基于固相萃取–高效液相色譜串聯質譜的土壤中多種抗生素殘留檢測方法研究

潘" 政^1，4，李" 琪¹，孫寶利³，趙麗霞²，林" 玲¹，馬會芳¹，查玉兵^1*，袁志華^2*，鄧卯英¹，葉劍芝¹

摘" 要：由于抗生素殘留種類多、濃度低，需要建立一種靈敏度高、選擇性強、高效準確的同時檢測土壤中多種抗生素殘留的方法。本研究擬通過優化提取條件（浸提劑類型、提取方式、避光、隔夜處理）及凈化條件（固相萃取小柱類型）建立一種固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），同時測定土壤中20種抗生素。在優化后的條件下，目標抗生素在線性范圍0.10～100.00 μg/kg內線性良好，R²在0.9951～0.9999之間；回收率范圍在62%～116%之間，相對標準偏差為0.9%～16.8%；檢出限范圍為0.01～0.50 μg/kg，定量限為0.04～2.00 μg/kg。該方法已應用于天津市武清區設施菜地土壤中抗生素殘留的檢測，結果表明：4類抗生素在土壤中均有不同程度檢出，最多可同時檢出16種目標物，土壤中抗生素的總殘留濃度為2.52～142.00 μg/kg，最高濃度為105.00 μg/kg（土霉素）。本研究建立的方法旨在為土壤中抗生素檢測方法標準的制訂提供參考，并為新污染物防控提供方法學基礎。

關鍵詞：抗生素；固相萃?。煌寥溃灰合嗌V-串聯質譜；回收率中圖分類號：O657.63 """""文獻標志碼：A

Simultaneous Determination of Multiple Antibiotics in Soil Based on Solid-phase Extraction-high Performance Liquid Chromatography- tandem Mass Spectrometry （LC-MS/MS）

PAN Zheng^1，4， LI Qi¹， SUN Baoli³， ZHAO Lixia²， LIN Ling¹， MA Huifang¹， ZHA Yubing^1*， YUAN Zhihua^2*， DENG Maoying¹， YE Jianzhi¹

1. Agricultural Products Processing Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Risk Assessment Laboratory for Quality and Safety of Agricultural Products Processing， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524001， China; 2. Agro-Environmental Protection Institute， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Innovative Team of Biological Reduction of Organic Pollution in Agricultural Soil / Key Laboratory of Original Agro-Environmental Pollution Prevention and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Tianjin Key Laboratory of Agro-Environment and Agro-Product Safety， Tianjin 300191， China; 3. Institute of Agricultural Environment and Sustainable Development， Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory for Agricultural Environment， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100081， China; 4. Sanya Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya， Hainan 572025， China

Abstract： It is necessary to establish a sensitive， selective， efficient and accurate method for the simultaneous detection of multiple antibiotic residues in soil. In this study， the method of solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） for the determination of 20 antibiotics simultaneously in soil was established by optimizing the extraction conditions （extractant type， extraction method， shading and overnight） and the purification conditions （cartridge type）. Under the optimized analysis conditions， the target antibiotics showed good linearity in the linear range of 0.10-100.00 μg/kg， with R² ranging from 0.9951-0.9999. The recovery ratio ranged from 62%-116%， the relative standard deviation was 0.9%-16.8%， the limit of detection was 0.01-0.50 μg/kg， and the limit of quantification was 0.04-2.00 μg/kg. The method was applied for the detection of antibiotic residues in soil samples collected from greenhouse vegetable bases in Wuqing district， Tianjin， China. It showed that 4 classes of antibiotics were detected in the soil， and up to 16 of target antibiotics could be detected simultaneously. The total residual concentration of antibiotics in the soil varied from 2.52-142.00 μg/kg. The highest concentration of individual antibiotic was 105.00 μg/kg （oxytetracycline）. The method established in the study is aim to provide reference for the formulation of the standard for the simultaneous detection of multiple antibiotic residues in soil and provide methodological basis for the prevention and control of emerging contaminants.

