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遼寧地區不同生境中華絨螯蟹腸道微生物群落研究

2025-08-29 00:00:00劉忠航楊培民張健張伯序朱春月胡宗云
安徽農業科學 2025年15期

開放科學(資源服務)標識碼(OSID):

Study on the Intestinal Microbial Community of Eriocheir sinensis in Different Habitats in Liaoning Province LIU Zhong-hang,YANGPei-min,ZHANGJianetal(LiaoningIsituteofFreshwaterFisheries/LiaoningKeyLaboratoryofAquaticAnimal Diseases Control,Liaoyang,Liaoning )

Abstractoexploeieresintcootaouitositoofocrsiessfrodinthatssdd throughput sequencing and macrogenomic technology to analyze the gut microbiota of E sinensis from five different environments:ponds,paddy fields, reedfieldsesdlessadalst plingguts,dcobalivsitdififtoplsestdsdfdie thoseintheodeedifctalotatifttcobotafroachbiatsodatabdrateeabast main metabolic pathway.The study revealed the impacts of diferent habitats on the structure and function of the E .sinensis’s gut microbiota community,providing a scientific basis for improving the qualityof the culture environment and ensuring the health of E .sinensis.

KeyWords Eriocheir sinensis;High throughput sequencing;Metagenome;Intestinal flora;Habitat

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)又名大閘蟹、河蟹,屬于節肢動物門甲殼動物亞門軟甲綱十足目弓蟹科絨螯蟹屬,是我國極重要的水生經濟養殖甲殼類。在養殖過程中,養殖環境對中華絨螯蟹的生長、健康及品質等方面具有深遠影響[1]。在養殖生態系統中,不同生態環境水體中微生物群落結構存在顯著差異[2]。隨著外部環境的變化,養殖生物的腸道微生物也會發生改變,其通過對外部環境的不斷適應,形成具有各自特點的腸道菌群[3]。腸道微生物是動物體內重要組成部分,能夠在宿主消化吸收、生長發育、免疫調節等方面起重要作用,腸道的穩定有利于宿主的健康生長[4]。研究發現,腸道微生物對于促進腸道屏障的形成和刺激免疫系統的發育起著重要作用[5]

在水產領域,相關學者分別對不同養殖模式下的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[6] 金剛蝦(Penaeus monodon)[7]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[8]等養殖生物的腸道微生物進行了研究,發現隨著養殖模式的改變,養殖生物腸道微生物也會發生一定的變化。茍妮娜等研究發現野生和養殖多鱗白甲魚(Onychostomamacrolepis)腸道微生物組成和多樣性均存在差異。趙柳蘭等[0]對稻田和池塘2種養殖模式下的中華絨螯蟹進行了研究,結果發現不同養殖模式下其腸道微生物隨時間的變化趨勢不同。隨著中華絨螯蟹養殖業的發展,目前我國已探索出多種養殖模式[],如池塘養殖、稻田養殖等,部分地區水庫和葦田等水體也放養一些扣蟹,以達到增收的目的。筆者利用高通量測序和宏基因組技術對池塘、稻田、葦田、水庫人工養殖水域和自然水域的中華絨螯蟹腸道微生物群落進行了研究,探討微生物群落和功能結構與養殖環境的關系,旨在為構建中華絨螯蟹生態健康養殖提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料2022年9月,在遼寧地區采集5種不同生境的中華絨螯蟹,包括池塘、稻田、水庫、葦田和自然水域的中華絨螯蟹。采集的中華絨螯蟹低溫運輸至實驗室后,取其腸道置于無菌EP管中,每管放5個整腸,記為1個重復;每種生境設置3個重復。取樣后將EP管置于 -80°C 冰箱中保存,用于后續的DNA提取。

