脫水時間對超低溫保存橡膠樹花藥愈傷組織生理指標的影響

摘" 要：超低溫保存可降低橡膠樹花藥愈傷組織長期繼代發生的遺傳變異風險，是長期保存愈傷組織的有效方法。為評價脫水時間對超低溫保存過程中橡膠樹花藥愈傷組織與抗性相關生理指標的影響，本研究將花藥愈傷組織于植物玻璃化溶液（plant vitrification solution， PVS）PVS2中分別脫水0、10、20、40 min后進行超低溫保存24 h，分析脫水時間對超低溫保存前后愈傷組織中可溶性蛋白、丙二醛（MDA）含量、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性等生理指標的影響。結果顯示：脫水時間對超低溫保存后花藥愈傷組織中可溶性蛋白、MDA含量、SOD和POD活性具有顯著影響（Plt;0.05），而對CAT活性無顯著影響。除MDA外，超低溫保存后每個脫水時間的各生理指標值均高于保存前。脫水40 min的花藥愈傷組織超低溫保存后，其可溶性蛋白含量、CAT、SOD和POD活性均達最大值，分別為129.63 μg/mL、627.30 U/g、290.38 U/g、25 643.33 U/g，MDA含量最低，為41.31 nmol/g，表明脫水40 min可明顯增強超低溫保存后愈傷組織細胞的持水能力和抗氧化水平。進一步對脫水40 min后超低溫保存的花藥愈傷組織進行復蘇，平均存活率在70%以上，且能誘導易碎胚性愈傷系的形成，平均誘導率為13.33%，為橡膠樹花藥愈傷組織超低溫保存再生奠定生理基礎。

關鍵詞：橡膠樹；花藥愈傷組織；超低溫保存；脫水時間；生理指標；存活率中圖分類號：S794.1 """""文獻標志碼：A

Effects of Dehydration Duration on Physiological Parameters of Rubber Tree Anther Callus Tissue During Cryopreservation

ZHOU Quannan¹， JI Xin⁴， WU Yinle⁴， LI Ji¹， YANG Xianfeng^1，2，3， WU Rizhi¹， HUANG Tiandai^1，2，3*

1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Haikou Key Laboratory of Tropical Plant Seedling Innovation / Key Laboratory of Rubber Tree Biology and Genetic Resources Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Crop Cultivation Physiology / Cultivation Base of State Key Laboratory Jointly Built by the Province and Ministry， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Sanya Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya， Hainan 572025， China; 3. National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding， Sanya， Hainan 572025， China; 4. College of Tropical Crops， Yunnan Agricultural University， Pu’er， Yunnan 665099， China.

Abstract： Cryopreservation can reduce the risk of genetic variation in the long-term subculture of rubber tree anther callus tissue， and is an effective method for long-term preservation of callus tissues. To evaluate the effects of dehydration duration on physiological parameters during cryopreservation， rubber tree anther calli were treated with plant vitrification solution PVS2 for 0， 10， 20 and 40 min and then cryopreserved for 24 h in this study. Physiological parameters related to stress resistance were analyzed， including soluble protein content， malondialdehyde （MDA） content， and activities of catalase （CAT）， superoxide dismutase （SOD）， and peroxidase （POD） during cryopreservation. Dehydration duration had a significant effect on soluble protein content， MDA content， SOD and POD activities in callus tissues after cryopreservation， while showing no significant impact on CAT activity. All physiological parameters （except MDA） exhibited higher values after cryopreservation compared to pre-preservation levels across all dehydration durations. After 40 min of dehydration and cryopreservation， the soluble protein content， CAT， SOD and POD activities of anther callus reached the maximum value， which was 129.63 μg/mL， 627.30 U/g， 290.38 U/g and 25 643.33 U/g， with the lowest MDA content of 41.31 nmol/g. The findings indicate that dehydration for 40 min significantly enhances water retention capacity and antioxidant level in cryopreserved callus cells. Post-thawing viability tests revealed that 40 min dehydrated callus maintained over 70% survival rate and could induce fragile embryogenic callus formation with an average induction rate of 13.33%. This study establishes a physiological foundation for the regeneration of cryopreserved rubber tree anther callus.

