黃瓜綠斑駁花葉病毒MP基因的原核表達及抗血清制備

摘" 要：黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）是危害瓜類作物的重要植物病毒之一，其運動蛋白（movement protein， MP）在病毒傳播和致病過程中起關鍵作用。本研究通過RT-PCR克隆CGMMV的MP基因，構建原核表達載體pET-32a-MP，并在大腸桿菌BL21（DE3）中成功誘導表達分子量約48 kDa的重組MP融合蛋白。利用鎳柱親和層析純化獲得高純度蛋白（純度≥80%），以此免疫新西南大白兔制備多克隆抗體。Western blot和ELISA分析表明，抗血清效價達409 600，且能特異性識別CGMMV侵染葉片中的MP蛋白，與煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）等其他病毒無交叉反應。本研究實現了CGMMV MP蛋白的原核高效表達與特異性抗體制備，為病毒快速檢測、免疫組織化學及蛋白功能研究提供重要工具，對保障瓜類作物安全生產具有重要意義。

關鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒；運動蛋白；原核表達；抗血清中圖分類號：S642.2 """""文獻標志碼：A

Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of the Movement Protein Gene of Cucumber Green Mosaic Virus

REN Chunmei， CHENG Zhaobang， YANG Liu， LI Shuo， WANG Haitao， LU Fang， JI Yinghua^*

Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing， Jiangsu 210014， China

Abstract： Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） is one of the important plant viruses that harm melon crops， and its movement protein （MP） plays a key role in virus transmission and pathogenicity. This study cloned the MP gene of CGMMV through RT-PCR， constructed the prokaryotic expression vector pET-32a-MP， and successfully induced the expression of a recombinant MP fusion protein with a molecular weight of approximately 48 kDa in Escherichia coli BL21 （DE3）. Purification of high purity protein （purity degree≥80%） using nickel column affinity chromatography was used to prepare polyclonal antibodies against the New Southwest White Rabbit. Western blot and ELISA analysis showed that the titer of the anti serum reached 409 600， and it could specifically recognize the MP protein in CGMMV infected leaves， without cross reactivity with other viruses such as Tobacco mosaic virus （TMV） and Watermelon mosaic virus （WMV）. The study would provide important tools for rapid virus detection， immunohistochemistry， and protein function research， which is of great significance for ensuring the safe production of melon crops.

Keywords： Cucumber green mottled mosaic virus; sports protein; prokaryotic expression; antiserum

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.016

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）隸屬于帚狀病毒科（Virg-av-iridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）^[1]，是一種主要危害瓜類作物的重要植物病毒，其典型癥狀表現為葉片斑駁、褪綠及果實畸形等，影響瓜類作物的產量和品質，對瓜類作物的產業安全構成嚴重威脅^[2-3]。目前，全球范圍內已有超過20個國家報道過CGMMV發生^[4]，我國自2005年在遼寧省蓋州市首次發現西瓜植株感染該病毒以來^[5]，已在廣西^[6]、廣東^[7]、湖南^[8]、云南^[9]、海南^[10]、山東^[11]、甘肅及上海^[12]等地形成區域性流行。本實驗室自2012年在江蘇地區開展CGMMV的調查結果也顯示，CGMMV已在江蘇成功定殖并形成穩定的種群分布，其中設施栽培西瓜上危害最為嚴重，常連片發生，重病田損失率達50%以上，嚴重影響了江蘇省西甜瓜的安全生產^[13-14]。

CGMMV病毒粒子為直棒狀，無膜^[15]，是一種正義線性單鏈RNA病毒，基因組全長約為6400"bp，分別編碼129 kDa復制酶、186"kDa復制酶、29 kDa運動蛋白（movement protein， MP）和17.4 kDa外殼蛋白（coat protein， CP）^[16]。其中MP蛋白除在病毒致病過程中起作用外，主要參與病毒粒子在細胞間的移動^[17]。有研究表明同屬的煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）胞間運動是以MP與病毒核糖核蛋白形成復合體的形式運輸的^[18]，并且在長距離運輸中有多個寄主因子參與^[19]，至于CGMMV的MP是否有相似的功能尚不明確，因此本研究借助原核表達技術在體外表達高質量MP蛋白并制備特異性抗血清，以應用于該蛋白的功能研究。