1.2 方法

1.2.116S高通量測序。使用QIAampFastDNA試劑盒從中華絨螯蟹腸道樣本中提取微生物DNA。利用 NanoDrop-1000分光光度計(ThermoFisherScientific)測量DNA濃度,并利用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳評估DNA質量。使用引物338F ( 5 -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和 806R( 5- GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3 )在退火溫度 56°C 下擴增16SrRNA基因的V3~V4高變區。純化PCR產物后,用于構建測序文庫。文庫構建完成后,在美吉生物有限公司的Ilu-mina MiSeq 測序平臺(Illumina)上進行測序[12]

1.2.2宏基因組測序。使用CovarisM220自動聚焦聲波基因組剪切儀(Gene Company Limited,China)將提取的DNA片段化,目標片段平均大小約 400bp ,以構建雙端文庫。利用

NEXTflex RapidDNA-Seq 試劑盒(Bioo Scientific,Austin,TX,USA)構建雙端文庫,在文庫構建過程中將含有全套測序引物雜交位點的接頭連接到DNA片段平端。在IlluminaNo-vaSeq6000平臺上進行雙端測序,使用MEGAHITv1.1.2對高質量reads進行組裝,從每個組裝的重疊群中預測開放閱讀框(ORF),最小長度設置為 100bp 。使用 CD-Hit(v4.6.1) 對預測的ORF進行聚類,設置序列同一性和覆蓋率為 90% ,構建非冗余基因目錄。使用SOAPaligner(v2.21)將非冗余基因目錄中的代表性序列在NCBI網站的NR數據庫中進行比對,進行基因分類和功能注釋[13]

1.3數據處理數據以平均值 ± 標準差表示,利用SPSS17.0統計軟件進行統計分析,采用單因素方差分析(One-wayAVOVA)和Duncan's多重比較檢驗進行差異顯著性分析(Plt;0.05) 。

2 結果與分析

所有樣本按最小序列數(22531reads)抽平,得到963個操作性分類單元(OTUs),分類注釋得到門水平28類、綱水平72類、目水平165類、科水平272類、屬水平458類、種水平670類。從圖1可以看出,5種生境中華絨螯蟹腸道微生物群落的Shannon多樣性指數稀釋曲線趨于平緩,表明22531個序列可以滿足后續分析的要求。

圖1基于OTUs分析的5種生境下中華絨螯蟹腸道微生物群落Shannon多樣性指數稀釋曲線

Fig.1Shannon diversity index rarefaction curve of Eriocheir sinensisgutmicrobiotain5kindsofhabitatsbasedon OTUs analysis

2.1微生物物種組成門水平上中華絨螯蟹腸道微生物群落組成如圖2所示。5種生境中華絨螯蟹腸道微生物菌群主要為厚壁菌門(Firmicutes)變形菌門(Proteobacteria)擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteriota)等,僅豐度占比發生了一些變化。其中,池塘中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為厚壁菌門( 86.24% )、變形菌門( 10.22% )擬桿菌門( 2.30% )放線菌門 (0.73%) )等;稻田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為厚壁菌門( 70.55% )、擬桿菌門( 17.20% )、變形菌門( 9.98% )鑌骨細菌門(Patescibacteria,1.00% )等;水庫中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為厚壁菌門( 84.73% )、變形菌門( 11.28% )、擬桿菌門 (1.67%) )、放線菌門 (1.42%) )等;葦田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為厚壁菌門( 76.58% )、變形菌門 (9.44% )、擬桿菌門1 6.41% )、放線菌門 (4.56% )等;自然水域中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為厚壁菌門( 64. 10% )、變形菌門( 30.78% )、擬桿菌門( 4.55% )、放線菌門 (0.37% 等。

圖25種生境下門水平上中華絨螯蟹腸道微生物群落組成Fig.2Community composition of Eriocheir sinensis gut micro-biotaatthephylumlevelin5kindsofhabitats