Keywords： rubber tree; anther callus tissue; cryopreservation; dehydration duration; physiological parameters; viability

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.010

超低溫保存是指將生物材料，如植物組織、細胞等在液氮中（?196"℃）長期保存，此溫度下細胞分裂和新陳代謝活動停滯，降低了離體組織培養長期繼代所帶來的遺傳變異風險，是目前熱帶作物種質資源離體保存的主要方式之一^[1-3]，已廣泛應用于木薯^[4]、橡膠^[5]、菠蘿^[6-7]、咖啡^[8-9]、椰子^[10-11]等。植物材料在超低溫保存過程中會發生生理代謝紊亂、細胞膜受損、活性氧脅迫等，材料經凍存后存活的組織可能具有一定的抗脅迫和較強的生活力^[12-13]。研究顯示，超低溫保存過程中芍藥花粉的過氧化氫含量隨保存時間的增加而顯著提高，與花粉生活力顯著相關^[14]。脫水處理和不同冷凍方法對龍眼種子過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及丙二醛（MDA）、可溶性糖和蛋白質含量具有顯著影響^[15]。含水量為30%的蘋果休眠芽在超低溫保存過程中脂質組分發生重構，抗氧化物酶活性升高，超低溫保存后休眠芽再生率可達90%以上^[16]。水稻萌發胚芽在超低溫保存預培養、植物玻璃化溶液（plant vitrification solution， PVS）PVS2處理過程中發生氧化脅迫，活性氧大量累積，抗氧化系統發生響應，抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（ASA）等的含量及抗氧化相關酶SOD、CAT等的活性顯著改變^[17]。

天然橡膠是重要的工業原料和戰略物資，橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）是天然橡膠的主要來源。橡膠樹花藥愈傷組織是良好的遺傳轉化受體，但是花藥的獲取受季節限制，且長期繼代可能導致胚性愈傷組織發生體細胞變異^[18]，而超低溫保存不僅能將花藥愈傷組織長期保存，還能有效遏制愈傷組織體細胞發生變異。前期，團隊已初步建立了橡膠樹花藥愈傷組織的超低溫保存體系^[5]，發現花藥愈傷組織預培養3 d，采用60%的PVS2預處理20 min后，于PVS2溶液中干燥脫水40 min，可使超低溫保存后花藥愈傷組織存活率達到70%以上^[5]。目前，還未見有關脫水時間對超低溫保存后花藥愈傷組織生理指標影響方面的報道。為進一步評價不同脫水時間對超低溫保存前后橡膠樹花藥愈傷組織相關生理指標的影響，本研究將花藥愈傷組織于PVS2溶液中分別干燥脫水0、10、20、40 min后進行超低溫保存，分析脫水時間對超低溫保存愈傷組織中與抗性相關的可溶性蛋白含量、CAT、SOD、POD活性和MDA含量等生理指標的影響，并進一步對脫水40 min后超低溫保存的花藥愈傷組織進行復蘇和誘導易碎胚性愈傷系的形成。本研究為橡膠樹花藥愈傷組織超低溫保存再生奠定生理基礎，為其他作物超低溫保存體系的建立提供理論參考。

1 "材料與方法

1.1 "材料

以定植于中國熱帶農業科學院橡膠研究所儋州試驗基地的橡膠樹無性系熱研73397為試驗材料，采集春季幼嫩雄花花藥作為外植體。

1.2" 方法

1.2.1" 外植體的超低溫保存處理" 將接種培養40"d的橡膠樹熱研73397花藥愈傷組織于改良MS培養基（附加5%蔗糖和5%二甲基亞砜）中室溫（25±2）℃避光預培養3 d后轉移至凍存管中。采用玻璃化超低溫處理方法，先在裝有花藥愈傷組織的凍存管中加入5"mL 60% PVS2溶液（30%甘油+15%二甲基亞砜+15%乙二醇+0.4"mol/L蔗糖），20 min后將溶液吸出。然后加入PVS2溶液5 mL，于冰水混合物中分別干燥脫水0、10、20、40 min后將溶液吸出，再加入PVS2溶液5 mL，將凍存管于液氮中保存24 h后于40"℃水浴解凍。測定比較超低溫保存前后不同脫水時間花藥愈傷組織與抗性相關生理指標。