Keywords： antibiotics; solid phase extraction （SPE）; soil; liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）; recovery ratio

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.019

自《新污染物治理行動方案》發布以來，抗生素受到越來越多的關注，其在環境介質（尤其是土壤）中的防控已成為當前環境科學與工程領域的熱點研究問題^[1]；并且抗生素已被納入《重點管控新污染物清單（2023年版）》，同時聯合國環境規劃署也將其納入六大新興污染物名單中^[2-3]，在全球范圍內部署開展污染調查戰略。我國不僅是人口大國，同時也是抗生素生產、使用大國^[4]。目前，已在不同環境介質（地下水、地表水、海水、土壤）中檢出近70種抗生素^[5]，其中，土壤樣品中檢出44種抗生素，殘留水平為μg/kg～mg/kg，主要包括4種四環素類抗生素（TCs）、16種喹諾酮類抗生素（QNs）、15種磺胺類抗生素（SAs）及9種大環內酯類抗生素（MLs）；并且其檢出率、殘留濃度均高于發達國家^[6]。前述研究均依托于抗生素殘留檢測技術展開，但不同研究選用的目標抗生素種類、提取方法、檢測方法等均存在差異，致使試驗結果不具備可比性，因此需要建立一種高效便捷、靈敏度高、選擇性強的同時測定土壤中多種抗生素殘留的方法。

檢測技術的開發很大程度上依賴于分析儀器的發展。近年來，國內外抗生素檢測技術不斷更新迭代，從微生物學檢測法發展到色譜法再發展至色譜串聯質譜法，其中，高效液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）因其高效、準確和靈敏等特性，同時克服了微生物法費時、極易污染、假陽性等不足，又因氣相色譜法選擇性差、敏感性差等缺點，成為當前抗生素測定的主流方法^[7]。目前，僅有少數國家、地區或國際組織制定了土壤中抗生素的檢測分析方法標準，如美國環保署采用超聲輔助提取-固相萃?。⊿PE）-LC-MS/MS（EPA method 1694）檢測土壤中包括TCs、SAs、MLs等45種抗生素，并從多個方面進行方法學驗證，結果表明EPA method 1694法的加標回收率為50%～214%，檢出限為0.22～48.00 μg/kg^[8]。然而，該法將目標抗生素分為4組，并且每組的液相色譜條件（流動相、流動相梯度、電噴霧離子化模式等）差異較大，實際檢測分析樣品（尤其大批量樣品）時耗時長、效率低。我國開展關于土壤中抗生素檢測方法的研究起步相對較晚，目前已發布的土壤中抗生素殘留檢測方法標準有3個，分別為NY/T 3787—2020、DB36/T 1841—2023、T/GDSES 3—2022，擬制訂的方法標準有8個^[9]。上述標準可檢測17種抗生素，前處理方法多為緩沖液/有機溶劑提取，固相萃取富集、凈化后利用LC-MS/MS進行測定，加標回收率為47%～ 118%，檢出限為0.10～3.70 μg/kg，相對標準誤差（RSD）為0.8%～6.7%。此外，孟明輝等^[10]基于QuEChERS方法通過優化提取方法、凈化吸附劑比，建立了土壤中20種抗生素同時測定的LC-MS/MS法，回收率為61.4%～118.9%，檢出限為2.00～5.30 μg/kg，RSDlt;20.0%。孫寶利等^[11]通過優化加速溶劑萃取參數和固相萃取凈化條件，建立了土壤中4種TCs殘留的LC-MS/MS法，回收率為60.1%～103.8%，檢出限為2.2～3.2 μg/kg，RSD為2.6%～4.8%。胡鈺等^[7]通過優化固相萃取條件、

