的繼代培養(yǎng)基處理，培養(yǎng)基選擇方案見表5。每瓶接6個外植體，各統(tǒng)計10瓶。繼代培養(yǎng) 30d 后，用游標(biāo)卡尺分別測量組培苗的根長、莖粗、株高，統(tǒng)計分支數(shù)量。根長為生根處至根最下端，莖粗為組培苗中段粗度，株高為生根處至植株最高處，分支為生根處向上 2cm 內(nèi)莖的分支。

表5溫嶺小洋薯快繁培養(yǎng)基配比優(yōu)化方案

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)用OfficeExcel2020軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，用SPSS進行LSD方差分析并進行差異顯著檢驗

2 結(jié)果與分析

2.1莖尖消毒方案篩選

不同消毒方案對溫嶺小洋薯莖尖的消毒效果統(tǒng)計見表 6 不同消毒劑組合處理下，溫嶺小洋薯外植體的染菌率在 1.67%～10.83% ，均低于CK的 15.83% 。S5和S9的染菌率最低，均為 1.67% ，在 plt;0.05 水平下表現(xiàn)為差異顯著。觀察發(fā)現(xiàn)，不論是升汞還是次氯酸鈉，在超過適宜的消毒時間后，外植體的死亡率隨著消毒時間的增加而增加。外植體的成活率在 81.67% }96.67% ，均高于CK的 78.33% 。其中，處理效果最佳的為S5，成活率為 96.67% ，顯著高于CK組。此外，S1一S9的成活率總體要高于S10一S18。本研究下，S5處理組的染菌率最低，成活率最高，即在 75% 酒精處理30s后結(jié)合 0.1% 升汞 7min 消毒，外植體的染菌率最低為1.67% ，最高成活率為 96.67% 。

表6不同消毒方案對莖尖的消毒效果

注：表格中不同小寫字母代表差異顯著（ plt;0.05 ，下同。

2.2 莖尖愈傷組織培養(yǎng)基篩選

不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)對溫嶺小洋薯莖尖愈傷組織的培養(yǎng)統(tǒng)計結(jié)果見表7。在不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，溫嶺小洋薯莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)率在 51.67% 260.83% ，與CK組誘導(dǎo)率 52.50% 無顯著差異。從表7可見，誘導(dǎo)效果最好的是A1組，誘導(dǎo)率達 60.83% 。其中，A1誘導(dǎo)出的愈傷組織量最多。從愈傷組織表現(xiàn)出的顏色與質(zhì)地上來看，A1表現(xiàn)最好，為呈黃綠色，顆粒較小，較致密。而A3處理最差，呈部分褐化，顆粒小，疏松。由以上可知，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果優(yōu)于其他各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，且愈傷的質(zhì)量也優(yōu)于其他組。

表7溫嶺小洋薯莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

注： + 越多代表誘導(dǎo)出的愈傷組織越多，下同。

2.3愈傷誘導(dǎo)的激素水平篩選

不同激素水平對溫嶺小洋薯莖尖的誘導(dǎo)愈傷組織效果見表8。在不同的處理下，愈傷組織的誘導(dǎo)率在82.50%～95.83% ，與CK組誘導(dǎo)率 60.83% 統(tǒng)計比較，在plt;0.05 水平下，表現(xiàn)為差異顯著。其中，誘導(dǎo)效果最好的是L6，誘導(dǎo)率為 95.83% 。

在不同激素水平誘導(dǎo)下，溫嶺小洋薯誘導(dǎo)出愈傷組織的情況有差異。其中，L6、L9誘導(dǎo)出的愈傷組織量最多。從愈傷組織表現(xiàn)出的顏色與質(zhì)地上來看，L3、L6表現(xiàn)最好，為黃綠色，顆粒小，致密。L9表現(xiàn)最差，為邊緣黃褐色，顆粒大，疏松。由愈傷量可得，在6-BA的濃度保持不變的情況下，愈傷量隨著NAA濃度的升高而增加；同樣在NAA的濃度保持不變的情況下，愈傷量隨著6-BA濃度的升高而增加。

由以上結(jié)果可知NAA濃度在 0.3mg^-L^-1 ，6-BA濃度在 1.5mg?L^-1 組合激素水平下，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為 91.67% ，愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量均較好。