1.2.2 "生理指標測定" 可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法^[15]，CAT活性測定采用分光光度法^[19]，SOD活性測定采用氮藍四唑光化還原法^[20]，POD活性測定采用愈創木酚法^[21]，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法^[17]。

1.2.3" 花藥愈傷組織的復蘇及易碎胚性愈傷系的誘導" 將脫水處理40 min的花藥愈傷組織經超低溫保存24 h后于40"℃水浴解凍，然后將解凍后的花藥愈傷組織倒入空培養皿中，吸凈PVS2溶液后加入洗滌液（M1培養基附加1.2 mol/L蔗糖）浸泡清洗10 min，重復清洗3次后吸凈洗滌液，將洗滌后的花藥愈傷組織接種至M1培養基（改良MS+1.5"mg/L KT+1.5""mg/L 2，4-D+1.5"mg/L NAA+0.1 g/L肌醇+0.3 g/L天冬酰胺+50 mL/L椰子水+2.2 g/L植物凝膠，pH 5.8）。跟蹤觀察花藥愈傷組織發生及恢復情況，40 d后統計愈傷組織存活率。觀察恢復后新生長的愈傷組織結構，在新愈傷組織達到5 mm左右，顯微鏡下觀察記錄表型，挑出轉至新鮮M1培養基中進行增殖繼代培養，每2～3周繼代1次，直至形成穩定的易碎胚性愈傷系。愈傷組織存活率=（愈傷存活數/超低溫處理的愈傷數）×100%，易碎胚性愈傷系誘導率=（易碎胚性愈傷系個數/超低溫處理的愈傷數）×100%。

1.3" 數據處理

所有試驗均重復3次。使用IBM SPSS Statistics 22軟件對數據進行統計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）、Duncan’s多重比較方法（α=0.05）對生理數據進行處理。使用Microsoft Excel 2016軟件作圖。

2 "結果與分析

2.1" 脫水時間對超低溫保存前后橡膠樹花藥愈傷組織可溶性蛋白含量的影響

由圖1可知，超低溫保存前后，花藥愈傷組織可溶性蛋白含量均隨著脫水時間的延長而增加，且均在脫水40 min時達到最大值，分別為103.93、129.63 μg/mL，顯著高于對照組（0"min）。超低溫保存前后，脫水0、10、20 min的花藥愈傷組織的可溶性蛋白含量均差異不顯著。超低溫保存后各脫水時間點的可溶性蛋白含量均較保存前升高，但差異不顯著。

2.2" 脫水時間對超低溫保存前后橡膠樹花藥愈傷組織CAT活性的影響

由圖2可知，脫水時間對花藥愈傷組織CAT活性影響差異不顯著，且超低溫保存前后，花藥愈傷組織CAT活性均隨著脫水時間的延長而增強，均在脫水40 min時達到最大值，分別為512.55、627.30 U/g，分別較對照組增加68.85、114.75 U/g。超低溫保存后各脫水時間點的CAT活性均高于保存前。

2.3 "脫水時間對超低溫保存前后橡膠樹花藥愈傷組織SOD活性的影響

由圖3可知，脫水時間對花藥愈傷組織SOD活性的影響差異顯著。超低溫保存前后，花藥愈傷組織SOD活性均隨著脫水時間的延長而顯著增強，且均在脫水40"min時達到最大值，分別為273.24、290.38 U/g。脫水40 min時，超低溫保存后花藥愈傷組織SOD活性高于保存前17.14 U/g，但二者差異不顯著。超低溫保存后各脫水時間的SOD活性均高于保存前。