原核表達系統已廣泛應用于植物病毒的蛋白表達中，運動蛋白的原核表達研究多聚焦于可溶性表達優化及高純度抗原制備，如馬秋萌等^[20]、劉玉姿等^[21]、胡汝檢等^[22]、尚衛娜等^[23]分別對玉米黃花葉病毒、甘蔗黃葉病毒、大麥黃矮病毒PAV青海分離物、番茄斑萎病毒的MP蛋白進行了原核表達，制備了高效價特異性抗血清，研究發現融合標簽的選擇及純化策略對蛋白活性和抗體特異性至關重要。針對CGMMV外殼蛋白的原核表達及抗血清制備已有相關報道^[24]，而CGMMV運動蛋白的原核表達尚無研究，因此本研究將CGMMV-MP基因與pET-32a載體結合，通過優化誘導條件顯著提高融合蛋白表達量；同時，采用鎳柱親和層析結合尿素復性技術，高效純化包涵體形式的重組蛋白，制備高效價且高特異性的多克隆抗體，為CGMMV的免疫檢測及后續功能研究提供關鍵技術支撐。

1 "材料與方法

1.1 "材料

CGMMV毒源采集于海南省萬寧市長豐鎮一生產田中具有典型CGMMV侵染癥狀的西瓜病葉，經分子檢測和致病性回接為CGMMV陽性，將該分離物命名為CGMMV-HaiN12，病葉干燥保存于?70"℃冰箱中備用。新西蘭大白兔由江蘇省農業科學院獸醫研究所提供。

總RNA提取試劑盒及M-MLV反轉錄酶購自美國Fermentas公司；大腸桿菌表達系統包含Trans10感受態細胞及BL21（DE3）蛋白表達菌株，均購自北京全氏金生物技術有限公司；克隆載體pET-32a（+）由本實驗室保存；pMD-19T載體及配套酶體系（T4 DNA Ligase、限制性內切酶等）購自日本TaKaRa公司；表達載體pET-32a（+）由本實驗室保存；pMD-19T載體、T4 DNA連接酶、DNA限制性內切酶等購自TaKaRa公司；堿性磷酸酶標記的抗兔IgG二抗、弗氏完全及不完全佐劑均購自Sigma公司；硝酸纖維素膜（PVDF，0.45"μm孔徑）購自Pall公司；His-tag親和層析介質Ni-NTA Agarose購自QIGEN公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 "方法

1.2.1" CGMMV-MP基因的克隆及序列分析 "根據CGMMV-HaiN12（GenBank登錄號為KC852074）的全基因序列設計MP基因引物，上游引物：5￠?CGggatccATGTCTCTAAGTAAGGTGTCAG?3￠（下劃線處為BamHⅠ酶切位點）；下游引物：5￠?GCgtcgacCTAGGTGTGATCGGATTGT?3￠（下劃線處為SalⅠ酶切位點），由Invitrogen公司合成。采用總RNA提取試劑盒提取葉片總RNA，利用反轉錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）合成cDNA，具體方法步驟按說明書進行。

以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系如下：LA Taq（5"U/μL）0.5 μL，10×LA PCR BufferⅡ（Mg²⁺ Free）5 μL，MgCl₂（25 mmol/L）5 μL，高純dNTPs（均為2.5 mmol/L）8 μL，cDNA模板1"μL，上下游引物（20"μmol/L）各1"μL，0.1% DEPC水29.5 μL。PCR反應參考王峰等^[10]關于CGMMV 3條片段擴增程序進行。PCR產物經試劑盒回收和純化后連接至pMD-19T載體，藍白斑篩選陽性克隆后送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。測定序列提交NCBI網站，應用BLASTn進行序列同源性比對，并基于比對結果構建系統發育樹并計算同源性指數。

1.2.2" CGMMV-MP基因原核表達載體的構建" 對pMD-19T-MP克隆載體及pET-32a（+）表達載體分別進行BamH I與Sal I核酸限制性酶雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收MP基因片段和表達載體，經T4 DNA連接酶16"℃連接過夜后將其轉化大腸桿菌Trans"10，然后在含有氨芐青霉素的平板上挑取重組克隆，PCR分析插入基因的完整性，酶切驗證重組質粒構型的正確性，并對陽性克隆進行DNA測序分析比對序列一致性，驗證成功的重組表達載體命名為pET-32a-MP，-80"℃超低溫凍存備用。

1.2.3 "CGMMV-MP基因的誘導表達 "將驗證正確的重組表達載體pET-32a-MP及空載體pET- 32a（+）分別導入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，通過抗生素抗性篩選獲得陽性克隆。選取單個菌落接種于3 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養基中，在37"℃恒溫搖床中以180 r/min轉速培養過夜，再按1∶100體積比稀釋至新鮮LB培養基中，繼續培養至菌液OD₆₀₀值達到0.8～1.0，添加IPTG（終濃度0.5 mmol/L），將培養體系轉移至28"℃恒溫搖床中繼續振蕩培養3"h。同時設置未添加IPTG誘導的pET-32a-MP為陰性對照，用于驗證基礎水平表達。于4"℃下12"000"r/min離心15 min，棄上清液，用預冷的0.01"mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 8.0）重懸菌體至原始體積的1/10。超聲破碎處理（400"W，超聲2 s，間隔5 s，循環60次），期間保持樣本溫度不超過4"℃。再以12"000"r/min高速離心10"min，分離得到上清液（可溶性蛋白組分）和沉淀（包涵體）。分別向上清液和沉淀中加入2×SDS蛋白上樣緩沖液，充分混勻后煮沸5"min變性。通過SDS-PAGE分析目標蛋白在可溶性和包涵體中的表達情況。