提取條件及質譜條件建立了SPE-UPLC-MS/MS法同時測定土壤中30種抗生素，回收率為44.8%～ 164.0%，檢出限為0.013～1.210 μg/kg，RSD為0.7%～14.8%。前人研究雖已針對提取條件、固相萃取條件、凈化條件、液相色譜條件、質譜條件等進行優化，但仍有部分抗生素的回收率不甚理想。南瓊等^[12]綜述了國內外常用的抗生素檢測方法，并對檢測限、回收率進行總結，指出需圍繞改善抗生素前處理方法技術進行研究。鑒于此，針對土壤中抗生素殘留檢測方法標準相對缺乏，本研究擬通過優化提取條件（浸提劑類型、提取方式、避光處理、隔夜處理）及凈化條件（固相萃取小柱類型），以建立一種固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法（SPE-HPLC-MS/MS），同時檢測土壤中多抗生素殘留，旨在為土壤中抗生素檢測方法標準的制訂提供參考。

1 "材料與方法

1.1 "材料

參考前人的研究結果^[13-15]，本研究選取的20種目標抗生素如表1所示，抗生素標準品均購自天津阿爾塔科技有限公司。除四環素類抗生素（TCs）的標準品為粉末外，7種喹諾酮類抗生素（QNs）、6種磺胺類抗生素（SAs）、3種大環內酯類抗生素（MLs）混合標準品均為濃度100 mg/L的溶液。其中4種TCs標準品包含強力霉素（DOX，純度gt;98.7%）、四環素（TC，純度gt;96.3%）、土霉素（OTC，純度gt;93.8%）和金霉素（CTC，純度gt;81.5%）；7種QNs標準品包含ENR、NOR、PEF、CIP、OFL、SAR、LOM；6種SAs標準品包含SDZ、SPD、SM、SMZ、SDM、SMX；3種MLs標準品為ERY、ROX、TYL。

化學試劑：磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、草酸、氫氧化鈉均為分析純，購自麥克林生物化學有限公司；磷酸、鹽酸均為分析純，購自國藥集團；甲酸為LC-MS級，購于賽默飛世爾科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸為HPLC級，購于美國Fisher公司。

磷酸鹽緩沖液：準確稱取27.20 g磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）溶于水中，并加入1.30 mL H₃PO₄溶液，定容至1.00 L Mcllvaine緩沖溶液（pH=6.80± 0.05）：將1.00 L 0.40 mol/L磷酸氫二鈉溶液與294.00 mL 0.20 mol/L檸檬酸溶液混合均勻，pH約為6.80。Na₂EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液的配制：0.10 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液、Mcllvaine緩沖溶液與甲醇按1∶1∶2（V/V）比例混勻，用氫氧化鈉或鹽酸溶液調節pH=7.20±0.05。

主要試驗儀器和耗材：SCIEX Exion LC高效液相色譜，SCIEX QTRAP 4500串聯四級桿質譜（美國，SCIEX AB公司）；Kinetex F5 100 ?色譜柱100 mm×2.1 mm×2.6 μm（飛諾美公司）；多管渦旋混合儀（杭州奧盛公司）；高速冷凍離心機（美國BECKMAN COULTER公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮公司）；SHZ-D循環水式多用真空泵（河南予華公司）；Fotector Plus全自動固相萃取儀（廈門睿科公司）；N-EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）；超聲波清洗器（德國Elma公司）；渦旋振蕩器（美國Thermo公司）；0.22 μm濾膜[頗爾（中國）有限公司]；HLB固相萃取小柱（500 mg，6 mL）購于Waters公司及上海安譜實驗科技股份有限公司，PEP、PEP-2、PEP-Plus固相萃取小柱（500 mg，6 mL）均購自天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" 標準溶液及標準曲線的繪制 "TCs母液配制：準確稱取4種標準品各0.5000 g，溶于甲醇并定容至50.00 mL，分別配制成濃度為10 000 mg/L四環素、金霉素、土霉素、強力霉素的工作母液，于4"℃冰箱中避光保存。用甲醇配置上述4種抗生素的混合標準工作溶液，濃度為1000"mg/L，4"℃避光保存。

用甲醇將以上標準儲備液稀釋配制成10 mg/L的20種抗生素的混合標準溶液，以空白土壤的基質溶液為溶劑，將10 mg/L抗生素的混合標準溶液逐級稀釋成0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合標準溶液。