2.4" 脫水時間對超低溫保存處前后橡膠樹花藥愈傷組織POD活性的影響

由圖4可知，超低溫保存前，脫水時間對花藥愈傷組織POD活性差異不顯著。超低溫保存后，花藥愈傷組織POD活性隨脫水時間的延長而增強，且在脫水40"min時達到最大值25"643.33 U/g，顯著高于脫水0、10、20 min時的POD活性。脫水40 min時，超低溫保存后花藥愈傷組織POD活性比保存前高13 311.67 U/g。超低溫保存后各脫水時間的POD活性均顯著高于保存前。

2.5" 脫水時間對超低溫保存前后橡膠樹花藥愈傷組織MDA含量的影響

由圖5可知，超低溫保存前，花藥愈傷組織MDA含量隨脫水時間的延長呈顯著增加，在40 min時達到最大值（43.26"nmol/g）；超低溫保存后，MDA含量隨脫水時間的延長呈顯著下降，在脫水40"min時降到最低值（41.31"nmol/g）。除脫水40"min外，超低溫保存后花藥愈傷組織的MDA含量均較保存前高。

2.6 "超低溫保存后橡膠樹花藥愈傷組織復蘇及誘導易碎胚性愈傷系

花藥愈傷組織經40 min脫水后進行超低溫保存和復蘇處理。結果顯示，3個處理組（處理1、2、3）的愈傷（每組30個愈傷）在超低溫保存后，分別有23、22、21個愈傷復蘇存活，存活率分別為76.67%、73.33%、70.00%。90個愈傷中共有66個存活，平均存活率為73.33%（表1）。3個處理組形成的易碎胚性愈傷系分別為5、3、4個，易碎胚性愈傷系誘導率分別為16.67%、10.00%、13.33%。90個愈傷中共形成12個易碎胚性愈傷系，平均易碎胚性愈傷系誘導率為13.33%（表1）。愈傷組織的復蘇、增殖及易碎胚性愈傷系的形成如圖6所示。

3 "討論

超低溫保存可降低橡膠樹花藥愈傷組織長期繼代發生的遺傳變異風險，是長期保存花藥愈傷組織的有效方法。超低溫保存主要包括預處理、脫水處理和液氮保存等步驟，其中脫水處理能避免植物材料在液氮冷凍過程中形成的大量冰晶對細胞造成的破壞，提高超低溫保存后植物材料的再生率，是超低溫保存中至關重要的步驟。橡膠樹花藥愈傷組織于PVS2溶液中不同脫水時間對超低溫保存后的存活率具有顯著影響，其中脫水40 min的愈傷組織超低溫保存后存活率最高^[5]。為進一步了解脫水時間對超低溫保存花藥愈傷組織與抗性相關生理指標的影響，本研究分析橡膠樹花藥愈傷組織于PVS2溶液中脫水0、10、20、40 min進行超低溫保存前后其可溶性蛋白、MDA含量以及CAT、SOD、POD等抗氧化酶活性的變化，并進一步對脫水40 min后超低溫保存的花藥愈傷組織進行復蘇和誘導易碎胚性愈傷系的形成。

可溶性蛋白可增強植物細胞的持水能力，提高細胞的抗冷性，降低因結冰產生的細胞損傷。本研究結果顯示，隨著脫水時間的延長，超低溫保存前后花藥愈傷組織中可溶性蛋白含量均明顯提高，在40 min時達到最大值，且超低溫保存后的可溶性蛋白含量均高于保存前，表明延長脫水時間可增強愈傷組織的抗低溫能力，有利于超低溫保存后愈傷組織的存活。一些研究如任悅等^[22]將水曲柳合子胚經脫水后進行超低溫保存，其可溶性蛋白含量提高，增加了存活率；山茶花粉經超低溫保存后可溶性蛋白含量明顯增加^[23]；含水量為36.78%的龍眼種子經玻璃化冷凍后可溶性蛋白含量也顯著提高^[15]，這些結果與本研究的結果類似。

