廣東和廣西火龍果潰瘍病菌新暗色柱節孢遺傳多樣性分析

摘" 要：廣東和廣西是我國火龍果主要產區，也是火龍果潰瘍病的常發區，明確這些地區火龍果潰瘍病菌新暗色柱節孢（Neoscytalidium dimidiatum）的遺傳多樣性對潰瘍病的防治具有重要意義。本研究以主要來源于廣西、廣東的4個火龍果潰瘍病菌地理群體為試驗對象，利用ISSR分子標記擴增以獲得其指紋圖譜，并進一步分析潰瘍病菌的遺傳分化情況。供試的火龍果潰瘍病菌經過8條ISSR引物擴增，得到203條條帶，多態性位點為31.7%，菌株間遺傳相似系數在0.7619～1.0000之間。在UPGMA聚類樹上遺傳相似系數為0.90時可分為3個類群，但遺傳類群與地理分布上并無緊密聯系。主成分分析結果顯示，4個地理群體重疊性較高，不存在相對獨立的地理種群。本研究證明我國火龍果潰瘍病菌遺傳多樣性水平較低，各地之間存在頻繁的菌源交流，該結果可為新暗色柱節孢的種群遺傳結構和火龍果潰瘍病病原菌監測的研究提供科學依據。

關鍵詞：火龍果潰瘍病；新暗色柱節孢；遺傳多樣性；ISSR中圖分類號：S432.1 """""文獻標志碼：A

Analysis of Genetic Diversity of Pitaya Canker Pathogen Neoscytalidium dimidiatum in Guangdong and Guangxi

LIN Shanyu， HUANG Jinling， LU Xiuhong， QIN Liping^*

Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests / Plant Protection Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Green Prevention and Control on Fruits and Vegetables in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Guangdong and Guangxi are the major production regions of pitaya and the common area for pitaya canker. Understanding the genetic diversity of Neoscytalidium dimidiatum is of great significance for the disease prevention and control. This research focused on four geographical population of N. dimidiatum mainly collected from Guangxi and Guangdong. To obtain the genetic fingerprints of N. dimidiatum， the isolates were amplified using ISSR genetic molecular markers and further analyzed the genetic diversity. The tested N. dimidiatum isolates were amplified with eight ISSR primers， resulting in 203 bands and the percentage of polymorphic sites was 31.7%， with the genetic similarity coefficient for any two germplasm resources ranged from 0.7619-1.0000. When the genetic similarity coefficient was 0.90 on the UPGMA cluster， all isolates could be divided into three groups， but the genetic groups were not closely related to the geographical distribution. The results of principal component analysis indicated considerable overlap between the four geographical groups and there were no relatively independent geographical poputation. This study proved that there existed lower level of genetic polymorphism in the isolates and there was frequent exchange of inoculum source between different places. The study would provide the scientific basis for researching the genetic architecture and pathogen surveillance of pitaya canker pathogen N. dimidiatum.

Keywords： pitaya canker; Neoscytalidium dimidiatum; genetic diversity; ISSR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.015

火龍果潰瘍病在全球范圍內對火龍果的品質和產量造成嚴重威脅^[1]。在高溫高濕的季節，火龍果潰瘍病易于流行，病原菌分生孢子穿透表層建立寄生關系后，最初形成褪綠斑，并伴隨黃色暈圈，隨著病程發展，病斑突出枝條表面形成硬痂，末期病變死亡組織脫落后，枝條上留下缺刻，在高濕條件下，損傷的細胞壁軟化和溶解，形成空洞和塌陷^[2]。火龍果潰瘍病主要為害我國臺灣、廣西、廣東、海南、貴州和云南的火龍果園，在美國、伊朗、馬來西亞、以色列、泰國、越南等國家也有不同程度的發生^[3-6]。據報道佛羅里達州一些火龍果園感病率超過70%^[5]，2012年廣東省清遠市火龍果潰瘍病的發病率高達60%^[7]，廣西防城港市高發病區火龍果潰瘍病的發病率在50%左右，造成產量下降10%～50%，商品價值受到嚴重損害^[8]。2012年臺灣首次報道葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）成員新暗色柱節孢（N. dimidiatum）引起火龍果莖潰瘍^[9]，通過不斷地形態學觀察、多基因聯合構建系統發育樹分析，現在已經明確葡萄座腔菌科的一些真菌引起火龍果潰瘍病的病原菌，其中新暗色柱節孢是最重要的一種^{[1， 10]}。