1.2.2" 土壤樣品的制備 "供試土壤樣品采自天津市西青區設施菜地臨近的露天大田土壤，為典型潮土。pH為7.73，有機質含量為36.0 g/kg，堿解氮含量為73.6 mg/kg，速效磷含量為28.7 mg/kg，速效鉀含量為148.0 mg/kg。土壤樣品用預先清洗過的不銹鋼鉆采集。在每個點采集5個樣品（0～ 20"cm），組成1份混合樣品。所有土壤樣品均在低溫條件下盡快運至實驗室。冷凍干燥、混勻、研磨、過60目（0.25 mm）篩，稱取約200"g土樣避光保存，用于抗生素分析測定。

1.2.3" 試驗設計" （1）浸提劑類型：無機-有機復合浸提劑因其高效、適應多種抗生素、減少干擾等，成為提取土壤中抗生素殘留的理想選擇。本研究選取磷酸鹽緩沖溶液-Na₂EDTA-乙腈、Na₂EDTA-乙腈、Mcllvaine-Na₂EDTA-乙腈作為研究對象，探究不同類型浸提劑對土壤中20種抗生素同時測定的影響。

（2）提取方式：①渦旋可通過破壞土壤顆粒結構，釋放被吸附的抗生素；超聲產生的高溫高壓微環境可破壞土壤顆粒和有機質，釋放抗生素；因此，渦旋、超聲輔助提取均可應用于土壤樣品中抗生素的前處理，尤其適用于難提取的抗生素。本研究探究渦旋提取、超聲輔助提取對土壤樣品中抗生素回收率的影響。②抗生素在土壤中除可被微生物降解外，也會發生光解、水解等，如：TCs（TC、DOX）、QNs（CIP、OFL）、SAs（SDZ）、MLs（ROX）等在光照下易發生光解；MLs（ROX）在酸性環境中也易水解，因此在提取時應特別注意以防土壤中抗生素光解或水解。本研究設置對照（不避光）、避光處理探究光照對土壤樣品中抗生素回收率的影響。其中，避光提取時，試驗所用離心管、梨形瓶等器材在提取全程使用鋁箔紙包裹進行避光。③抗生素大多為兩性物質，土壤含帶有負電性的有機質及具有多孔隙的粘土礦物質，對抗生素具有較強吸附作用，而難被提取，延長土壤與浸提劑的反應時間即隔夜處理可能會提高土壤中抗生素的回收率。本研究通過設置隔夜提取、現取現用2個處理組探究延長土壤與浸提劑的反應時間對目標抗生素回收率的影響。隔夜提取時，提前向土壤樣品中加入浸提劑，靜置過夜（12 h左右）次日提??；現取現用時，次日向土壤樣品中加入浸提劑，其他處理與隔夜提取一致，并且同時進行后續提取步驟。

（3）固相萃取小柱：5種固相萃取小柱分別為Waters HLB、CNW HLB、PEP、PEP-2、PEP-Plus。

1.2.4" 抗生素提取" 準確稱取5.00 g過60目篩的土壤樣品于50.00 mL離心管中，依次加入0.40 g Na₂EDTA、10.00 mL磷酸鹽緩沖液和10.00 mL乙腈溶解，2500 r/min渦旋5 min，8000 r/min離心5 min，將上清液全部轉入雞心瓶中。分別再加入5.00 mL磷酸鹽緩沖液、乙腈重復提取1次，合并上清液。40 ℃旋蒸至低于15.00 mL以完全去除乙腈，旋蒸液過0.45 μm尼龍濾膜，再用超純水稀釋至80.00 mL，用甲酸調節其pH至4.00±0.10，開始過PEP-2固相萃取小柱，采用全自動固相萃取儀過固相萃取小柱，全自動固相萃取程序如表2所示。過柱前，預先用6.00 mL甲醇、6.00 mL超純水（用甲酸調節其pH至4.00）活化PEP-2固相萃取小柱；過柱后，用6.00 mL甲醇洗脫PEP-2固相萃取小柱。室溫下將洗脫液氮吹至近干，1.00 mL甲醇-水溶液（1∶1，V/V）復溶，3000 r/min渦旋30 s，過0.22 μm尼龍濾膜，4 ℃保存，待LC-MS/MS上機。