1.2.4" 表達蛋白的可溶性分析及純化" 含有重組質粒pET-32a-MP的BL21（DE3）菌株接種于含氨芐青霉素（終濃度100"μg/mL）的培養基中。在37"℃、180"r/min條件下震蕩培養，待菌液OD₆₀₀值達到0.8～1.0區間時，加入IPTG（終濃度0.5"mmol/L）誘導表達4"h，于4"℃下12"000"r/min離心15 min收集菌體細胞。再采用超聲波破碎儀（功率50"W，脈沖3 s×5 s，冰浴環境）進行細胞裂解處理，裂解完成后進行差速離心分別收集上清液（可溶性蛋白）和沉淀（包涵體），分別取上清液和沉淀溶解液進行SDS-PAGE分析。上清液加至預先平衡的Ni²⁺-NTA親和層析柱，4"℃條件下振蕩吸附1"h，依次用20"mmol/L咪唑和100"mmol/L咪唑洗脫^[25]，采用SDS-PAGE分析蛋白洗脫情況。洗脫液在4"℃ PBS緩沖液（pH 8.0）中透析24 h以去除殘留小分子雜質。透析產物通過冷凍干燥濃縮至適當濃度，經SDS-PAGE電泳分析純度。

1.2.5" 表達蛋白的抗血清制備及效價測定 "通過Bradford法蛋白濃度定量試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）測定純化蛋白的濃度；參考季英華等^[26]的方法皮下和肌肉混合多點注射雄性大耳白兔，共免疫6次，每周免疫1次，每次免疫蛋白量為0.5"mg。選取健康成年兔耳緣靜脈采集2"mL基礎血清，經4"℃靜置12 h后，離心獲取陰性對照血清，?20"℃凍存備用。初級免疫階段（前3次）采用多點皮下及肌肉聯合注射：首次免疫將純化蛋白與等體積的氟氏完全佐劑充分乳化后注射，第2、3次將蛋白與等體積的氟氏不完全佐劑充分乳化后注射；強化免疫階段（后3次）采用靜脈注射：連續3周靜脈注射無佐劑抗原。末次免疫14 d后心臟采血。血樣4"℃放置過夜，于8000 r/min離心10 min所得上清即為抗血清。參考商海麗等^[27]的方法采用間接ELISA法測定抗體效價，以免疫前健康兔血清作為陰性對照，用0.01"mol/L PBST連續倍比稀釋（100×2¹～ 100×2¹⁵）多克隆抗體和陰性血清，每個梯度設置3個重復，通過酶標儀檢測抗血清效價。

1.2.6" 多克隆抗體的特異性分析" 參考熊如意等^[28]的Western blot印記法檢測多抗的特異性，分別準備感染CGMMV、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）、西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus， WMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）的葉片和健康葉片，參考馬秋萌等^[20]的方法提取植物總蛋白，加人100"μL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）蛋白上樣緩沖液，在100"℃的水浴鍋中加熱10"min，于12 000 r/min離心10 min，取上清液進行SDS-PAGE電泳檢測。然后轉印至PVDF膜上，以多克隆抗體Anti-MP為一抗，堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG為二抗，用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒進行顯色，顯現清晰條帶后加去離子水終止反應并拍照。

2" 結果與分析

2.1" CGMMV-MP基因的克隆

提取CGMMV-HaiN12的RNA，經反轉錄試劑盒合成cDNA，以此為模板，用設計的MP基因引物PCR擴增后，在800"bp左右獲得了與預期大小相近的片段，其電泳檢測結果見圖1A。將回收純化的MP基因連接到pMD19-T Vector上，轉化Trans10化學感受態細胞，經藍白斑篩選，提取質粒，并用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，在800"bp附近切出一條條帶（圖1B），與MP基因大小相近。

2.2" CGMMV-MP基因原核表達載體的構建

將重組原核表達質粒pET-32a-MP進行電泳檢測，質粒大小和預期大小相符（圖2）。將質粒用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，在800"bp左右切出目的條帶（圖2），說明MP基因已克隆到原核表達載體pET-32a上。