真菌遺傳信息的可變性使病原菌能夠忍受環境壓力，并通過多種生活方式在種群中形成不同的生存模式，作物病害暴發往往伴隨著病原菌的遺傳變異^[11]，因此研究新暗色柱節孢群體遺傳構成信息和遺傳變化，對作物的抗病育種、病害流行監測和防控具有重要意義。與物種鑒定類似，遺傳多樣性也可以通過形態學、生物化學和分子方法來確定。分子方法可以在不受環境因素干擾的情況下快速獲得結果^[12]。目前多個ISSR、SSR和SRAP標記已被開發并用于葡萄座腔菌中葡萄潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）等的遺傳多樣性分析，并證實了該種群具有較高的遺傳變異^[13-14]。中國火龍果栽培區地域寬廣、環境多樣、物種豐富，不同地理環境、多樣化栽培模式可能給我國火龍果潰瘍病菌群體的遺傳多樣性帶來影響。因此，本研究擬通過對主要來自廣東、廣西的火龍果潰瘍病病原菌新暗色柱節孢進行ISSR指紋圖譜分析，以明確其優勢種的遺傳結構，為深入研究火龍果潰瘍病及防治等提供理論基礎。

1" 材料與方法

1.1" 材料

于2018—2022年，從南寧、北海、欽州、貴港、梧州、玉林，廣州、茂名、湛江、陽江、江門、惠州、梅州、揭陽、深圳等地收集火龍果潰瘍病樣品，進行常規病菌組織分離，也采集了距離較遠的福建漳州、云南玉溪、貴州黔南的3個病樣作為參考。純化的菌株經過形態學和分子生物學鑒定后，獲得77株新暗色柱節孢，并根據采樣地點分布及地形地勢，分為4個地理群體（表1）：廣東和福建群體（G1），該區域海拔低，地勢平坦開闊，夏秋易受臺風干擾，潰瘍病發生較嚴重；廣西中、北部群體（G2），該區域多為丘陵，氣候濕潤；北部灣沿海群體（G3），該區域氣候特征與G1相似，部分地形為丘陵；廣西西部和云南、貴州群體（G4），該區域以丘陵和喀斯特地貌為主，冬天平均氣溫低于沿海，潰瘍病發病較輕。

1.2 "方法

1.2.1" DNA提取 "使用天根植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取DNA，步驟按說明書進行。提取的總DNA用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有污染；使用nanodrop測定OD₂₆₀、OD₂₈₀，并計算OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，檢測DNA的純度。并將DNA溶液稀釋至50 ng/μL用于后續試驗。

1.2.2 "ISSR-PCR引物篩選 "從ISSR引物庫中隨機選取44條引物并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用地理差距較大的4株新暗色柱節孢（LQ6、NT1、QN1和ZJ1）DNA作為擴增模版來篩選多態性好的引物，用無菌ddH₂O作陰性對照。選擇擴增條帶清晰、多態性好和具有重復性的引物用于后續新暗色柱節孢基因組ISSR-PCR擴增。

1.2.3 "ISSR擴增退火溫度的篩選" 以優選的ISSR引物理論退火溫度T_m值為中間值，按1"℃設置溫度梯度，共選取5個溫度對候選的ISSR引物退火溫度進行篩選，試驗重復2次。

1.2.4 "ISSR-PCR擴增 "采用上述優選的ISSR-PCR擴增的退火溫度，對新暗色柱節孢分離株DNA進行擴增。擴增體系為：94"℃預變性5"min；94"℃變性30 s，最佳退火溫度45 s，72"℃延伸1.5 min，共35個循環；最后72"℃延伸10"min，4"℃保存。