植物組織在超低溫保存過程中會產生大量活性氧，導致氧化脅迫，引起抗氧化酶活性改變^[24-25]。植物酶促清除系統主要包括SOD、CAT、POD、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等^[26]。本研究結果表明，脫水時間對超低溫保存后花藥愈傷組織SOD和POD活性具有顯著影響，而對CAT活性無顯著影響，SOD和POD活性隨脫水時間延長而明顯增強，這說明SOD和POD可能在活性氧清除及花藥愈傷組織抗低溫脅迫、抗氧化損傷中發揮重要作用。脫水40 min時花藥愈傷組織超低溫保存后CAT、SOD和POD活性均高于其他脫水時間，說明脫水40 min可明顯提升超低溫保存后愈傷組織的抗氧化能力，有利于超低溫保存后愈傷組織存活。有研究結果表明，超低溫保存后的油棕合子胚和胚性愈傷組織中過氧化氫含量顯著增加，SOD、POD、CAT、APX等酶的活性發生顯著變化^[25]；含水量為20%和30%的蘋果休眠芽在超低溫保存后，其抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性顯著高于含水量為40%的蘋果休眠芽，可能有助于清除過多的活性氧，促進休眠芽存活^[16]；李珊珊等^[15]研究表明，脫水處理顯著提高了玻璃化超低溫保存后龍眼種子SOD活性，CAT、POD活性也有一定提高，認為將龍眼種子脫水后再進行超低溫保存可減輕活性氧積累導致的細胞膜傷害。以上研究結果進一步說明，適宜的脫水處理能提高超低溫保存后植物組織中的抗氧化酶活性，進而提升超低溫保存后植物的再生率。

MDA是衡量細胞膜氧化損傷程度的重要指標。本研究中，超低溫保存前，MDA含量隨脫水時間延長而呈顯著增加趨勢，而超低溫保存后則呈顯著下降趨勢。說明超低溫保存前延長脫水時間導致細胞膜氧化損傷加劇，而超低溫保存后延長脫水時間逐漸減輕了氧化損傷。脫水40 min時MDA含量最低，說明脫水40 min可有效降低由超低溫保存引發的氧化損傷。這與任悅等^[22]經玻璃化超低溫保存后的水曲柳合子胚中MDA含量隨脫水時間的延長而逐漸降低的研究結果類似。而大苞鞘石斛原球莖在超低溫保存過程中MDA含量顯著升高，解凍后MDA含量達到最大值^[27]，說明超低溫保存過程中其細胞膜脂過氧化程度加劇。此外，益智種子在液氮冷凍過程中MDA含量則呈先上升后下降趨勢，直至趨于穩定^[28]。這些研究表明超低溫保存對植物細胞MDA含量具有顯著影響。

綜合以上研究結果可知，脫水40 min的橡膠樹花藥愈傷組織超低溫保存后，其可溶性蛋白含量、CAT、SOD和POD活性最高，MDA含量最低，表明脫水40 min可明顯增強超低溫保存后愈傷組織細胞的持水能力和抗氧化水平，有利于超低溫保存后愈傷組織存活，從生理角度證明40"min是橡膠樹花藥愈傷組織超低溫保存適宜的脫水時間^[5]。在此研究基礎上，對超低溫保存后橡膠樹花藥愈傷組織進行復蘇，結果顯示，脫水處理40 min的花藥愈傷組織經超低溫保存后的平均存活率在70%以上，這與之前的研究結果一致^[5]。花藥愈傷組織經進一步誘導形成易碎胚性愈傷系，平均誘導率可達13.33%。本研究不僅為橡膠樹花藥愈傷組織超低溫保存再生奠定生理基礎，也為其他作物超低溫保存體系的建立提供理論參考。

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