1.2.5" 液相色譜和質譜分析條件" 色譜條件：Kinetex F5 100 ?色譜柱（100 mm×2.1 mm× 2.6"μm），用于色譜分離，柱溫為40 ℃；進樣體積為5 μL；流速為0.40 mL/min。二元梯度泵，流動相A為0.1%甲酸–水溶液，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序（表3）。

質譜條件：離子源為電噴霧電離（ESI⁺）；氣簾氣流速（CUR）為30 psi；碰撞氣流速（CAD）為median；噴霧電壓（IS）為5500 V；霧化溫度（TEM）為550 ℃；霧化氣（GS1）為55 psi；輔助氣（GS2）為55 psi。檢測方式為MRM。各物質的檢測參數見表4。

1.2.6" 質量控制與質量保證" 采用外標法定量。以濃度為0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0"μg/kg的7個標準溶液建立濃度–響應面積的標準曲線，決定系數（R²）均大于0.99。

1.3 "數據處理

所有統計分析均使用Microsoft Excel 2013和SPSS 23.0軟件進行。使用Origin 9.0軟件繪制箱形圖、柱狀圖。

2 "結果與分析

2.1 "提取條件的優化

2.1.1 "浸提劑的選擇 "不同類型浸提劑對土壤中20種目標抗生素回收率的影響如圖1所示。采用磷酸鹽緩沖溶液-Na₂EDTA-乙腈提取時，目標抗生素的回收率為63.6%～102.0%，滿足《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）的相關要求。利用Na₂EDTA-乙腈提取時，目標抗生素的回收率為54.0%～91.2%；Mcllvaine- Na₂EDTA-乙腈作為浸提劑時，目標抗生素的回收率為55.6%～83.7%。就抗生素類型而言，3種不同浸提劑提取土壤中MLs的回收率均高于其他3類抗生素；3種不同浸提劑提取土壤中NOR、SDM、SMX的回收率均偏低。由此可知，磷酸鹽緩沖溶液-Na₂EDTA-乙腈提取土壤中20種抗生素的回收率高于其他浸提劑，推薦將其作為土壤中多種抗生素同時測定的浸提劑。

2.1.2 "超聲輔助提取、渦旋及提取時間的選擇" 渦旋、超聲輔助提取對土壤樣品中抗生素回收率的影響如圖2所示。結果表明：渦旋提取土壤中目標抗生素的回收率為61.6%～104.0%；超聲提取土壤中目標抗生素的回收率為63.0%～97.5%（圖2）。進一步研究發現，渦旋提取土壤中20種目標抗生素的回收率優于超聲輔助提取，推薦土壤樣品中抗生素的前處理時優先采用渦旋提取。同時，本研究也探究了渦旋時間、超聲輔助提取時間對土壤中目標抗生素回收率的影響。由圖2可知，渦旋5 min時土壤中目標抗生素的回收率高于渦旋20 min，超聲5 min時土壤中目標抗生素的回收率也高于超聲20 min；可能原因是渦旋或超聲時間過長使抗生素在土壤中降解增加、吸附增強，并且可能從土壤中釋放更多干擾物質，影響后續的提取和檢測。因此，在渦旋或超聲輔助提取土壤中抗生素時應選取合適的提取時間，建議以5 min為宜，避免提取時間過長損壞目標抗生素引起回收率降低^[17]。此外，前人研究表明超聲對目標抗生素的提取幾乎無影響，為提高處理效率，不采用超聲輔助提取^[10]，這與本文的研究結果一致。簡言之，土壤樣品中抗生素的前處理時優先采用渦旋提取，提取時間為5 min。