1.2.5 "指紋圖譜的數據處理與統計分析 "在對ISSR-PCR的譜帶的統計分析中，首先確定條帶的大小，然后根據相應位置條帶的有無，分別記為1和0。8個引物擴增出的每一個條帶都作為一個遺傳位點進行統計，構建菌株和條帶的1和0二元矩陣，從而將圖像信息轉化為數據信息，并將其保存成Excel文件格式。然后，利用POPGENE version 1.32軟件計算參數，反映基因多少和狀況的遺傳參數為多態性條帶數（number of polymorphic loci， NP），多態性位點百分率（proportion of polymorphic loci， P），等位基因觀測數（observed number of alleles， Na），有效等位基因數（effective number of alleles， Ne）；反映基因多樣性信息的遺傳參數為Nei’s基因多樣性指數（gene diversity， H），Shannon信息指數（Shannons information index， I）。最后計算遺傳距離，并用NTsys-2.0軟件計算遺傳相似系數，用非加權算術平均聚類（Unweighted Pair-Group Mean Average， UPGMA）方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖，使用GenAlEx軟件進行主成分分析。

2 "結果與分析

2.1 "ISSR-PCR引物的篩選

選用來自廣西南寧（NT1，LQ6）、廣東湛江（ZJ1）和貴州黔南（QN1）的新暗色柱節孢，用44條ISSR引物進行PCR擴增。擴增結果表明，不同的引物對新暗色柱節孢擴增出的條帶數目存在差異，一些引物擴增產物的條帶數目較少，如引物VCA02、VCA27等；一些引物則無擴增條帶，如（GATA）₄，這些引物均不適合用于對新暗色柱節孢群體遺傳多樣性的分析。最終從供試的44條ISSR引物中篩選出（GTG）₅、M13、U02、VCA13、VCA21、VCA22、VCA25、YHY（GT）₇G 8條引物，其ISSR-PCR擴增產物的多態性良好，條帶清晰穩定，可用于對新暗色柱節孢的遺傳結構研究。

2.2 "ISSR-PCR擴增退火溫度的確定

引物退火溫度篩選結果表明，退火溫度一定程度上能夠影響ISSR-PCR擴增效果，退火溫度過低，有時會降低ISSR擴增的多態性，退火溫度過高則不利于形成清晰的條帶。部分引物的最佳退火溫度與T_m值存在偏離，重復2次后，篩選獲得條帶清晰穩定的溫度作為隨后各引物擴增的最佳退火溫度，選用引物退火溫度的篩選結果見表2。

2.3 "新暗色柱節孢遺傳分化分析

77株新暗色柱節孢株經過ISSR-PCR擴增，獲得不同引物的擴增圖譜，8個引物共擴增出43個位點，其中多態性位點數為13個，多態性位點百分率為31.7%，所獲得的遺傳多樣性信息見表3。結果表明新暗色柱節孢遺傳多樣性在各群體之間具有一定差異，但遺傳分化程度較低。

2.4 "新暗色柱節孢遺傳聚類分析

可視化熱圖（圖1）可以展現不同指標、不同樣本之間的相似性，顏色越偏紅，說明相似性越大，越偏藍說明相似性越低。經比較，大部分菌株之間的遺傳相似系數在0.95以上（圖1），說明新暗色柱節孢群體遺產變異較低。

從UPGAM聚類樹（圖2）可以看出，在遺傳相似系數為0.90水平上，77個菌株被聚類成3個類群，第Ⅰ類群包含廣西北海、南寧和梧州的3個菌株，第Ⅱ個類群僅有來自廣西玉林的1個菌株，其余73個菌株被聚在第Ⅲ個類群。聚類結果表明，77個火龍果潰瘍病菌之間具有較高的遺傳相似性，但是種內仍存在一定的遺傳變異；同一地理來源的菌株歸入不同的類群或者亞類群中，說明菌株的遺傳多樣性與其地理來源無明顯的相關性。但小范圍來說，菌株的聚集具有一定的特點，例如來自不同區域的27個菌株聚集在遺傳相似系數約為0.976的A分支上，廣東和福建沿海的G1群體菌株在B和C分支中占主導地位。來自云南玉溪、貴州黔南和福建漳州的3個菌株也未和廣東和廣西菌株分離。

2.5 "主成分分析

主成分分析可知，G2、G3和G4群體都在G1群體范圍內。雖然G2、G3和G4大部分區域互相重疊，但G2和G3重疊的部分更多，說明來

自廣西中、北部群體和北部灣沿海的菌株親緣關系更為密切。由圖3可知，所有菌株大致可分為4個類群，每個類群都包含了來自不同地理分組的菌株，表明不同地理來源之間菌系交流頻繁，遺傳關系相近。