表8不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素水平對莖尖愈傷組織的影響

2.4愈傷組織分化培養(yǎng)基篩選

將愈傷組織用解剖刀分解成 1cm³ 體積大小，接種到分化培養(yǎng)基。 30d 后統(tǒng)計不同培養(yǎng)基對溫嶺小洋薯愈傷組織的分化影響，結(jié)果見表9。在不同的處理下，統(tǒng)計溫嶺小洋薯愈傷組織的根分化率，根分化率在 25.00%～45.00% 之間，其中效果最好的是B6，為45.00% ，與CK組的 21.67% 相比，在 plt;0.05 水平下，表現(xiàn)為差異顯著。分化最低的為B1，較CK高了3.33% ，差異未達顯著水平。

統(tǒng)計芽分化率，芽分化率在 21.67%～63.33% 之間，其中處理效果最好的是B4，為 63.33% ，與CK的分化率 21.67% 相比，在 plt;0.05 水平下，表現(xiàn)為差異顯著。最差的是B3，為 21.67% ，與CK無顯著差異。統(tǒng)計褐化率，褐化率在 20.00%～56.67% 之間，最好的為B4，最差的為B6，為 43.33% ，兩者與 CK56.67% 相比，在plt;0.05 水平下，表現(xiàn)均為差異顯著。此方案下，NAA濃度在 0.5mg^?L^-1 ，6-BA濃度在 2.0mg?L^-1 組合激素水平下，芽分化率最高為 63.33% 。

表9不同培養(yǎng)基對愈傷組織分化的影響

2.5繼代培養(yǎng)基篩選

將分化的無菌小苗剪成帶一個腋芽的莖段，將其接種在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，繼代 30d 后，統(tǒng)計不同培養(yǎng)基對溫嶺小洋薯的生長影響結(jié)果見表10。

不同處理下，統(tǒng)計溫嶺小洋薯組培苗的根長，長度在 2.48～4.47cm 之間。其中效果最好的為M1組，根均長為 4.47cm ，與CK組根長 3.25cm 比較，在 plt; 0.05水平下，表現(xiàn)為差異顯著。最差的為M8，根長為2.48cm ，較CK短了 23.69% 。

統(tǒng)計莖粗為 0.71～0.83mm ，各處理間并無顯著差異；株高統(tǒng)計表明，株高在 4.29～8.29cm ，其中最高組為M7，株高為 8.29cm ，統(tǒng)計上與CK組株高 6.69cm 無差異；株高最矮化組為M6，株高為 4.29cm ，與CK組對比，在 plt; 0.05水平下，表現(xiàn)為差異顯著。統(tǒng)計分支數(shù)，各組分子數(shù)在1.56～3.11個之間，除M9外，均高于CK組分支1.56個，其中，處理效果最好的是M1，即在NAA 10.1mg?L^-1+ 6-BA 0.1mg?L^-1 ，分支數(shù)為3.11個，與CK組分支數(shù)對比，在 plt;0.05 水平下，表現(xiàn)為差異顯著。在此培養(yǎng)條件下，植株分化和根發(fā)育良好，可進行煉苗后移栽。

表10不同培養(yǎng)基對組培苗的影響

3 討論與結(jié)論

外植體的消毒是溫嶺小洋薯莖尖脫毒技術(shù)取得成功的基礎(chǔ)，對于莖尖的處理既要使其不受污染，又要確保其成活狀態(tài)。李東方等研究表明，氯化汞或次氯酸鈉與 75% 乙醇組合使用對溫嶺小洋薯莖尖的消毒效果較好。本研究選用18個消毒方案對溫嶺小洋薯莖尖進行染菌率和成活率測定，測定結(jié)果表明升汞、次氯酸鈉對莖尖污染均有一定的抵制作用，溫嶺小洋薯外植體的成活率在 81.67%～96.67% ，均高于CK的 78.33% ，升汞的消毒效果好于次氯酸鈉。其中0.1% 升汞消毒 7min 處理和 0.15% 升汞消毒 9min 處理溫嶺小洋薯莖尖消毒效果最好，染菌率低至 1.67% ，成活率可達 96.67%.90.87% 。在適宜濃度內(nèi)，消毒效果會隨著消毒劑濃度增加而增強，但超出適宜濃度后，濃度的增加會導(dǎo)致外植體死亡率的上升。在4組莖尖愈傷組織誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選中，A1表現(xiàn)最好，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇MS培養(yǎng)基，這也與杜連彩的研究較為符合。