2.1.3 "避光、隔夜處理" 由圖3可知，避光處理土壤中目標抗生素的回收率范圍為58.1%～104.0%；而不避光處理土壤中目標抗生素的回收率范圍為60.0%～106.0%。進一步研究發現，避光處理組抗生素的回收率與不避光處理無明顯差異，表明避光對目標抗生素的提取幾乎無影響。這可能與光照時長、光照強度、光照波長等有關。因此，為節本增效，本研究在提取土壤中的抗生素時采用不避光處理。此外，無論是否避光處理，土壤中SAs及MLs中的ROX、TYL的回收率均處于較低水平，這可能與SAs的不穩定性及其易受光照、氧化、水解、pH和金屬離子等影響有關，而土壤中QNs、TC、OTC及ERY的回收率相對較高。

本研究通過設置隔夜提取、現取現用2個處理組探究延長土壤與浸提劑的反應時間對目標抗生素回收率的影響，結果如圖4所示。由此可知，隔夜提取處理土壤中目標抗生素的回收率范圍為53.5%～88.8%；而現取現用土壤中目標抗生素的回收率范圍為62.6%～104.0%（圖4）。進一步研究發現，現取現用處理組土壤中目標抗生素（尤其是TCs、QNs）的回收率高于隔夜提取處理。可能原因是隔夜提取時間過長使土壤中有機質和顆粒物等釋放，使基質效應增強，進而致使抗生素回收率降低。因此，在提取土壤中抗生素時浸提劑宜現配現用，同時采取現取現用的方式加入到土壤中，盡量避免過夜處理。

綜合上述分析可知，同時測定土壤中多種抗生素的前處理條件為：以磷酸鹽緩沖溶液-Na₂EDTA-乙腈作為浸提劑，2500 r/min渦旋5 min，8000 r/min離心5 min；浸提劑現配現用，以現取現用的方式加入到土壤中，試驗全程不避光、不過夜，提取步驟重復一次，得到上清液；上清液待濃縮、凈化后進一步上LC-MS/MS測試。

2.2 "凈化條件的優化

為了進一步降低基質效應，提取完成后將含有目標抗生素的上清液加入到固相萃取小柱中，利用全自動固相萃取儀進行下一步凈化。選取文獻及市售的5種固相萃取小柱作為研究對象^{[7， 11， 18-19]}，通過向土壤基質加標100 μg/kg的20種目標抗生素標準樣品，比較5種固相萃取柱的凈化效率和回收率，結果見圖5。其中，5種固相萃取柱的回收率分別為：51.4%～103.0%（Waters HLB）、51.8%～97.3%（CNW HLB）、53.1%～103.0%（PEP）、61.4%～96.8%（PEP-2）、55.6%～94.5%（PEP-Plus）。就抗生素的總體回收率而言，5種固相萃取柱的凈化效率差異不明顯。就TCs的回收率而言，僅CNW HLB、PEP-2固相萃取柱的回收率滿足回收率須在60.0%～120.0%范圍內的要

求；就QNs的回收率而言，Waters HLB、PEP固相萃取柱的回收率與其他3種固相萃取柱相比偏低；就SAs的回收率而言，PEP-Plus固相萃取柱的凈化效率最低，其回收率低于其他4種固相萃取柱；就MLs的回收率而言，僅PEP-2固相萃取柱的回收率滿足回收率相關的要求。綜合分析可知，PEP-2固相萃取柱對20種目標抗生素標的凈化效果均較好，具有較大潛力成為土壤中抗生素提取時的凈化材料。此外，就5種固相萃取柱的價格而言，Waters HLB（2978元/30支）gt; CNW HLB（1250元/30支）gt;PEP（1134元/30支）gt;PEP-2（970元/30支）gt;PEP-Plus（955元/ 30支），值得注意的是，Waters HLB固相萃取柱的單價約為PEP-2的3倍，而Waters HLB固相萃取柱是當前大多數關于抗生素提取的凈化材料。就20種目標抗生素的回收率而言，同時綜合考慮凈化效率、價格、貨期等因素，本研究推薦將PEP-2作為土壤中抗生素提取時的最佳凈化材料。就QNs、SAs的回收率而言，Waters HLB、CNW HLB、PEP、PEP-2及PEP-Plus均可用作土壤中抗生素提取時的凈化材料，可根據自身需求靈活選擇。

