多壁碳納米管生根培養基對草莓脫毒苗生長的影響

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Multi-walled Carbon Nanotube Rooting Medium on the Growth of Strawberry Virus-free Seedlings

CAO Fan，JINYu-qing，GU Qing-qing et al（Jiangsu Yanjiang Institute of Agricultural Sciences，Nantong，Jiangsu

AbstractObjective]Toestablishastrawberytisueculturesystembasedoncarbonnanotubemediu.[MethodThistudyusedHongyan’strawberseexpietalmaterialtoexploetheifueneofulti-alldarbnoubeoigddifntota tions （25，50 and 100mg/L ）onthe growth of strawbery tisue culture seedlings，and observed the growth of adventitious roots.[Result]The results showedtataddingulti-walledcarbonnanotubes tothestrawberryotingculturemedmsignificantlyimprovedtecalduction rate. Compared with the control group， 50mg/L multi-walled carbon nanotube rooting medium had the best efct， increasing the height of virus-free seedlings by 27.1% ，the total root length by 83.4% ，the total root volume by 163.8% ，and the number of root tips by 70.1% .Microstructuralobservatiosevaledthattheuli-walldarbnnaotubseeabsobdotesufceofthdventitiousosnddidotg glomerate inside them.The survival rate of transplanting after acclimatization was above 95% ，and the young seedlings grew well. [Conclusion] In this study，a multi-walled carbon nanotube rooting medium （ 50mg/L ）suitable for strawberry tissue culture was selected to provide technical support for the application of carbon nanomaterials in strawberry propagation.

Key Words‘ Hongyan’strawberry;Carbon nanotube;Tissue culture;Microstructure;Adventitious root

碳納米管（carbonnanotubes，CNTs）是一種長寬比例大于1000的一維納米級碳結構，具有獨特的機械性、導熱性和電學性能，可改變化學反應或生物結構[1-2]。碳納米管根據結構類型，分為單壁碳納米管（single-walledcarbonnanotube，SWCNT）和多壁碳納米管（multi-walledcarbonnanotube，MWCNT）。盡管不是植物自身所需的物質，多壁碳納米管已經逐漸應用于植物學和生態學研究[3]。關于多壁碳納米管對植物的促生效果，研究發現外徑 50～630nm 的多壁碳納米管處理可促進小麥幼苗根系細胞的生長，提高根系相關脫氫酶活性，繼而提高幼苗生物量的積累[4]。然而，外徑 13nm 的多壁碳納米管處理會顯著抑制紅菠菜、生菜、黃瓜的生長，使植株根和冠變短，電解質泄漏等導致植物細胞死亡[5]。因此，多壁碳納米管對植物生長發育的影響不同，主要取決于多壁碳納米管的類型、粒徑、濃度、溶解度以及植物種類等[6-8]。此外，多壁碳納米管制備簡單，價格相對低廉，是一種在植物種苗繁育應用中存在巨大潛力的試驗材料。

草莓（FragariaL.）為薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragar-ia）多年生草本植物，是世界上重要的漿果果樹，果實風味獨特，形態顏色誘人，營養價值豐富，素有“水果皇后”的美稱，在全球經濟作物中占有非常重要的地位[9]。目前，草莓種苗問題是制約我國草莓產業化發展的重要因素之一。草莓種苗繁育主要采用匍匐莖繁育的傳統方式，但隨著繁殖代數的增加，容易導致病蟲害積累加重，而運用植物組織培養培育的草莓脫毒苗能夠克服長期無性繁殖帶來的品種退化、質量和產量低下等問題，從而保持品種優良性狀，促進草莓產業不斷發展。因此，深人開展草莓組織培養新材料新技術研究，有效提高草莓種苗繁育質量是當前草莓產業急需解決的課題[10] C

