利用分子標記輔助選育香型雜交水稻不育系研究

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Idy on Improving Fragrance of Hybrid Rice Sterile Line by Molecular Marker-assisted Technology XU Xiao-ming1，WANG Hui-min，YIYun-huo'etal（1.Jiangxi HongyiSed Science amp; TechnologyCo.，Ltd.，Nanchang，Jiangxi ;2. Jiangxi Super-rice Research and Development Center，Nanchang，Jiangxi 330200）

AbstractObjective]Toimprovethethreinesterlelin.Method]ByusingChangtianBandWanxiangBasparentstointerbred，te testwasconductedbyul-neratioalinbrdinfolloedyackrossithWanangAAndthtestlstroducedtfrgaegene called Badh₂ to the ChangtianAbymeansofMolecular Maker AssistedSelection（MAS）.[Result]Thecomprehensiveandhigh-qualitysterile lineChangtian2atsstrllnabilitddoiantdieengneicckgodfngiadoesog tainerline2Bwasseleted.Conclusio]eiprovementofsterilelineprovidedeparetalesoucsforthcobinedbrdingofbd rice.

Key WordsHybrid rice;CMS line;Changtian 2A;Fragrance gene

香味對稻米食味品質有著重要影響[1]。具有香味的優質大米往往更受消費者喜愛，價格比普通優質米更高，也更受農民的喜愛[2-3]。市場對優質大米需求的不斷增加，加快了中國優質香稻的育種進程。中國香稻資源豐富，前人發現不同香稻品種中香味物質豐富多樣，有200余種，但是大部分與其含有2-乙酰基-1-吡咯啉（2-AP）積累有關[4-5]而2-AP 含量與水稻香味基因 Badh₂^[6] 有關。Bradbury等[6]發現水稻基因 BAD₂ 與控制水稻隱性香味性狀的 fgr基因為同一個基因，且香味主要是由于編碼甜菜醛脫氫酶基因 BAD₂ 原有功能喪失，致使香味物質2-AP不斷積累，從而產生香味[6。香味遺傳性狀十分復雜，2-AP含量在不同品種中存在明顯差異、相同品種在不同種植條件下也不相同[7-9] 。

前人研究表明，稻米的香味主要受第8染色體上的隱性香味基因控制[，傳統雜交育種中，分離后代群體中對于表型不好評判，若全部按照KOH浸泡法[11]、咀嚼法[12]來判斷香味基因，不但工作量大、費時費力且易受主觀因素影響，致使香味基因的丟失。但對目標基因的基因型進行檢測，于苗期或者低世代均可采用分子標記輔助選擇（MAS）進行，不受時間、環境影響，且成本低、周期短、目的性強、準確性高[3]因此，選育含有香味基因的新品種，應用分子標記檢測越來越普遍。例如，王天生等[14利用功能性分子標記FGR3，對后代材料進行香味基因 Badh₂ 檢測，育成了香型保持系及其不育系。羅世友等[15]采用分子標記輔助選擇（MAS）與系譜法，育成了含有香味基因 Badh₂ 的優質品種九香粘，米質達國標3級。韋敏益等采用分子標記和系譜法，育成了常規稻品種含有香味基因 Badh₂-E7 的桂野香占，有效緩解市場對豐產優質香型水稻品種的迫切需求。

長田A是與江西農業大學農學院合作選育的三系不育系，2020年通過江西省農作物品種審定委員會審定（贛審稻：20200057），長田A具有柱頭外露率高、異交性能好、異交結實率高、配合力好等特點。近幾年與長田A所配組合均表現出后期落色好、產量高、米質優、抗性好、結實率高的特點。鑒于此，筆者對不育系長田A進行改良，以長田B和萬象B為父母本進行雜交，通過多代自交，選擇攜帶香味基因的株系與萬象A進行雜交加多代回交，每代均結合分子標記輔助選擇（MAS），選擇具有香味基因 Badh₂ 的不育后代進行下一代回交，最后篩選出綜合性狀優良、不育性穩定且與長田A農藝性狀差異小且經NY/T1433—2014《水稻品種鑒定技術規程SSR標記法》的48對引物分析無差異的不育系長田2A，以及其對應的保持系長田2B。長田2A已申請植物新品種保護（申請號：20221002958），利用該不育系可選育含有香味基因的優質雜交稻組合，有利于加快香型優質水稻新品種的培育。