2.3" 方法驗證

本研究通過線性范圍、回收率、精密度和檢出限對土壤中抗生素的提取方法進行驗證，并與國內外廣泛采用的抗生素測定方法進行對比。

2.3.1 "回收率和精密度" 在空白土壤樣品

中分別添加2個濃度水平（10.0、100.0 μg/kg）的20種抗生素的混合標準溶液，進行加標回收試驗，每個濃度水平設置平行，其回收率和標準偏差如表5所示。結果表明，2個添加水平的回收率范圍在62%～116%之間，相對標準偏差為0.9%～16.8%。前人研究結果表明土壤中抗生素的回收率范圍為19.4%～164.0%，RSD范圍為0.7%～ 16.3%^{[7， 10-11， 17-23]}；現行3個標準方法（NY/T 3787—2020、DB36/T 1841—2023、T/GDSES 3—2022）的加標回收率為47%～118%，RSD為0.8%～6.7%；EPA method 1694法的加標回收率為50%～214%^[8]。由此可知，本研究的回收率介于前人研究結果間、與現有標準方法接近，準確度與前人研究結果相一致，且略低于現有標準方法。

2.3.2 "檢測限、定量限和線性范圍" 檢出限（以3倍的信噪比計）為0.01～0.50 μg/kg（表5）。前人研究結果表明土壤中抗生素的檢出限為0.0002～ 16.5000 μg/kg^{[7， 10-11， 17-23]}；現行3個標準方法（NY/ T 3787—2020、DB36/T 1841—2023、T/ GDSES 3— 2022）的檢出限為0.10～3.70 μg/kg；EPA method 1694法的檢出限為0.22～48.00"μg/kg^[8]。由此可知，本研究的檢出限介于前人研究結果間，低于現有標準方法，表明本方法的靈敏度較高。根據前處理方法，獲得空白土樣的基質溶液。由空白基質配制的7個濃度水平（0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg）的標準工作曲線，根據分析，得出20種目標抗生素的線性方程和相關系數及線性范圍（表6）。目標抗生素在線性范圍呈良好的線性，決定系數（R²）在0.9951～0.9999之間（表6）。

2.3.3" 實際樣品檢測" 在天津市武清區設施菜地采集土壤樣品10個，菜地種植年限為7～20 a，種植作物主要為菠菜、西芹、甜瓜等。每個樣品約2 kg，自然風干后過60目篩，提取并進行測試。4類抗生素在土壤中均有不同程度檢出，最多可同時檢出16種目標物，其中SPD、SMR、SDT、ERY的檢出濃度低于檢出限。土壤中抗生素的總殘留濃度范圍為2.52～142.00 μg/kg（圖6），其中TCs：2.37～114.00 μg/kg；QNs：0.70～28.00 μg/kg；SAs：0.01～0.16 μg/kg；MLs：nd～0.64 μg/kg。此外，TCs檢出率及平均檢出濃度最高，在所有樣品均被檢出，最高檢出為OTC，濃度高達105.00 μg/kg；QNs在所有樣品也均被檢出，最高檢出濃度為12.50 μg/kg（ENR）；SAs的平均檢出率為30.0%，其中SDM的檢出率為100.0%，且檢出濃度最高（0.16 μg/kg）；MLs的平均檢出率為36.7%，最高檢出濃度為0.64 μg/kg（ROX）。土壤中抗生素的平均濃度為：21.60（TCs）gt;6.85（QNs）gt;0.10（MLs）gt;0.09（SAs），由此可知，土壤中殘留的抗生素類型主要為TCs及QNs。