筆者以“紅顏”草莓脫毒組培苗為研究材料，探究不同濃度多壁碳納米管的生根培養基對草莓組培苗生長的影響，并觀測不定根根系生長情況，以期篩選出適合草莓組培擴繁的多壁碳納米管生根培養基，旨在為碳納米材料在植物種苗繁育應用方面提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料“紅顏\"草莓外植體材料來源于南通市海門區春華家庭農場，于2023年3—4月在科創中心組培實驗室完成莖尖剝離、消毒和初代培養[1]。初代培養基配方為WPM培養基 +0.5mg/L6- 芐氨基嘌呤 （6-BA）+0.05mg/L 萘乙酸（NAA）。培養室條件為溫度 25～30°C ，光照 1500lx ，光照周期 16h/8h 。 28d 后，選取不定芽良好、增殖效果相近的草莓組培植株備用。

1.2 試驗方法

1.2.1生根培養基制備。生根培養基配方為MS培養基 + 0.1mg/L 萘乙酸 （NAA）+0.1mg/L 吲哚丁酸（IBA）。設置3個處理組，處理組 T_Ω1 中添加 25mg/L 多壁碳納米管，處理組 T₂ 中添加 50mg/L 多壁碳納米管，處理組 T₃ 中添加100mg/L 多壁碳納米管，且設置1個對照組。每個處理組和對照組設置3個重復，每個重復24瓶。多壁碳納米管（ Σ（? 95% ，外徑 8～15nm ，長度 30～50μm） 來源于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。配制好的生根培養基在高溫高壓滅菌后，搖床晃動至冷卻，使各瓶內多壁碳納米管均勻分布在生根培養基中。

1.2.2植株生根培養。2023年4月中旬，待增殖培養基上的不定芽高度約 2cm 時，進行生根培養基接種，每個處理接種72瓶，每瓶接種1株。接種完成后，置于溫度 25～30^°C ！光照 1500lx 光照周期 16h/8h 的條件下進行培養。每隔5d 統計一次愈傷組織形成和每隔 10d 統計不定根誘導率，褐化、污染及死亡發生情況。培養50d后，統計每瓶植株的高度、總重量、葉片重量和根部重量。每個處理選取10棵用于形態觀測，其余轉移到室溫環境下放置2d，打開瓶蓋后放置1d，自來水清洗根部后，移栽至草炭土：珍珠巖 =5：1 基質、規格 9cm×9cm 容器內培養。

1.2.3形態觀測。植株生根培養50d后，采用植物圖像分析儀（型號： Si800plus ，上海中晶科技有限公司），對各個處理選取的樣品根系進行掃描，記錄根系總長度、體積、平均直徑和根尖數等形態發育指標。同時，對每個處理不定根樣品進行石蠟切片制作，采用電子顯微鏡（型號：OlympusCX33生物顯微鏡，Evident）對不定根及其橫截面進行微觀結構觀察，判斷多壁碳納米管吸附效果及是否存在于不定根內部。

1.3數據處理 使用Excel進行數據統計，使用DPS和SPSS26.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1愈傷組織和不定根誘導不同多壁碳納米管培養基對草莓植株愈傷組織誘導率見圖1。培養第5天時，各個多壁碳納米管處理組與對照組差異顯著，其中 50mg/L 多壁碳納來管處理組愈傷組織誘導率達 25% ，而對照組的愈傷組織誘導率僅為 14% 。培養第10天時，僅 50mg/L 多壁碳納米管處理組與對照組存在顯著差異，此時該處理愈傷組織誘導率為 79% ，較對照組提高了17.9百分點。培養15d后，各處理組和對照組之間的愈傷組織誘導率無顯著差異。培養 20d 后，除 25mg/L 多壁碳納米管處理組和對照組各1個組培瓶以及 100mg/L 多壁碳納米管處理組各2個組培瓶內因褐化污染現象導致死亡外，其余每個組培瓶內草莓植株均有愈傷組織形成，且部分組培瓶內草莓植株不定根誘導分化形成。