將雙酶切鑒定正確的重組原核表達質粒送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序，測序結果經BioEdit v 7.0.9比對拼接，顯示所測定核酸序列與CGMMV-HaiN12的MP基因核苷酸序列一致性達100%，所克隆的MP基因閱讀框架均正確（圖3），說明構建的pET-32a-MP原核表達質粒正確。

2.3" CGMMV-MP融合蛋白的誘導表達

將重組原核表達質粒pET-32a-MP轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，挑取單菌落于LB液體培養基中培養，并用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導表達后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，與未誘導和空載體2個對照相比，在約48 kDa附近出現特異性條帶（圖4），但是表達量較低。按CGMMV的MP基因的閱讀框架，MP蛋白分子量大小約為29"kDa，加上融合蛋白表達的1個Trx Tag、1個His Tag和1個S Tag的約19 kDa的標簽，共約48 kDa，這與預期融合蛋白分子量相當，表明MP基因已經在大腸桿菌BL21（DE3）中成功融合表達。經過原核表達條件的優化，當OD₆₀₀為1.5，IPTG濃度為1.0"mmol/L時，MP融合蛋白的表達量最高（圖5）。

2.4" CGMMV-MP融合蛋白的純化

MP融合蛋白基本上以包涵體的形式存在（圖6A）。MP融合蛋白聚集成的包涵體經超聲破碎、反復洗滌，與可溶性蛋白和膜結合蛋白等細菌蛋白分離后，溶于8.0 mol/L尿素，再經鎳柱親和層析，在250 mmol/L洗脫緩沖液中洗脫2次后，MP融合蛋白純度達到80%以上（圖6B），可直接用作抗原。應用北京百泰克生物技術有限公司的Bradford法蛋白定量試劑盒測定提純的MP融合蛋白的濃度，MP融合蛋白濃度為0.5 mg/mL。

2.5" 抗血清anti-MP的效價測定

固定抗原濃度，抗血清Anti-MP從100倍開始稀釋，二倍比稀釋，采用間接ELISA法檢測Anti-MP效價，每個抗體稀釋倍數重復3次，同時倍比稀釋免疫前的兔血清作為陰性對照（CK）。根據ELISA測定評價標準，在抗血清Anti-MP稀釋倍數為409 600時，OD₄₀₅Anti-MP/OD₄₀₅CK= 2.35，鑒定為陽性；而當稀釋倍數為819 200時，OD₄₀₅Anti-MP/OD₄₀₅CK=1.81，鑒定為陰性（圖7），因此抗血清Anti-MP的效價為409 600，表明用純化的CGMMV-MP融合蛋白制備的抗血清具有很高的效價。

2.6" Western blot分析

用Anti-MP對MP原核表達產物進行Western blot分析（圖8），Anti-MP能與pET-32a空載體誘導菌體蛋白在19 kDa附近發生特異性反應，與pET-32a-MP誘導菌體總蛋白在48 kDa附近處發生特異性反應，能與純化的MP融合蛋白也發生反應。說明Anti-MP可以特異性地和MP融合蛋白及表達的標簽相結合。

再通過Anti-MP對CGMMV侵染寄主葉片的總蛋白進行Western blot檢測（圖9），結果發現該抗體在預期大小位置發生抗體反應，檢測到MP蛋白。而與健康對照葉片、TMV、WMV和CMV侵染葉片無交叉反應，說明Anti-MP只能結合CGMMV的MP蛋白，具有較好的特異性。

3 "討論

黃瓜綠斑駁花葉病毒作為一種可種傳的外來入侵有害生物，近年來已在我國多個省份的葫蘆科作物種植區引發嚴重疫情，造成了巨大的經濟損失。鑒于該病毒可通過宿主種子進行有效傳播的特性及其對產業構成的實質性威脅，我國于2007年正式將其列為國家農業植物檢疫對象。根據當年農業部頒布的第862號公告要求，相關部門已建立起針對帶毒葫蘆科作物種子、種苗的強制性檢疫管控體系，明確禁止或嚴格管控相關農業繁殖材料的跨區域調運與流通，以遏制病原體的擴散蔓延^[29]。近些年，CGMMV仍在我國蔓延危害，根據筆者近年來在江蘇省對CGMMV的調查發現，全省病害發生面積最高達35.8"hm²，主要危害西瓜，由種子調運傳入，病害突發連片發生，病害的發生強度上設施作物大于露地作物，究其原因可能與設施農業農事操作頻繁，病毒易于傳播侵染，一旦定殖難根治等相關。