植物激素對馬鈴薯愈傷組織的誘導(dǎo)具有重要的調(diào)節(jié)作用。在MS培養(yǎng)基中加入生長調(diào)節(jié)劑GA3、6-BA、NAA等激素成分化培養(yǎng)基，其成分及濃度是影響形態(tài)建成的關(guān)鍵，濃度過低會出現(xiàn)大量愈傷組織無法分化成苗；濃度過高，會出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，導(dǎo)致成活率降低。本研究中選用10組莖尖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)方案中，其中 0.3mg^?L^-1NAA+1.5mg^?L^-16-B/ A組合表現(xiàn)較為良好，所產(chǎn)出的愈傷組織體積較大，結(jié)構(gòu)較疏松。在 0.3mg^?L^-1NAA+3mg^?L^-16-BA 組合下，提高 ^6- BA濃度，有部分愈傷組織褐化，這與學(xué)者董穎蘋等[]范繼紅等的研究類似，在6-BA的濃度保持不變的情況下，愈傷量隨著NAA濃度的升高而增加。根據(jù)根芽激素理論，生長素NAA可促進根的生長，細胞分裂素6-BA可促進芽的增殖[12-14]，適當(dāng)?shù)腘AA、6-BA配比培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化能力越強。在10組溫嶺小洋薯愈傷組織分化培養(yǎng)基篩選中，由結(jié)果可知，當(dāng)NAA的濃度增加時，可促進愈傷組織分化出根，但會導(dǎo)致愈傷組織的褐化加劇，這與楊春等的研究類似，同時6-BA的濃度增加可促進芽的分化，這也符合根芽激素理論。其中 0.5mg^?L^-1NAA+2mg^?L^-1 6-BA 組合表現(xiàn)較為良好，分化出芽較多， 1.5mg?L^-1 NAA+2mg?L^-1 6-BA組合中，分化根較多。在10組不同的溫嶺小洋薯繼代培養(yǎng)基方案中，M1組 0.1mg^?L^-1 NAA+0.1mg?L^-1 6-BA在組培苗根長、莖粗、株高、分支方面表現(xiàn)突出。

綜上所述，在本試驗條件下，優(yōu)化溫嶺小洋薯無菌脫毒的培養(yǎng)體系為： ① 無菌消毒，使用 75% 的酒精和 0.1% 的升汞依次對溫嶺小洋薯莖尖進行消毒30s和 7min ，用無菌水沖洗5～6遍后，在超凈工作臺上利用解剖刀剝離出帶葉原基的莖尖 0.2±0.1mm ，作為試驗材料。 ② 莖尖愈傷組織培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基 pH 為5.6～5.9，培養(yǎng)溫度 ，光照強度 2500Lx ，光照時間每天 16h ，培養(yǎng)基配方為 MS+30g?L^-1 蔗糖 +6.5g?L^-1 瓊脂 +0.3mg^-L^-1 NAA+1.5mg?L^-1 6-BA。 ③ 溫嶺小洋薯愈傷組織芽分化培養(yǎng)基為 MS+6.5g?L^-1 瓊脂 + 30g?L^-1 蔗糖 +0.5mg^?L^-1NAA+2mg^?L^-1 6-B. A，培養(yǎng)基ΔpH 為 5.6～5.9 ，培養(yǎng)溫度 23±1°C ，光照強度 2500Lx ，光照時間每天 16h 。 ④ 繼代培養(yǎng)條件為 MS+6.5g?L^-1 瓊脂 +30g?L^-1 蔗糖 Σ^{+0.1mg?L-1NAA+0.1mg?L-1 6-BA} 培養(yǎng)基 pH 為 5.6～5.9 ，培養(yǎng)溫度 23±1°C ，光照強度2500Lx ，光照時間每天 16h 。在此條件下，根均長可達 4.47cm ，莖粗為 0.71～0.83mm ，株高達 8.29cm ，經(jīng)煉苗后可進行移栽。

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