不同多壁碳納米管培養基對草莓植株不定根誘導率見圖2。培養第20天時， 50mg/L 多壁碳納米管處理組的不定根誘導率為 6.9% ，而對照組的不定根誘導率僅為 1.4% ，兩注： ? 表示與對照組相比差異顯著（ ?-0.05 ）者之間存在顯著差異。培養第30天后，各個處理組和對照組之間的不定根誘導率無顯著差異。培養第50天時，各個處理組和對照組不定根誘導率均達 85% 以上，部分瓶內草莓脫毒苗的不定根長度已經達到組培瓶底，開始出現環繞現象。

圖1不同多壁碳納米管培養基草莓植株愈傷組織誘導率Fig.1Callusinduction rateof strawberriesin different multi-walledcarbonnanotubemediums

Note： * indicated significant difference compared with CK（ Plt; 0.05）.

注： 表示與對照組相比差異顯著（ Plt;0.05 ）°

Note：*indicated significant difference compared with CK（ Plt; 0.05）.

圖2不同多壁碳納米管培養基草莓植株不定根誘導率

Fig.2Adventitiousrootinductionrate of strawberriesin different multi-walled carbon nanotube mediums

2.2脫毒苗生長指標不同多壁碳納米管培養基對草莓脫毒苗生長的影響見表1。其中， 50mg/L 多壁碳納米管處理組在草莓脫毒苗高度上與對照組呈顯著差異，平均高度為10.32cm ，較對照組提高了 27.1% 。 100mg/L 多壁碳納米管處理組在草莓脫毒苗根部重量上與對照組呈顯著差異，根部平均重量為 4.70g ，較對照組提高了 94.2% 。在植株總重量和葉片重量方面，各個處理和對照組之間未表現出顯著差異。

2.3不定根根系掃描觀測通過植物圖像分析儀掃描不定根根系，結果表明，不同多壁碳納米管培養基對草莓脫毒苗不定根發育的影響見表2。其中，25和 50mg/L 多壁碳納米管處理組與對照組的不定根總長度差異顯著，而 100mg/L 多壁碳納米管處理組與對照組的脫毒苗不定根總長度未呈顯著差異。在不定根總體積方面， 50mg/L 多壁碳納米管處理組與對照組存在顯著差異。各個處理之間不定根平均直徑未表現出顯著差異。在不定根根尖數方面，各個多壁碳納米管處理組均與對照組存在顯著差異。綜合分析， 50mg/L 多壁碳納米管處理的效果最佳，相較于對照組，其不定根平均總長度、總體積和根尖數分別提高了 83.4% 、 163.8% 和70.1% 。

表1不同多壁碳納米管培養基對草莓脫毒苗生長的影響

Table1Effects ofdiferentculture mediums byusingmulti-waledcarbon nanotubesonstrawberryvirus-free seedlinggrowth

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（ 。 Note：Different lowercase letters indicated significant difference between treatments（ Plt;0.05） ！

表2不同多壁碳納米管培養基對草莓脫毒苗不定根發育的影響

注：同列不同小寫字母表示不同處理間存在顯著差異（ 。Note：Different lowercase letter indicated significant difference between treatments（ Plt;0.05） ：

2.4不定根形態結構觀察在顯微鏡觀察下，多壁碳納米管培養基的草莓脫毒苗根系表面和多壁碳納米管培養基的草莓脫毒苗根系橫截面微觀結構見圖3和圖4。部分不定根組織結構切片見圖3，多壁碳納米管吸附于根系表面，形成團聚形狀。而通過包括圖4在內的多組各個處理不定根橫截面微觀結構的石蠟切片觀察，未發現有多壁碳納米管直接進入草莓脫毒苗不定根內部形成團聚形狀的情況

圖3多壁碳納米管培養基的草莓脫毒苗根系表面

注：A. 100mg/L 多壁碳納米管處理組;B.對照組。

Note： A. 100mg/L CNTs treatment group;B. CK group.

