小鼠對表達銅綠假單胞菌外膜蛋白I乳酸乳球菌載體疫苗的免疫應答研究

doi：10.3969/j. issn.0517-6611.2025.15. 015

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Studyonthe ImmuneResponseofMicetolactococus lactis VectorVaccine Expressing Pseudomonasaeruginosa OuterMembrane ProteinI CHENQng-yan，QUXiao-jun（InovationResearch CenterforMicrobialPhrmacolog/IstituteofMicrobiology，HeilongjiangAcademy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150010）

AbstractObective]ToevaluatetheimmuneresposeofcleanmicetorecombinantLactococcus lactisvectorvacinsexpresingPsedo monaseruginosaoutermembraneproteinI，andlaythefoundationforthedevelopmentofvacines thatcanpreventandtreatPseudomonas aeruginosaifection.MethodTevectoacceandLctococuslctissuspensioneredmiisteredoallytimmuedmcdth 35thdayaftertistimuzatioteiceerecalengdwitseudomonsrugosndandyicaldsloatioeng andsplens weildwegdddlutetecesasaigatiosoutiondngisseomogatendotticlue mediumtocalculatetheumbeofviablebacteriaTeungsofthemcewerefedwithitubatioandtainedwithematoxylinosiingand thecllsweresevdtroughiagingsstem.Miceardiacpunctureereefoedtospaatebodandafullutomatedilood analyzerwsudtantiftaiteoodclstroils，podoosldaatengsegte red blood cells，incubate with fluorescently labeled antibody mixture at 4°C ，and analyze by flow cytometry;filtrationof splenic cell homogenatesurfacesgditracellagalysisfetupeatatofng semogeatesudt γ ， IL- 1β ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，KC-GRO，IL-10，IL-17，and TNF- α using a detection kit;ELISA method was used to detect the level of pathogen specficntibodiesiniceserum.ResultomparedwithtegoupimuniedwithLactocouslctisMG36trn，thevectorvacine munizationgroupshowedasignifcantreductioninthladofPseudomonaseruginosainthenasalcavityandlungscausedbyhalgeand thecaievcineouldduceteespatorctdofedomoaserugios;vectorvainouldeetiveldueeieasein lungweightinicecausedbyviralatackssedomoasrugnoifectionladedtoruimentofutrophilsinthelungsoficeile vectorvaccinsoulddueintofplooclearlukocsinlngtisueadiceaseteproportioofiulatigoils; the post viral vectorvaccineimmunizedmice inducedaTh1typeimmuneresponse，increasedthe proportionofTh17cels toCD ⁴⁺ cells in the spleen，andeectielyducdicetroducesigicantIgGdIgatibdies.onlusionisexprintivestigatedte sponseofmicetotepreviouslyonstructedvectorvaccineonfiingthatthevectorvaccecanfectivelypreventandtreatPsedmonas aeruginosa infection，thus providing certain technical support forthe development of Pseudomonas aeruginosa vaccines.

KeyWordsVector vaccine;Immunity;Histology;Hematology;Flow cytometry;Cellfactor

銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，Pa）是臨床常見多重耐藥超級細菌之一，可引起人體燒創傷部位感染、角膜炎、肺炎、敗血癥等；養殖業可引起奶牛或奶羊乳房炎，水貂出血性肺炎，仔豬腹瀉，雛雞各類感染，包括肺炎、肝周炎、心肌炎、敗血癥等，對人體健康和畜牧業造成了極大的危害和經濟損失[1-3]。疫苗免疫可以有效預防和治療銅綠假單胞菌的感染，解決抗生素耐藥導致療效不佳這一難題[4-6]。以乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）為載體的基因工程活載體疫苗安全性高，毒副作用低，可誘導機體產生高水平的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫等各類型的免疫反應，具有極大的發展潛力[7-8]。Pa 外膜蛋白I（Outer membrane protein I，oprI? 可有效刺激機體產生多種免疫應答，且在不同血清型 Pa 之間可以提供交叉保護，是一種優秀的疫苗研制靶蛋白[9-11]筆者旨在解析小鼠對前期構建的表達 Pa 外膜蛋白I重組 L. lactis載體疫苗的免疫應答反應，以期為研發可防治 Pa 感染的重組載體疫苗提供技術依據。