1材料與方法

1.1試驗材料2015年以攜帶 Badh₂ 基因的萬象B為父本，由提供；以長田B為母本進行雜交，從雜交 F₂ 代開始對 Badh₂ 基因采用功能標記進行輔助選擇（MAS），直至目標株系穩定。待目標株系穩定后，用其與萬象A測交，然后進行多代回交。從雜交一代開始，每代均采用NY/T1433—2014《水稻品種鑒定技術規程SSR標記法》中48對引物對雜交后代進行遺傳背景篩選，每代選擇與長田A遺傳背景差異小的株系進行下一代的回交，直至回交轉育成不育系長田 2A 。

1.2DNA提取DNA提取采用簡易法進行（參照福際試劑盒使用方法）： ① 將 1～2mg 葉片組織剪碎置于 1.5mL 離心管中； ② 加入 20μL 裂解液BufferP1，確保葉片組織被裂解液完全浸沒； ③ 蓋好離心管蓋，將其置于水浴鍋， 95^°C 裂解10min ④ 離心后加入 20μL 提取液BufferP2，充分混勻，離心即可待用。

1.3香味基因檢測采用香味基因功能標記Badh-M2進行輔助選擇，引物正向和反向序列分別為： 5^′ -GTTAGGTTG-CATTTACTGGGAG- 3^′ 和 5^′ -GAATGATGCTCAAAGTGTCT-3^′ ;PCR反應體系為 10μL （裂解混合液DNA模板 1μL ，引物 1μL，2x Leaf PCR EasyTM Mix 5μL，ddH₂O 3μL） ；反應條件為 94°C 3min，94°C 變性 10s，55°C 退火 20s，72‰ 延伸30s ，共30個循環， 72°C 終延伸 5min，4°C 恒溫保存（具體使用方法參照福際試劑盒）。擴增后PCR產物采用 6% 聚丙烯酰胺凝膠電泳 180V 約 65min ，電泳結果采用相機拍照保存。

1.4稻葉片香味鑒定2016年采用K0H浸泡法對 F₂ 世代植株葉片進行香味鑒定，于分蘗盛期約取 2g 新鮮葉片，剪碎置人 20mL 離心管中，加入 1.7% KOH溶液 10mL 立即關閉蓋子，置于室溫約 10min ，然后打開瓶蓋聞香味的有無，共設3次重復[]

1.5農藝性狀考察2021年對回交了8代，新育成穩定的香型不育系長田2A主要農藝性狀進行考察，考察指標主要包括株高、穗長、每叢穗數、每穗穎花數、千粒重、粒長、粒寬、長寬比，小區內隨機選取10株測定，3次重復。

2 結果與分析

2.1分子標記輔助選擇及改良過程采用香味基因分子標記 Badh₂-M2 對親本材料進行多態性分析，在2個親本之間目標條帶清晰可見，具有多態性（圖1），含有 Badh₂ 基因與不含 Badh₂ 基因片段大小分別為91與 83bp ，兩者相差 8bp 0

不育系長田2A改良過程見圖2。2015年夏以長田B為母本，與含有 Badh₂ 基因的父本萬象B雜交，獲得 F_i 種子15粒。2015年冬，于三亞種植 F₁ 代，成熟時混收真雜種剔除假雜種。2016年夏種植分離群體 F₂ 約2500個單株，利用香味分子標記檢測單株基因型見圖3，結合田間農藝性狀觀察，并通過KOH浸泡法進行香味驗證，成熟時選擇綜合性狀優良、長粒型的單株16株。2016年冬—2017年冬加代種植自交系群體，每代均通過香味基因 Badh₂ 標記檢測，通過KOH浸泡法進行香味驗證，結合田間農藝性狀，選取葉片具有香味且含有香味基因，綜合性狀優良的單株進行下一代繁殖。2017年冬用中選單株與萬象A進行成對測交，收獲測交種及對應父本單株。經過連續8代回交，直至 BC₈F₁ 代。對回交后代進行每代鏡檢，選取柱頭外露率高、農藝性狀優良且遺傳背景更接近長田A的單株進行下一代回交。于2021年冬，最終獲得穩定的含有香味基因 Badh₂ 的不育系長田2A及對應的保持系長田2B株系，并于2021年開始小面積繁殖。