本研究利用RT-PCR方法擴增和克隆了CGMMV-HaiN12的MP基因，成功構建了原核表達質粒pET-32a-MP，并在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達了CGMMV-HaiN12的MP蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析表明，所得MP融合蛋白主要呈現包涵體形態特征。這是因為采用高溫誘導策略（通常為42"℃）時，菌體增殖速率顯著提升（約提高3～5倍），導致mRNA翻譯效率呈指數級增長。這種快速的蛋白合成過程使得細胞內的折疊輔助機制處于超負荷狀態，進而造成新生肽鏈的錯誤折疊與聚集從而形成包涵體^[30]。此外，IPTG的濃度直接影響大腸桿菌生長速率和蛋白表達效率^[31]。本研究通過系統優化確定1.0"mmol/L IPTG、OD₆₀₀為1.5時蛋白表達量最多，所得融合蛋白表達量顯著高于張正坤等^[32]采用0.4 mmol/L IPTG誘導TMV-MP表達蛋白的表達量。然后通過復性獲得了可溶性蛋白，不僅恢復了外源蛋白的完整高級空間結構，而且通過去除宿主菌自身蛋白而實現了純化^[33]。

進一步以純化的MP融合蛋白為抗原免疫家兔，制備了MP蛋白高效價的抗血清Anti-MP，效價為1∶409 600，這一效價顯著高于已報道的GGMMV-CP抗血清（效價為1∶1024）^[24]、TMV-MP多克隆抗體（效價為1∶51 200）^[33]和玉米黃花葉病毒MP抗血清（效價為1∶102 400）^[20]。Western blot分析顯示其與TMV、WMV等近緣病毒無交叉反應，能特異性識別CGMMV侵染葉片中的MP蛋白，驗證了該原核表達蛋白的體外活性，這一高特異性可能源于純化過程中對宿主雜蛋白的嚴格去除（純度≥80%）及抗原表位的完整保留，為開發高靈敏度的CGMMV免疫檢測試劑盒奠定基礎。

目前的研究表明CMV的2b蛋白^[34]和PVX的MP蛋白^[35]為基因沉默抑制子；TMV的MP蛋白不僅可誘導基因沉默，主要在病毒粒子胞間移動和長距離運輸中發揮重要作用^[36-37]。CGMMV的MP蛋白無論在氨基酸序列保守性和功能域特征均與TMV的MP蛋白、CMV的2b蛋白具有相似性，但其是否具有類似轉錄后基因沉默抑制功能仍需進一步驗證。鄭海剛等^[38]證明了CGMMV的MP蛋白具備干擾宿主轉錄后基因沉默的潛能。本研究成功實現CGMMV-MP的原核高效表達及抗體制備，為解析MP蛋白的細胞間運輸機制及開發基于抗體的快速檢測技術提供了重要工具。未來可進一步利用該抗體探索MP在病毒侵染早期的動態分布，或通過免疫共沉淀篩選其互作宿主因子。

參考文獻

[1]"""""" FRANCKI R I， HU J， PALUKAITIS P. Taxonomy of cucurbit infecting tobamoviruses as determined by serological and molecular hybridization analyses[J]. Intervirology， 1986， 26（3）： 156-163.

[2]"""""" 陳紅運， 林石明， 陳青， 趙文軍， 廖富榮， 陳洪俊， 朱水芳. 黃瓜綠斑駁花葉病毒遼寧分離物全基因組序列測定[J]. 病毒學報， 2009， 25（1）： 68-72.CHEN H Y， LIN S M， CHEN Q， ZHAO W J， LIAO F R， CHEN H J， ZHU S F. Complete genomic sequence of a watermelon isolate of Cucumber green mottle mosaic virus in Liaoning province[J]. Chinese Journal of Virology， 2009， 25（1）： 68-72. （in Chinese）

[3]"""""" 吳元華， 李立梅， 趙秀香， 王文航， 王林， 蔡明. 黃瓜綠斑駁花葉病毒在我國定殖和擴散的風險性分析[J]. 植物保護， 2010， 36（1）： 33-36.WU Y H， LI L M， ZHAO X X， WANG W H， WANG L， CAI M. Pest risk analysis of invasion and spreading of Cucumber green mottle mosaic virus in China[J]. Plant Protection， 2010， 36（1）： 33-36. （in Chinese）