1材料與方法

1.1試劑、實驗動物和菌株表達Pa外膜蛋白I的重組 L. lactis載體疫苗（OprI-pMG36c-MG1363），中國醫學細菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業實驗室構建；紅細胞裂解液、熒光標記抗體混合物、特異性細胞表面受體和細胞內轉錄因子標記物、BD PharmingenTM 轉錄因子緩沖液、Fix/Perm緩沖液 ?.Perm/Wash 緩沖液，美國BD公司生產;V-PlexPlusProInflammatoryPanel1小鼠多重檢測試劑盒、小鼠IL-17超敏試劑盒，美國Meso ScaleDiscovery公司生產； 1% 胎牛血清（FBS），美國ThermoFisherScientific公司生產；多聚甲醛組織固定液、蘇木精和伊紅染液，德國MERCK公司生產；營養瓊脂培養基、假單胞分離瓊脂（PIA）培養基，青島海博生物有限公司生產；其他試劑市售所得，均為AR級。ICR品系清潔級小白鼠，雌性，中國醫學細菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業實驗室自繁自養。銅綠假單胞菌PaO1菌株，為中國醫學細菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業實驗室保存。乳酸乳球菌MG1363菌株，購自寶生物工程（大連）有限公司。試驗在中國醫學細菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業實驗室，于2023年4月至2024年5月進行。

1.2主要儀器EVOSXL細胞成像系統，美國ThermoFisherScientific公司生產；HEMAVET950FS全自動動物血液分析儀，美國DREW公司生產；BDLSRFortessa流式細胞分析儀、Micro-tainer采血管（含EDTA- ?K₂ ），美國BD公司生產；TGL-16GB型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠生產；357538型Dounce玻璃勻漿器，桂寧（上海）實驗器材有限公司生產。

1.3疫苗制備 OprI-pMG36c-MG1363重組菌株按 1%V/V 比例接種含氯霉素（ 6μg/mL ）的GM17液體培養基， 30% 培養 0D₆₀₀ 至1.0，離心收集菌體，PBS溶液洗滌2次，制成濃度5.0×10⁹ CFU/mL菌懸液， 4^°C 保存。

1.4小鼠免疫ICR品系清潔級雌性小白鼠63只，體重 18～ 22g ，平均分成3組：乳酸乳球菌免疫未攻毒組，乳酸乳球菌免疫攻毒組，載體疫苗免疫攻毒組。免疫用的乳酸乳球菌MG1363菌懸液和載體疫苗濃度均為 5.0×10⁹CFU/mL ，免疫方式為灌胃免疫，每7d免疫3次，每次 0.2mL ，共免疫 21d 1.5細菌攻毒銅綠假單胞菌PAO1菌株在營養瓊脂培養基上 37^°C 培養 24h ，將菌體從培養基上拭下，懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中， 2 000×g 離心 15min ，收集沉淀，用新鮮PBS稀釋至 1.0×10⁹CFU/mL，4^°C 保存。首次免疫后第35天，用上述濃度 PaO1 菌株新鮮菌懸液鼻腔黏膜噴霧攻毒，劑量為20μL 分別在攻毒后 ^18h 和7d后，采用頸椎脫白處死法對小鼠實施安樂死，無菌取出每只小鼠的肺和脾臟并稱重。

1.6小鼠呼吸道細菌載量檢測用 1mL 無菌PBS沖洗鼻腔，收集洗鼻液;肺樣本加入 1mL 無菌PBS，勻漿器均質。將每只小鼠的鼻腔沖洗液和肺組織勻漿物連續稀釋并涂布在PIA培養基平板上， 37°C 培養 24～48h ，計算活菌數量。

1.7組織學檢查將攻毒后 ^18h 的小鼠肺部插管，注射1 mL 4%（W/V） 多聚甲醛組織固定液。將樣品在10倍體積的固定液中固定 48h ，蘇木精-伊紅（HE）染色。載玻片在細胞成像系統上放大100倍成像。

1.8血液學分析攻毒后 ^18h ，心臟穿刺分離血液，置于Microtainer采血管（含EDTA- ?K₂ ）中，振蕩。采用全自動動物血液分析儀對總白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞進行定量。

1.9流式細胞術分析用 100μm 細胞過濾器過濾分離肺組織勻漿物， 1200×_g 離心 8min 。沉淀懸浮于 1mL 紅細胞裂解液中， 37^°C 下孵育 3min 。離心，懸浮在含 1% 胎牛血清PBS中，冰上孵育 15min 。細胞與熒光標記抗體混合物在4^°C 暗室中孵育1h，沉淀樣品，懸浮于 500μL PBS中，流式細胞分析儀分析。