圖1標記 Badh₂"-M2在2個親本之間的多態性

注：M.Marker;1.含有 Badh₂ 基因親本帶型;2～5.不含有 Badh₂ 基 因親本帶型;6.含有2親本帶型的雜合狀態。

Note：M.Marker;1.Theamplification of Badh₂ gene for the parents; 2- 5.Non .Badh₂ gene for the parents;6.Heterozygous state for the both parentals.

2.2新育成的香型不育系長田2A的主要農藝性狀不育系長田2A主要農藝性狀與原始不育系長田A基本一致（表1、圖4）。其中，株高、穗長、單株成穗、千粒重、粒長、粒寬、長寬比差異不顯著，但在每穗穎花數上長田2A卻高于長田A。從圖5可以看出，在谷粒性狀與米粒外觀上，長田2A與長田A也差別不大。

3結論與討論

稻米香味的產生不僅因為 Badh₂ 基因功能喪失，與2-乙酰基-1-吡咯啉的積累有關，但也受到環境因子，如濕度、溫度、輻照、土壤營養元素含量等的影響[17]。例如，成大宇等[8]研究發現水分、養分（氮磷鉀元素等）對稻米香味形成具有重要影響。魏曉東等[9]對水稻香味形成影響進行研究，發現除遺傳因素（ Badh₂ 基因）外，環境因子（土壤，栽培，氣候等）均會對水稻香味物質合成有影響。由于香味合成不穩定，若采用傳統的鑒定方法，如米飯咀嚼法、熱水法、KOH浸泡法、氣象色譜儀測定法等，很難準確判斷。 Badh₂ 基因除了在根中不表達外，在所有檢測的組織中，包括葉、莖和穗部都表達，尤其幼葉中表達量最高[20]，因此采用分子標記，篩選香味材料，不受時間和空間限制、環境因素和主觀因素影響，再與常規育種技術緊密結合，能夠顯著提高水稻品種的選育效率。

分子標記輔助選擇育種（MAS）通過檢測與目標性狀基因連鎖的標記達到高效定向選擇的目的，然后結合農藝性狀進行篩選綜合性狀優良的品種，該方法已廣泛應用于水稻品種的培育與改良中。例如，陳濤等[21以具有低直鏈淀粉含量基因Wxmp和香味基因fgr的優良食味粳稻品種南粳46與含低谷蛋白基因Lgc1的日本粳稻品種LGC-1雜交、回交，利用與目標基因共分離的分子標記進行跟蹤檢測并結合田間選擇。在 BC₂F₆"獲得5個食味品質顯著提升的新品系。李博文等[22]利用 Pi9 共顯性Indel標記 CoInDF₁R₂"開展MAS回交育種定向改良了桃農1A稻瘟病抗性，結合田間不育特性、農藝性狀與產量結構調查分析，育成1個高抗稻瘟病、農藝性狀優良新不育系桃農1A-pi9-1及其配套保持系1B-"。陳春等[23]以日本晴9（含 GS9 ）與泗稻17號為親本，通過雜交和連續回交，采用分子標記IN0919對親本泗稻17號的粒型進行了改良。自 Badh₂"香味基因被克隆以來，采用分子標記對香味基因選育材料應用也越來越多，如孫平勇等[24]采用功能標記E7，對非香稻/香稻的2個育種群體及10份香稻品種的 OsBADH₂"基因型進行了檢測與驗證。鄧力喜等[25]采用功能引物組合 BADH₂-R+BADH₂-F₁+badh₂-R2 ，來區分基因型雜合體、香味基因純合體以及非香基因純合體，采用分子標記培育出香型優質水稻品種。以上研究表明，分子標記輔助選擇作為一種快速、準確、有效的方法，在選育含有香味的水稻品種中具有重要的應用價值.