1. DOMBROVSKY A， TRAN-NGUYEN L T T， JONES R A C. Cucumber green mottle mosaic virus： rapidly increasing global distribution， etiology， epidemiology， and management[J]. Annual Review of Phytopathology， 2017， 55： 231-256.
2. 陳紅運， 趙文軍， 程毅， 李明福， 朱水芳. 遼中地區西瓜花葉病病原的分子鑒定[J]. 植物病理學報， 2006， 36（4）： 306-309.CHEN H Y， ZHAO W J， CHENG Y， LI M F， ZHU S F. Molecular identification of the virus causing watermelon mosaic disease in Mid-Liaoning[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2006， 36（4）： 306-309. （in Chinese）
3. 秦碧霞， 蔡健和， 劉志明， 陳永惠， 朱桂寧， 黃福新. 侵染觀賞南瓜的黃瓜綠斑駁花葉病毒的初步鑒定[J]. 植物檢疫， 2005， 19（4）： 198-200.QIN B X， CAI J H， LIU Z M， CHEN Y H， ZHU G N， HUANG F X. Preliminary identification of a Cucumber green mottle mosaic virus infecting pumpkin[J]. Plant Quarantine， 2005， 19（4）： 198-200. （in Chinese）
4. 張衛東， 權永兵， 廖力， 徐淼鋒， 遲遠麗， 陳其文. 黃瓜綠斑駁花葉病毒廣東分離物的分子鑒定[J]. 廣東農業科學， 2011， 38（20）： 73-76.ZHANG W D， QUAN Y B， LIAO L， XU M F， CHI Y L， CH--EN Q W. Molecular identification of three isolates of Cuc-u-mber green mottle mosaic virus in Guangdong[J]. Guangd-ong Agricultural Sciences， 2011， 38（20）： 73-76. （in Chinese）
5. 趙慧茹， 林振亞， 朱俊子， 張亞東， 高必達. 湖南首次檢測到黃瓜綠斑駁花葉病毒[J]. 植物病理學報， 2013， 43（2）： 219-221.ZHAO H R， LIN Z Y， ZHU J Z， ZHANG Y D， GAO B D. First report of Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） in Hunan province[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2013， 43（2）： 219-221. （in Chinese）
6. 吳鑫， 丁元明， 何月秋， 李旻， 李克海， 王紹君， 周劍. 黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子檢測及云南分離物的序列分" 析[J]. 揚州大學學報（農業與生命科學版）， 2010， 31（3）： 75-80.WU X， DING Y M， HE Y Q， LI M， LI K H， WANG S J， ZHOU J. Molecular detection of Cucumber green mottle mosaic virus and sequence analyses of Yunnan isolates[J]. Journal of Yangzhou University （Agricultural and Life Science Edition）， 2010， 31（3）： 75-80. （in Chinese）

[10]""" 王峰， 任春梅， 季英華， 繆倩， 姚戀秋， 周益軍， 徐冬青， 程兆榜. 黃瓜綠斑駁花葉病毒海南分離物基因組測定與毒源分析[J]. 植物保護， 2014， 40（6）： 75-81.WANG F， REN C M， JI Y H， MIAO Q， YAO L Q， ZHOU Y J， XU D Q， CHENG Z B. Genomic sequencing and infection source analysis of Cucumber green mottle mosaic virus isolated from Hainan， China[J]. Plant Protection， 2014， 40（6）： 75-81. （in Chinese）

[11]""" 田永蕾， 劉冬梅， 張永江， 李明福， 馬占鴻. 黃瓜綠斑駁花葉病毒北京和山東分離物的生物學測定及其基因組比較[J]. 植物檢疫， 2009， 23（6）： 1-6.TIAN Y L， LIU D M， ZHANG Y J， LI M F， MA Z H. Bioassay and genomic studies on the two isolates of Cucumber green mottle mosaic virus from Beijing and Shandong[J]. Plant Quarantine， 2009， 23（6）： 1-6. （in Chinese）

[12]""" LIU Y， WANG Y N， WANG X F， ZHOU G H. Molecular characterization and distribution of Cucumber green mottle mosaic virus in China[J]. Journal of Phytopathology， 2009， 157（7/8）： 393-399.

[13]""" 程兆榜， 任春梅， 繆倩， 王鋒， 張重陽， 周益軍， 范永堅. 江蘇黃瓜綠斑駁花葉病毒的發生和防治[J]. 江蘇農業科學， 2013， 41（2）： 114-117.CHENG Z B， REN C M， MIAO Q， WANG F， ZHANG C Y， ZHOU Y J， FAN Y J. The occurrence and control of Cucumber green mottled mosaic virus in Jiangsu province[J]. Jiangsu Agricultural Sciences， 2013， 41（2）： 114-117. （in Chinese）

[14]""" 程兆榜， 任春梅， 繆倩， 王鋒， 張重陽， 周益軍. 江蘇黃瓜綠斑駁花葉病毒的鑒定[J]. 江蘇農業學報， 2013， 29（1）： 65-70.CHENG Z B， REN C M， MIAO Q， WANG F， ZHANG C Y， ZHOU Y J. Identification of Cucumber green mottle mosaic virus in Jiangsu[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences， 2013， 29（1）： 65-70. （in Chinese）

[15]""" HOLLINGS M， KOMURO Y， TOCHIHARA H. Cucumber green mottle mosaic virus. CMI/AAB descriptions of plant viruses[C]. Guildford： Commonwealth Mycological Institute， 1975.