屬水平上中華絨螯蟹腸道微生物群落組成如圖3所示。從豐度占比來看,主要包括桿狀念珠菌屬(Candidatusbacillo-plasma)、肝原體念珠菌屬(Candidatushepatoplasma)、ZOR0006屬和不動桿菌屬(Acinetobacter)等。池塘中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為桿狀念珠菌屬( 41.34% )、肝原體念珠菌屬( 37.32% )、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter,6.93% )、norank_f__Mycoplasmataceae屬( 3.88% )、ZOR0006屬 (2.11% )等;稻田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為桿狀念珠菌屬 ( 46.70% )、擬桿菌屬(Bacteroides,9. 03% )、norank_f__Mycoplasmataceae屬( 8.82% )、肝原體念珠菌屬(5.72% )等;水庫中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為桿狀念珠菌屬 (39.88% )肝原體念珠菌屬( 26.68% )、不動桿菌屬( 8.43% )norank_f_Mycoplasmataceae屬 (7.11% )等;葦田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為桿狀念珠菌屬( 43.42% )、ZOR0006屬(17. 38% )、難生單胞菌屬(Dysgonomonas, 5.21% )肝原體念珠菌屬 (3.19% 等;自然水域中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比主要為桿狀念珠菌屬( 40.95% ) ΩJ00006 屬( 16.52% )、不動桿菌屬( 14.81% )弧菌屬 (Vibrio,11.80% )等。

2.2微生物群落多樣性分析對5種生境中華絨螯蟹腸道微生物群落進行多樣性分析,結果如表1所示。葦田中華絨螯蟹腸道微生物群落的Shannon多樣性指數最高且顯著高于自然水域和池塘中華絨蟹( Plt;0.05) ;葦田中華絨蟹腸道微生物群落ACE指數最高,但各生境中華絨螯蟹腸道ACE指數沒有顯著差異( Pgt;0.05) ;葦田中華絨螯蟹腸道微生物群落Chao指數最高,顯著高于稻田中華絨蟹( Plt;0.05) ,但與其他生境沒有顯著差異( (Pgt;0.05) ;稻田中華絨螯蟹腸道微生物群落Heip指數最高,顯著高于池塘中華絨蟹( Plt;0.05) ,但與其他生境中華絨螯蟹沒有顯著差異( (Pgt;0.05) 。

表15種生境下中華絨螯蟹腸道微生物群落多樣性的比較

Table1Comparisonof the intestinal microbial communitydiversity inEriocheirsinensis infive kinds of habitats

注:同列不同小寫字母表示差異顯著( ?Plt;0.05) 。Note:Different smalllettersin thesame column indicated significant differences( (Plt;0.05)

2.3微生物Veen圖如圖4所示,5種生境中華絨蟹腸道共有菌屬為80個;池塘中華絨螯蟹腸道特有菌屬16個,稻田中華絨螯蟹腸道特有菌屬28個,水庫中華絨螯蟹腸道特有菌屬5個,葦田中華絨螯蟹腸道特有菌屬81個,自然水域中華絨螯蟹腸道特有菌屬37個。

圖45種生境下屬水平上中華絨螯蟹腸道微生物群落Veen圖Fig.4Veendiagramofintestinal microbita ofEriocheirsinensisatgenuslevelin5kindsofhabitats

2.4腸道微生物宏基因組功能注釋分析

2.4.1腸道微生物宏基因組CAZy注釋。基于CAZy數據庫的5種生境中華絨螯蟹腸道微生物群落功能基因注釋結果如圖5所示。池塘中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是糖苷轉移酶類(Glycosyltransferases, 35.95% )糖苷水解酶類(Glycosidehydrolases, 32.12% )、碳水化合物酯酶類(Carbohydrateesterases, 22.72% );稻田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是糖苷水解酶類( 48.15% )、糖苷轉移酶類( 30.53% )、碳水化合物酯酶類( 14.45% );水庫中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是糖苷水解酶類( 42.63% )、糖苷轉移酶類( 29.97% )、碳水化合物酯酶類 19.01% ;葦田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是糖苷水解酶類( 37.28% )、糖苷轉移酶類( 29.73% )、碳水化合物酯酶類( 23.28% );自然水域中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是糖苷水解酶類( 42.93% )、糖苷轉移酶類( 27.56% )、碳水化合物酯酶類( 22.10% )。