2.5煉苗與移栽草莓脫毒苗生根培養50d后，除前期組培瓶內因污染導致植株死亡外，其余各個處理脫毒苗生根率均達 100% 。當瓶內草莓脫毒苗不定根接觸瓶底時（圖5A），開始煉苗準備移栽。各處理組與對照組的脫毒組培苗移栽成活率均大于 95% ，無顯著差異。多壁碳納米管培養基培育的草莓脫毒苗后續生長表現正常（圖5B）。

3結論與討論

該研究中，多壁碳納米管培養基在培養初期對草莓脫毒植株愈傷組織的誘導形成影響較大，這與Gaafar等[12關于荷荷巴苗體外培養的研究結果近似，碳納米管提高了植株愈傷組織倍增率。關于不定根誘導方面，該試驗結果推測草莓植株不定根誘導的前期表現受到愈傷組織誘導結果的影響，而根據不定根根系掃描觀測結果，多壁碳納米管處理對組培脫毒苗的不定根形成產生影響，這與王鴻雪[13]關于碳納米管處理對嘎啦蘋果無菌苗生根試驗的研究結果一致。研究表明在植物組織中添加碳納米管會影響植株丙二醛（MDA）含量，激發不定根抗氧化酶活性，通過調節不定根形成的相關基因表達影響脫毒苗生根。此外，該試驗通過不定根根系掃描觀測，發現多壁碳納米管培養基會顯著影響不定根體積和根尖數的形成，推測在植物組織培養過程中添加多壁碳納來管會誘導脫毒苗不定根分生數量提升，可使組培瓶內植株更加充分利用有限空間，提高組培生產效率，該推論有待進一步驗證。

圖4多壁碳納米管培養基的草莓脫毒苗根系橫截面微觀結構

注： A.25mg/L 多壁碳納米管處理組； B.50mg/L 碳納米管處理組;C. 100mg/L 碳納米管處理組;D.對照組。

Note ： A. 25mg/L CNTs treatment group ;B. 50mg/L CNTs treatment group ;C. 100mg/L CNTs treatment group; D. CK group.

Fig.4Root transection microstructure of multi-walled carbon nanotube mediums on strawberry virus-fre sedlings 注： A.50mg/L 多壁碳納米管處理組草莓脫毒苗煉苗; B.50mg/L 多壁碳納米管處理組草莓脫毒苗移栽容器生長。 Note：A. Strawberry virus-free seedling domestication of 50mg/L MWCNT treatment group;B. Strawberry virus-free seedlings of 50mg/L MWCNT treatment group grew in transplanting container.

圖5多壁碳納米管培養基的草莓脫毒苗煉苗與移栽

關于碳納米管對植物形態結構影響的研究很多，李佳慧[14]研究碳納米管處理對文心蘭類無菌苗生長的相關機理，結果發現在培養基中添加碳納米管的文心蘭無菌苗內部或者表面有團聚的碳納米管顆粒出現，且碳納米管進入植株內部后影響細胞正常的新陳代謝。Sarikhani等[15]研究了多壁碳納米管對砧木GF677（桃和杏雜交）微體繁殖的影響，透射電鏡（TEM）對生長芽組織進行成像，發現多壁碳納米管滲透到植物組織中，影響組培苗增殖和生長速率。但研究發現碳納米管可穿透細胞壁和細胞膜進入根細胞，通過降低內源植物激素的濃度顯著抑制水稻生長[16]。多壁碳納米管處理洋蔥根細胞，會改變細胞形態結構和破壞膜的完整性，影響細胞線粒體的正常功能[17]。該試驗中，僅觀察到多壁碳納來管吸附于根系表面，未在光學顯微鏡下觀察到多壁碳納米管滲透進入不定根內部的團聚形狀，可能與多壁碳納米管外徑長度以及選用的組培培養基類型有關，亟待深入研究。

組培脫毒苗的生根質量直接影響移栽馴化的成活率，影響植株的整體品質。碳納米管在提高組培苗生根效率方法存在巨大潛力。目前，碳納米管已經在多種園藝作物、園林植物和藥用植物的植物組織培養技術中應用[18]。但多壁碳納米管作用于植物組織培養的生根機理尚未研究透徹，需要不斷深入分子生物學研究，才能持續技術創新，拓寬碳納米材料在植物種苗繁育的應用領域。

參考文獻

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