[16]""" KIM S M， LEE J M， YIM K O， OH M H， PARK J W， KIM K H. Nucleotide sequences of two Korean isolates of Cucumber green mottle mosaic virus[J]. Molecular Cells， 2003， 16（3）： 407-412.

[17]""" KIM S M， NAM S H， LEE J M， YIM K O， KIM K H. Destruction of Cucumber green mottle mosaic virus by heat treatment and rapid detection of virus inactivation by RT-PCR[J]. Molecules and Cells， 2003， 16（3）： 338-342.

[18]""" HEINLEIN M， PADGETT H S. Changing patterns of localization of the Tobacco mosaic virus movement protein and replicase to the endoplasmic reticulum and microtubules during infection[J]. Plant Cell， 1998， 10（7）： 1107-1120.

[19]""" KOTLIZKY G， KATZ A， VANDER L J， BOYKO J， LAPIDOT M. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild type movement protein to microtubules[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2001， 14（7）： 895-904.

[20]""" 馬秋萌， 劉玉姿， 王穎， 韓成貴， 李洪蕊， 吳迪. 玉米黃花葉病毒運動蛋白的原核表達純化與抗血清制備[J]. 植物保護學報， 2023， 50（2）： 343-349.MA Q M， LIU Y Z， WANG Y， HAN C G， LI H R， WU D. Prokaryotic expression and purification of Maize yellow mosaic virus movement protein and antiserum preparation[J]. Journal of Plant Protection， 2023， 50（2）： 343-349. （in Chinese）

[21]""" 劉玉姿， 張紹康， 田暢， 張曉艷， 左登攀， 王穎， 張宗英， 韓成貴. 甘蔗黃葉病毒運動蛋白的原核表達和抗血清制備[J]. 植物病理學報， 2020， 50（6）： 694-701.LIU Y Z， ZHANG S K， TIAN C， ZHANG X Y， ZUO D P， WANG Y， ZHANG Z Y， HAN C G. Prokaryotic expression and antiserum preparation of the movement protein of Sugarcane yellow leaf virus[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2020， 50（6）： 694-701. （in Chinese）

[22]""" 胡汝檢， 趙添羽， 左登攀， 王穎， 張宗英， 韓成貴. 大麥黃矮病毒PAV青海分離物運動蛋白抗血清制備及其與同屬BYDVs的血清學關系[J]. 植物病理學報， 2020， 50（2）： 141-146.HU R J， ZHAO T Y， ZUO D P， WANG Y， ZHANG Z Y， HAN C G. Antiserum preparation of the movement protein of Barley yellow dwarf virus PAV Qinghai isolate and its serological relationship with other BYDVs[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2020， 50（2）： 141-146. （in Chinese）

[23]""" 尚衛娜， 鄭寬瑜， 董家紅， 張仲凱， 洪健， 周雪平. 番茄斑萎病毒運動蛋白NSm的原核表達及抗體制備[J]. 植物病理學報， 2015， 45（6）： 592-597.SHANG W N， ZHENG K Y， DONG J H， ZHANG Z K， HONG J， ZHOU X P. Expression and antiserum preparation of the NSm of Tomato spotted wilt virus[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2015， 45（6）： 592-597. （in Chinese）

[24]""" 劉錦， 李亦晴， 黃顯德， 房樂， 李向東， 田延平. 黃瓜綠斑駁花葉病毒外殼蛋白基因原核表達及抗血清制備[J]. 山東農業科學， 2017， 49（5）： 10-13.LIU J， LI Y Q， HUANG X D， FANG L， LI X D， TIAN Y P. Prokaryotic expression and antiserum preparation of Cucumber green mottle mosaic virus coat protein gene[J]. Shandong Agricultural Sciences， 2017， 49（5）： 10-13. （in Chinese）

[25]""" 郝英辰， 龍月， 郭豪， 李寧， 張松杰， 趙棋， 張松濤. 煙草NtGCN2的原核表達、純化及多克隆抗體制備[J]. 農業生物技術學報， 2019， 27（1）： 170-179.HAO Y C， LONG Y， GUO H， LI N， ZHANG S J， ZHAO Q， ZHANG S T. Prokaryotic expression， purification and polyclonal antibody preparation of tobacco （Nicotiana tabacum） NtGCN2[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2019， 27（1）： 170-179. （in Chinese）

[26]""" 季英華， 周曉偉， 蔡振東， 程兆榜， 周益軍. 番茄黃化曲葉病毒V2基因原核表達及多克隆抗體制備[J]. 植物病理學報， 2013， 43（2）： 143-148.JI Y H， ZHOU X W， CAI Z D， CHENG Z B， ZHOU Y J. Prokaryotic expression of V2 gene of Tomato yellow leaf curl virus and preparation of its polyclonal antibody[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2013， 43（2）： 143-148. （in Chinese）