圖55種生境下中華絨螯蟹腸道微生物群落功能基因CAZy注釋圖 Fig.5CAZy annotation of functional genesin the intestinal microbial community inEriocheirsinesisin5kindsofhabitats

2.4.2腸道微生物宏基因組KEGG注釋。基于KEGG數據庫的5種生境中華絨螯蟹腸道微生物群落功能基因1級水平注釋結果如圖6所示。池塘中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是遺傳信息處理(Geneticinformationpro-cessing, 33.79% )代謝(Metabolism, 24.75% )、人類疾病(Hu-mandiseases, 15.34% );稻田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是代謝 (37.40% )、遺傳信息處理 25.84% )、環境信息處理( 13.95% );水庫中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是代謝 (42.77% )、遺傳信息處理( 22.59% )、環境信息處理( 15.62% );葦田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是代謝( 33.83% )、遺傳信息處理 21.00% )環境信息處理( 15.20% );自然水域中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是代謝( 48.22% )、遺傳信息處理( 17.66% )、環境信息處理( 17.19% )。

圖65種生境下中華絨螯蟹腸道微生物群落功能基因KEGG1級注釋圖

Fig.6 KEGG level 1 annotation of functional genesin the intestinalmicrobialcommunityin Eriocheirsinesisin5kinds ofhabitats

圖7為基于KEGG數據庫的5種生境中華絨蟹腸道微生物群落的功能基因2級水平注釋結果。池塘中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是全局與概述圖譜(Global and overview maps,15. 38% )、翻譯(Translation,12.50% )、碳水化合物代謝(Carbohydratemetabolism,5.63% );稻田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是全局與概述圖譜( 22.00% )、翻譯( 8.24% )、碳水化合物代謝( 7.82% );水庫中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是全局與概述圖譜( 24.44% )、碳水化合物代謝(8.22%) )、翻譯 8.21% );葦田中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是全局與概述圖譜( 19.72% )、碳水化合物代謝( (6.67%) 翻譯 (5.56%) ;自然水域中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比排名前3位的是全局與概述圖譜( 26.86% )、碳水化合物代謝( 9.06% )、膜運輸 (7.09% )。

3討論

3.1微生物物種組成該研究門水平上5種不同生境中華絨螯蟹腸道微生物最大豐度的優勢菌群均為厚壁菌門,此結果與新疆向陽湖中華絨螯蟹的研究結果[14相一致,而太湖水域中華絨螯蟹腸道微生物群落則以變形菌門為主[15]。在不同生境中,稻田中華絨螯蟹腸道微生物較其他生境中華絨螯蟹發生了明顯變化:擬桿菌門微生物豐度占比升高,成為第二大優勢菌門,擬桿菌門在多糖分解中發揮著重要作用[;豐度占比排名第四的是髖骨細菌門,此菌門在其他生境中華絨螯蟹腸道中豐度占比較低。龔骨細菌門多為厭氧菌[17],是河流水體中檢出的優勢菌門[18],而稻田灌溉可能是此菌門微生物進人稻田的主要途徑。

該研究屬水平上5種生境中華絨螯蟹腸道微生物中桿狀念珠菌屬均作為優勢菌屬被檢出,該菌屬也在長江口中華絨螯蟹體內作為優勢菌屬被檢出[19]。檸檬酸桿菌屬為池塘中華絨螯蟹腸道微生物相對豐度第三的菌屬,此菌屬中的菌種可參與反硝化反應和重金屬鉛、鎘、鋅的吸附[20],在喀麥隆池塘中同樣檢出此菌屬,且其表現出多重耐藥性,普遍存在于含高濃度有機廢物的養殖池塘中[21]。稻田中華絨螯蟹腸道微生物相對豐度第二的菌屬為擬桿菌屬,這可能與稻田中植物比較豐富有關。葦田中華絨螯蟹腸道優勢菌屬新出現了難生單胞菌屬,此菌屬曾在人類膽囊[22]和黃翅大白蟻后腸道中分離出來[23],這些細菌以分解復雜有機化合物的能力而聞名。它們參與多糖和其他大分子的分解,促進厭氧生態系統中的發酵過程。水庫中華絨螯蟹腸道優勢菌屬主要為桿狀念珠菌屬和肝原體念珠菌屬,這2種菌屬豐度總占比高達 66.56% 。自然水域中華絨螯蟹腸道優勢菌屬中檢出弧菌屬微生物,豐度占比 11.80% 。這可能是因為自然水域中華絨螯蟹生存環境比較復雜,某些致病菌的來源比較廣泛,其他4種生境中華絨螯蟹苗種均為人工培育,人工育苗過程會對致病菌的流入進行控制。