攻毒后7d處死的小鼠脾細胞勻漿器均質，細胞過濾器過濾。用特異性細胞表面受體和細胞內轉錄因子標記物對脾細胞進行染色。表面染色細胞 1 200×g ，離心 8min ，懸浮于PBS中。使用轉錄因子緩沖液進行細胞內染色，細胞 4°C，1mL 1× Fix/Perm緩沖液固定和滲透 50min ，用 1mL 1×Perm/Wash 緩沖液洗滌細胞，細胞內染色 50min 。然后將脾細胞沉淀、洗滌并懸浮于 500μL PBS中，流式細胞分析儀分析。

1.10細胞因子分析肺組織勻漿物 15000×g ，離心 5min ，收集上清液，使用小鼠多重檢測試劑盒檢測干擾素 γ（IFN- γ ）、白細胞介素 -1β.IL-2.IL-4.IL-5.IL-6.KC-GRO.IL-10 和 TNF-α 。使用小鼠IL-17超敏試劑盒測量IL-17水平。試驗方法及結果分析按照試劑盒說明書進行。

1.11血清學檢測小鼠攻毒后 ^18h ，采用心臟穿刺分離血液， 15000×g 離心 5min ，收集上清液。小鼠血清中病原特異性抗體采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測。血清樣本1：50 稀釋，加人封閉緩沖液中，然后連續稀釋。ELISA檢測方法參考文獻12-13]。統計學分析軟件為SPSS20.0軟件， Plt;0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1載體疫苗可減少銅綠假單胞菌在呼吸道定殖載體疫苗和乳酸乳球菌菌懸液分別灌胃免疫小鼠后，用PAO1菌株鼻腔攻毒， 18h 后檢測鼻腔和肺部PAO1菌株的定殖情況，結果顯示：與乳酸乳球菌免疫組相比，載體疫苗免疫組小鼠鼻腔和肺部的銅綠假單胞菌載量顯著減少（ Plt;0.01? （圖1）。

2.2載體疫苗可有效減少攻毒后小鼠肺部重量增加機體呼吸道感染銅綠假單胞菌，會引起免疫細胞和體液流入肺部，從而導致肺部重量增加[14]。試驗結果表明，乳酸乳球菌免疫組小鼠攻毒后，與未攻毒小鼠相比，肺部重量增加顯著，這也證實了Kipnis等[4的研究結果；載體疫苗免疫組小鼠在攻毒后肺重量較乳酸球菌免疫組增加明顯減少（圖2）。

2.3載體疫苗可減少肺組織多形核白細胞招募PAO1菌株攻毒后，采集小鼠肺組織，固定，HE染色，切片，組織學分析。乳酸乳球菌免疫組小鼠被攻毒后，可觀察到大量多形核白細胞，而載體疫苗免疫組小鼠肺泡中多形核白細胞相對較少（圖3）。

2.4PAO1菌株攻毒導致小鼠肺部中性粒細胞招募肺組織流式細胞術顯示，小鼠被攻毒后，肺部可觀察到髓系細胞尤其是中性粒細胞顯著增加，這表明銅綠假單胞菌感染導致中性粒細胞在感染的急性期被招募到肺部，這種細胞流入也導致肺重量增加。雖然載體疫苗免疫能夠降低肺重量和肺細胞的招募，但其不會改變招募到肺的先天免疫細胞的整體組成（圖4）。

圖1載體疫苗免疫組和乳酸乳球菌免疫組小鼠鼻腔（A）和肺部（B）細菌載量

圖2PAO1菌株攻毒和未攻毒免疫組小鼠肺部重量增加情況 Fig.2The increase in lung weight in mice of PAO1 stain challenged and control immunized groups

2.5載體疫苗能增加循環中性粒細胞比例攻毒后，小鼠骨髓中會釋放免疫細胞，在血液中循環到達感染部位對抗感染[15]。攻毒后 ^18h 血液學分析表明，乳酸乳球菌免疫組小鼠和載體疫苗免疫組小鼠白細胞總數變化差異不顯著，但是與未攻毒小鼠相比，均差異顯著（ Plt;0.01 （圖5A）。白細胞類型發生了變化，與未攻毒小鼠相比，乳酸乳球菌免疫組攻毒小鼠循環中性粒細胞比例更高，而載體疫苗免疫組攻毒小鼠中更為明顯（ Plt;0.01 （圖5B）。