圖2香型保持系長田2B及不育系長田2A的改良過程

Fig.2The improving process of fragrant rice CMS line Changtian 2A and its maintain line Changtian 2B

注：M.Marker;P1.萬象B（含有 Badh₂ ）；P2.長田A（無 Badh₂ ）； 1～11.F₂ 部分單株帶型。

Note：M. Marker;P1.Wanxiang B（contains Badh₂ ） ;P2. Changtian A（NoBadh₂ ）;1-11.Partial amplification of F₂ single plant.

圖3部分單株香味基因 Badh₂ 的分子標記檢測

Fig.3Partial MAS for the Badh₂ gene of single plant

表1改良不育系長田2A與長田A農藝性狀比較

[able1 Comparison of agronomical traits of improved sterile lines Changtian 2A with Changtian A

注：粒寬、粒長、長寬比等粒型數據均由長田A及長田2A相應的保持系長田B及長田2B測量獲得。NoteGrainhdtdeadB and Changtian 2B.

注：A.長田2A;B.長田A。

Note：A.Changtian2A;B.Changtian A.

圖4植株表型 Fig.4 The plant type

隨著市場經濟的發展及人們生活水平的提高，對稻米的要求也逐漸從“吃飽”向“吃好”轉變，因此含有香味的大米更易受到青睞。培育含有香味的優質水稻品種顯得尤為重要。該研究通過對不育系長田A的改良，以長田B和萬象B為父母本進行雜交，通過多代自交，然后與萬象A進行回交，結合分子標記輔助選擇（MAS）的方法將香味基因 Badh₂ 導入到長田A中，結合田間農藝性狀觀察，篩選出綜合性狀優良、不育性穩定且與長田A遺傳背景無顯著差異的不育系長田2A及其對應的保持系長田2B。長田2A不僅兼顧了長田A開花習性好、柱頭外露率高、分蘗強、后期轉色好、粒型長、配合力強、綜合性狀優良等特點，還增加了香味，利用該不育系可選育含有香味、豐產、廣適、優質等特性的優質水稻品種。

參考文獻

[1]唐傲，邵高能，胡培松.水稻香味基因的研究進展[J].中國稻米，2009， 15（4） ：1-4.

[2]謝建平，凌高.泰國香稻研究、育種概況及啟示[J].種子世界，2006 （12）：13-14.

[3]顧海華.水稻香味遺傳研究與育種利用[D].北京：中國農業科學院， 2006：12，16，37.

[4]YANGDS，LEEKS，JEONGOY，etal.Characterization of volatile aroma compounds in cooked black rice[J]. Journal ofagricμltural and food chemistry，2008，56（1）：235-240.

[5]FUKUDAT，TAKEDAT，YOSHIDAS.Comparisonofvolatilesin cooked rice with variousamylose contents[J].Food science and technology research，2014，20（6）：1251-1259.

[6]BRADBURYL M T，FITZGERALD TL，HENRY R J，et al. The gene for fragrance inrice[J].Plantbiotech journal，20o5，3（3）：363-370.

[7]WEI X，HANDOKODD，PATHERL，et al. Evaluation of 2-acetyl-1-pyrrolinein foods，withanemphasisonrice flavour[J].Food chemistry，2017， 232：531-544.

[8]XIELH，TANGSQ，WEI XJ，etal.An optimized analysisof2-acetyl-1- pyrroline content diversity in the core collection of aromatic rice germplasm （Oryza sativa L.）[J].Cereal chemistry，2019，96（4） ：698-707.

[9]PRODHAN Z H，SHU Q Y. Rice aroma：A natural gift comes with price and theway forward[J].Rice science，2020，27（2）：86-100.