3.2微生物群落多樣性Shannon多樣性指數是反映樣本微生物群落多樣性的常用指標,ACE指數和Chao指數是反映樣本微生物群落豐富度的常用指標,Heip指數是反映樣本微生物群落均勻度的常用指標。微生物群落多樣性分析結果表明,葦田中華絨螯蟹腸道微生物Shannon多樣性指數、ACE指數和Chao指數均最高,說明葦田中華絨蟹腸道微生物最為穩定。池塘中華絨螯蟹腸道微生物的各項多樣性指標與其他生境相比都處于較低水平,其穩定性較差,這可能與人工投喂和清塘等活動有關。

3.3微生物Veen圖Veen圖分析結果表明,桿狀念珠菌屬為所有生境中華絨螯蟹腸道微生物的共有菌屬,且占有較高比例,這與物種組成分析結果相一致。池塘中華絨螯蟹腸道特有菌屬相對豐度最高的是副桿菌屬,此屬菌與異戊酸的合成有關[24],并在高脂肪日糧動物腸道中發揮著重要的調節作用[25]池塘中華絨螯蟹的食物主要來自人工投喂的飼料,其食物組成中脂肪的含量在5種生境中最高。稻田中華絨螯蟹腸道特有菌屬相對豐度最高的是變形菌屬,此菌屬曾作為中華圓田螺(Cipangopaludinacathayensis)腸道優勢菌屬被檢出[26]。稻田較其他生境田螺數量更多,稻田中華絨螯蟹可能攝食了更多的田螺,從而影響了其腸道微生物組成。水庫中華絨螯蟹腸道特有菌屬最少,相對豐度最高的特有菌屬為RBG-16-58-14菌屬,這種菌屬比較少見,尚未見到相關報道。葦田中華絨蟹腸道特有菌屬最多,特有菌屬相對豐度最高的是鼠孢菌屬。GoBner等[27]從黑色燈芯草(Juncusroemerianus)中分離出鼠孢菌屬菌株,燈芯草也是葦田比較常見的植物,這說明燈芯草可能也是葦田中華絨螯蟹的食物組成成分。自然水域中華絨螯蟹特有菌屬相對豐度最高的是黃桿菌屬,這種菌屬廣泛存在于自然水域中,在太湖水體[28]、白洋淀水體[29]和麗水沉積物[30]中均有檢出,并具備一定的豐度,是自然水域普遍存在的菌屬。綜上可知,不同生境影響中華絨螯蟹腸道的特有菌屬,并與其食物組成具有密切的關系。

3.4中華絨螯蟹腸道宏基因組功能注釋分析

3.4.1腸道微生物宏基因組CAZy注釋。碳水化合物活性酶(carbohydrate-activeenzymes,CAZy)是機體代謝中極為重要的酶,主要包括糖苷水解酶類、糖基轉移酶類、多糖裂解酶類等,能夠降解、修飾及生成體內糖苷鍵。這一領域研究的深入開展對于理解微生物碳水化合物的代謝機制具有重大意義。通過比對碳水化合物活性酶數據庫[31(CAZy),將不同物種來源的碳水化合物活性酶劃分為六大類蛋白質家族。5種生境中華絨螯蟹腸道中,糖苷轉移酶類、糖苷水解酶類和碳水化合物酯酶類豐度占比均位列前三。5種生境中,池塘中華絨螯蟹腸道中糖苷轉移酶類豐度占比最高,可能是因為池塘人工投喂較多,改變了其自然攝食的食物組成,飼料代替了自然攝食的一些水草和小魚、小蝦等。研究發現,在飼料中添加外源性碳水化合物活性酶(如纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶)也可增加腸道中相關酶類的含量和活性[32]研究發現,一些哺乳動物和鳥類的腸道上皮細胞能夠通過水解酶和轉運蛋白活性及數量的調節,對高碳水化合物和蛋白質的飲食進行適應[33]