2.6攻毒可誘導載體疫苗免疫組Th1型免疫反應小鼠感染后，細胞因子能夠促進免疫細胞在血液中循環和感染部位招募[15]。PAO1菌株攻毒 ^18h 后，小鼠肺上清液細胞因子分析表明，與未攻毒小鼠相比，免疫組小鼠攻毒后均會誘導促炎細胞因子 IL-1β，IL-6，GRO/KC，TNF-α 和 IL-10顯著增加；與未攻毒小鼠相比，載體疫苗免疫組小鼠攻毒后 IFN-γ ig.3Imaging of PAO1 strain challenged mice lung slices at 100× magnification增加明顯，這表明載體疫苗免疫后，針對銅綠假單胞菌感染可誘導Th1型免疫反應（圖6）。

圖3PAO1菌株攻毒后小鼠肺切片100倍放大倍數下成像

圖4肺勻漿物單細胞中髓系細胞和中性粒細胞群比例 （n=7） ）Fig.4The ratio of myeloid cells and neutrophilspopulations inunicell of lung homogenate（ n=7 ）

注： *****.Plt;0.001，*****.Plt;0.0001，

2.7載體疫苗免疫可增加脾臟中Th17細胞占CD4+細胞比

例攻毒后7d，小鼠脾細胞流式細胞術分析表明，未攻毒組、乳酸乳球菌免疫組和載體疫苗免疫組小鼠的T細胞總數、 CD4⁺ 或 CD8⁺T 細胞亞群變化不明顯（圖7A）；與未攻毒組相比，載體疫苗免疫組的Th17細胞占 CD4⁺ 細胞比例增加顯著（ （Plt;0.05） （圖7B）。這也證實了上述免疫組小鼠攻毒后 ^18h 檢測到的IL-17增加這一結果，說明載體疫苗免疫在小鼠受到銅綠假單胞菌攻擊時誘導了Th17型免疫載體反應。

2.8載體疫苗可有效誘導小鼠免疫反應 載體免疫組小鼠用

PA01菌株攻毒 18h 后，ELISA法檢測小鼠血清中針對銅綠假單胞菌特異性抗體，結果表明，載體疫苗免疫組IgG和IgA產生明顯，證實了載體疫苗可有效誘導小鼠的免疫反應（圖8）。

Fig.5Proportion of blood cell populations in mice of challenged and control groups（ n=7 ）

圖6免疫后小鼠肺上清液細胞因子水平變化

Fig. 6Changes of cytokine levels in lung supernatant of immunized mice

圖7載體疫苗免疫增加脾臟中Th17細胞占 CD4⁺ 細胞比例

注： ?.Plt;0.05. 0

Fig.7 Vector vaccine immunization increases the proportion of Th17 cells to CD4⁺ cells in thespleen

圖8載體疫苗誘導銅綠假單胞菌特異性抗體產生情況 Fig.8The situation ofspecificantibodiesagainst Pseudomonas aeruginosainducedbyvectorvaccines

注： **.Plt;0.01，***.Plt;0.001

3討論

預防和治療多重耐藥銅綠假單胞菌感染的最好方法就是接種疫苗，但目前尚缺乏免疫效果良好的銅綠假單胞菌疫苗上市。該研究前期構建了表達銅綠假單胞菌外膜蛋白I的乳酸乳球菌活載體疫苗（OprI-pMG36c-MG1363），為了探究小鼠對載體疫苗的免疫應答反應，在首次免疫后第35天，用銅綠假單胞菌對小鼠進行了攻毒試驗，小鼠呼吸道細菌載量檢測、組織學檢查、血液學分析、流式細胞術分析和細胞因子分析結果表明：與乳酸乳球菌MG1363菌株免疫組相比，載體疫苗免疫組小鼠鼻腔和肺部因攻毒引起的銅綠假單胞菌載量明顯減少，載體疫苗可減少銅綠假單胞菌在呼吸道定殖;載體疫苗可有效減少因攻毒引發的小鼠肺部重量增加;銅綠假單胞菌攻毒導致小鼠肺部中性粒細胞招募反應，載體疫苗可減少肺組織多形核白細胞招募，增加循環中性粒細胞比例；攻毒后載體疫苗免疫組小鼠誘導了Th1型免疫反應，增加了脾臟中Th17細胞占 CD4⁺ 細胞的比例，并可有效誘導小鼠產生明顯的IgG和IgA抗體。該研究證實了前期構建的表達銅綠假單胞菌外膜蛋白I的乳酸乳球菌活載體疫苗制備成功，可為研發可防治銅綠假單胞菌感染的疫苗提供技術支持。

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