[27]""" 尚海麗， 周雪平， 吳建祥. 免疫斑點法和免疫捕獲RT-PCR檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒[J]. 浙江大學學報（農業與生命科學版）， 2010， 36（5）： 485-490.SHANG H L， ZHOU X P， WU J X. Polyclonal antibody-based dot-ELISA and immunocapture-RT-PCR for Cucumber green mottle mosaic virus detection[J]. Journal of Zhejiang University （Agricutral amp; Life Science）， 2010， 36（5）： 485-490. （in Chinese）

[28]""" 熊如意， 吳建祥， 周益軍， 周雪平. 水稻條紋病毒NS2基因原核表達產物多克隆抗體制備及受侵染水稻和灰飛虱體內NS2檢測[J]. 植物病理學報， 2009， 39（1）： 95-99.XIONG R Y， WU J X， ZHOU Y J， ZHOU X P. Polyclonal antibody preparation against prokaryotic expression products of Rice stripe virus NS2 gene and detection of NS2 in infected rice and planthoppers[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2009， 39（1）： 95-99. （in Chinese）

[29]""" YIN X Y， LI X， YANG L L， ZHENG Q Y， PIAO Y Z， CAO J J. Detection of Cucumber green mottle mosaic virus in low-concentration virus-infected seeds by improved one-step pre-amplification RT-qPCR[J]. Plant Methods， 2022， 18（1）： 70.

[30]""" VENTURA S. Sequence determinants of protein aggregation： tools to increase protein solubility[J]. Microbial Cell Factories， 2005， 4（1）： 1-8.

[31]""" 陳德鑫， 李雯雯， 李思斌， 李寧， 郭豪， 龍月， 楊永霞， 賈紅昉， 張洪映， 崔紅， 張松濤. 煙草NteIF2α的原核表達、純化及多克隆抗體制備和應用[J]. 農業生物技術學報， 2017， 25（1）： 50-57.CHEN D X， LI W W， LI S B， LI N， GUO H， LONG Y， YANG Y X， JIA H F， ZHANG H Y， CUI H， ZHANG S T. Prokaryotic expression， purification of NtelF2a and preparation and application of polyclonal antibody in Nicotiana tabacum[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2017， 25（1）： 50-57. （in Chinese）

[32]""" 張正坤， 吳祖建， 沈建國， 謝聯輝， 林奇英. 煙草花葉病毒運動蛋白的表達及特異性抗體制備[J]. 福建農林大學學報（自然科學版）， 2008， 37（3）： 265-268.ZHANG Z K， WU Z J， SHEN J G， XIE L H， LIN Q Y. Expression and antibody preparation of Tobacco mosaic virus movement protein[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （Natural Science Edition）， 2008， 37（3）： 265-268. （in Chinese）

[33]""" 陳浩， 陳于紅， 朱德煦， 劉建寧. 重組蛋白質純化技術[J]. 中國生物工程雜志， 2002， 22（5）： 87-92.CHEN H， CHEN Y H， ZHU D X， LIU J N. Recombinant protein purification technology[J]. China Bioengineering， 2022， 22（5）： 87-92. （in Chinese）

[34]""" BRIGNETI G， VOINNET O， LI W X， JI L H， DING S W， BAULCOMBE D C. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana[J]. The EMBO Journal， 1998， 17（22）： 6739-6746.

[35]""" VOINNET O， LEDERER C， BAULCOMBE D C. A viral movement protein preventes spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana[J]. Cell， 2000， 103： 157- 167.

[36]""" BENITEZ-ALFONSO Y， FAULKNER C， RITZEN-TH-AL-ER C， MAULE A J. Plasmodesmata： gateways to localand systemic virus infection[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2010， 23： 1403-1412.

[37]""" BENDAHMANE M， SZECSI J， CHEN L， BERG R H， BEACHY R N. Characterization of mutant Tobacco mosaic virus coat protein that interferes with virus cell-to-cell movement[J]. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of American， 2002， 99： 3645- 3650.

[38]""" 鄭海剛， 陳啟建. 誘導提取的dsRNA粗提液對黃瓜綠斑駁花葉病毒的抑制作用[J]. 福建農林大學學報（自然科學版）， 2011， 40（4）： 346-350.ZHENG H G， CHEN Q J. Inhibition of crude extracts of extracted dsRNA by induction on the Cucumber green mottle mosaic virus[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （Natural Science Edition）， 2011， 40（4）： 346-350. （in Chinese）