3.4.2腸道微生物宏基因組KEGG注釋。KEGG數據庫(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)是系分析基因功能,聯系基因組和功能信息的大型知識庫[34],主要包括各種代謝通路、合成通路、膜轉運、信號傳遞、細胞周期以及疾病相關通路等。5種生境中華絨螯蟹腸道微生物KEGG1級注釋結果表明,池塘生境中華絨螯蟹腸道中遺傳信息處理豐度占比最高,而其他生境代謝豐度占比最高,這2種功能基因在各生境中華絨螯蟹腸道微生物中占主要部分。中華絨螯蟹作為重要的可食用水產動物之一,其與人類疾病相關的微生物也是重點關注的研究方向。從注釋結果來看,池塘中華絨螯蟹腸道中與人類疾病相關的微生物豐度占比較高,自然水域中華絨螯蟹腸道中與人類疾病相關的微生物豐度占比較低,這可能是由于相較于野生自然環境,池塘養殖人為干預較為嚴重,容易帶入一些相關病原。池塘養殖人工投喂較多,容易造成有機質的累積,從而滋生一些致病菌。研究發現,水體中營養物質的含量和養殖生物較高的放養密度會提高感染人畜共患傳染病的可能性[35]。從KEGG2級注釋結果來看,全局與概述圖譜功能微生物在各生境中華絨螯蟹腸道中占比均最高。在代謝方面,5種生境均以碳水化合物代謝為主,這表明中華絨螯蟹在各個生境中均以攝食碳水化合物為主,這些相關微生物能幫助分解某些不易消化的碳水化合物,使宿主獲得更多的能量[36]

4結論

該研究利用高通量測序和宏基因組技術對5種不同生境中華絨螯蟹腸道微生物進行研究,發現其雖然生境不同,但腸道優勢菌門變化不大,豐度最高均為厚壁菌門,其他占比較大的菌門也變化不明顯,僅稻田中華絨螯蟹腸道微生物發生了較大的變化。屬水平上,5種生境中華絨螯蟹腸道微生物豐度占比最高的均為桿狀念珠菌屬,但各生境中其他的優勢菌屬發生了一定變化,如葦田中華絨螯蟹腸道新出現了豐度占比較高的難生單胞菌屬,自然水域中華絨螯蟹腸道中弧菌屬豐度占比較高。對中華絨螯蟹腸道微生物群落多樣性進行分析,發現葦田各項多樣性指標均較高,微生物最為穩定,而池塘穩定性較差。通過微生物Veen圖分析發現,各生境中華絨螯蟹腸道特有菌群中的優勢菌群與其生活環境密切相關,這也表明環境對養殖生物腸道微生物有重要影響。通過宏基因組CAZy注釋發現,5種生境中華絨螯蟹腸道中糖苷轉移酶類、糖苷水解酶類和碳水化合物酯酶類豐度占比均位列前三。通過對5種生境中華絨螯蟹腸道宏基因組KEGG注釋發現,池塘中華絨螯蟹腸道攜帶較多人類疾病相關的微生物,自然水域中華絨螯蟹最少,5種生境代謝均以碳水化合物代謝為主。該研究系比較了不同生境中華絨螯蟹腸道中的微生物群落及其功能結構,分析了不同生境對中華絨螯蟹腸道微生物群落的影響,為優化養殖模式、構建健康養殖體系提供了理論指導。

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