3 "討論

在本研究中，磷酸鹽緩沖溶液-Na₂EDTA-乙腈提取土壤中20種抗生素的回收率高于其他浸提劑，推薦將其作為土壤中多種抗生素同時測定的浸提劑。胡鈺等^[7]采用乙腈-Na₂EDTA-Mcllvaine緩沖液作為同時測定土壤中抗生素的浸提劑；孫寶利等^[11]研究表明EDTA-McIlvaine-甲醇對土壤中抗生素的提取效果最佳。劉瀟雅等^[17]通過正交試驗優化土壤中抗生素的提取條件得出相似的結論，即乙腈-磷酸鹽緩沖液為最佳提取液，這也與前人的研究結果一致^[17-19]。可能原因是乙腈的極性較強；Na₂EDTA作為重金屬螯合劑可以鈍化土壤中的重金屬進而釋放被吸附的抗生素，同時磷酸鹽溶液作為離子抑制劑可以有效消除色譜峰圖拖尾的現象，進一步提高優化效率^[17]。

渦旋提取土壤中20種目標抗生素的回收率優于超聲輔助提取，推薦土壤樣品中抗生素的前處理時優先采用渦旋提取。同時，無論采取渦旋還是超聲提取，土壤中目標抗生素的回收率隨提取時間延遲而降低，即處理5 min時目標抗生素的回收率高于處理20 min。渦旋或超聲時間過長強化了抗生素在土壤中的吸附、降解，并釋放更多干擾物質，進而降低提取效率，致使目標抗生素的回收率降低。前人得出相似的研究結論，即超聲幾乎不會影響目標抗生素的回收率，為提高處理效率，不采用超聲輔助提取^[10]。因此，土壤樣品中抗生素采用渦旋5 min提取。

目標抗生素的回收率在避光與不避光處理中無明顯差異；并且隔夜提取處理組土壤中目標抗生素（尤其是TCs、QNs）的回收率低于現取現用。隔夜提取可能通過釋放土壤中有機質和顆粒物增強基質效應，降低抗生素提取效率。在提取土壤中抗生素時，浸提劑不宜加入到土壤中過夜，應現取現用加入到土壤中。此外，楊曉蕾等^[20]探究了Oasis HLB小柱和HyperSep PEP小柱對土壤中抗生素的萃取效果，表明HLB小柱的回收率高于PEP小柱。郭欣妍等^[19]研究表明HLB固相萃取柱串聯SAX強陰離子交換柱可有效降低土壤的基質效應，土壤樣品的基質效應由55%～180%變為75%～160%。孫寶利等^[11]探究了Oasis-HLB、Oasis-HLB與MAX串聯、Oasis-MAX固相萃取柱對土壤中抗生素提取的凈化效率和回收率，表明串聯柱的回收率低于單柱并且MAX柱的凈化效果優于HLB柱，并最終選取Oasis-MAX固相萃取柱用于凈化富集。就20種目標抗生素的回收率而言，同時綜合考慮凈化效率、價格、貨期等因素，本研究推薦將PEP-2作為土壤中抗生素提取時的最佳凈化材料。

綜上所述，土壤中多種抗生素同時測定的前處理條件為：磷酸鹽緩沖溶液-Na₂EDTA-乙腈為浸提劑，現配現用，以現取現用的方式加入到土壤中，試驗全程不避光。渦旋（2500 r/min）5 min，離心（8000 r/min）5 min；重復提取步驟一次，合并上清液；經SPE濃縮過PEP-2柱后待上LC-MS/MS測試。本研究的回收率、準確度均處于可接受范圍；與前人研究結果、現有標準方法均具有可比性。

4" 結論

（1）通過對提取條件、凈化條件的優化，并進行方法驗證，建立了基于SPE法同時檢測土壤中20種抗生素殘留的LC-MS/MS的方法；（2）目標抗生素在線性范圍0.10～100.00 μg/kg內線性良好，R²在0.9951～0.9999之間；回收率范圍為62%～116%，相對標準偏差為0.9%～16.8%；檢出限范圍為0.01～0.50 μg/kg；（3）SPE-LC-MS/MS法已被應用于土壤中多種抗生素殘留的檢測，可為新污染物防控提供方法學基礎。

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