3 "討論

本研究選取來自廣東、廣西和周邊的77株新暗色柱節孢按地理位置分成4個群組，進行種群的遺傳多樣性分析。葡萄座腔菌科真菌作為水果和林木上的重要病原菌，為揭示其遺傳關系，人們對它們的遺傳多樣性進行了一些探索，但目前尚無火龍果潰瘍病菌新暗色柱節孢遺傳多樣性研究的報道。基于ISSR的遺傳多樣性研究結果顯示新暗色柱節孢菌株間的遺傳相似系數范圍為0.7619～1.0000，Shannon’s信息指數（I）為0.088；基因多樣性指數（H）為0.051，表明各菌株之間遺傳距離比較近，相似性較高。通過UPGMA方法構建的火龍果潰瘍病菌遺傳關系的聚類分析結果顯示，來自同一地理區域的菌株分布在不同的聚類群中，遺傳系數高于0.91的分支Ⅲ包含不同地域的菌株，來自云南玉溪、貴州黔南和福建漳州的3個菌株也未和廣東和廣西菌株有顯著差異，說明火龍果潰瘍病菌的遺傳親緣關系與地理來源之間并無明顯的相關性。主成分分析說明來自廣西中、北部群體和北部灣沿海的菌株親緣關系更為密切，推測某些適應性強的主流菌株已經分布在規模化的火龍果種植區。總體上，來自內陸的菌株表現出更高的遺傳分化，例如廣西南寧的NT1、YLY1，廣西玉林的RY2、廣西梧州的CX3，貴州黔南的QN1，這幾個菌株位于遺傳系數低于0.94的分支上。較高的溫度利于火龍果潰瘍病的發生，可能緯度較高的菌株為了適應冬季較低的溫度，遺傳信息發生了改變，而病原菌的遺傳變異給病害防控提出了更高要求。

研究病原菌的遺傳多樣性有利于了解群體的起源和演變，如果病原菌是最近的一次引入，那么病原體群體將在遺傳上是同質的，表現出與源群體相似或相同的遺傳變異^[15]。相反，如果病原體群體是由不同來源重組（地方性源群體與引進群體重組）產生的，那么它將表現出較高的遺傳多樣性^[16]。例如CHETHANA等^[17]利用全基因組序列數據開發的新型微衛星標記探索了葡萄座腔菌（B. dothidea）的遺傳多樣性和群體結構，結果表明，從中國葡萄品種中分離出的B. dothidea，不同地域菌株具有相同的等位基因，并表現出高度的遺傳多樣性，表明中國葡萄藤上的B. dothidea群體起源復雜，包括本地寄主轉移、外來引進以及本地和引進分離株之間的重組。火龍果起源于熱帶中南美洲地區，后傳入越南、泰國等東南亞國家和中國臺灣^[18-19]。從1998年開始，我國陸續從越南引種火龍果，并隨著火龍果規模化種植，苗木調運十分頻繁^[20-21]。2012年我國臺灣首次發現火龍果莖潰瘍由新暗色柱節孢引起，隨后在很短的一段時間內，中國、伊朗、以色列、馬來西亞、美國和泰國等火龍果種植區均發現了新暗色柱節孢引起火龍果潰瘍病，從火龍果潰瘍病菌較高的遺傳相似性，可推測侵染我國火龍果的新暗色柱節孢種群可能是隨著苗木輸入和轉運傳播到各地。這一結果還預示著新暗色柱節孢可以通過氣流或昆蟲在2個地區之間傳播，因為這2種方式的傳播距離比雨水飛濺的孢子傳播距離更長。遷徙的病菌攜帶著菌源地的基因型，造成引入地病害的流行，該結果與王璠^[22]對湖北桃流膠病病原菌B. dothidea遺傳多樣性與地理來源無關的結論相似。

遺傳多樣性分析能夠獲得物種之間的遺傳變異、物種進化以及它們對不同環境條件和生活方式的特殊適應的線索^[23]。眾所周知，生殖模式與遺傳變異有關，經歷有性生殖的種群更有可能表現出更大的遺傳多樣性^[24]。葡萄座腔菌（B. dothidea）和小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）是非常重要的植物病原菌，種群表現出較高的遺傳多樣性，特別在本地寄主中表現出更高的遺傳分化，顯著的連鎖平衡表明菌株之間發生了基因重組或有性生殖^[25]。這能夠增加病原菌子代適應自然選擇的能力，在促進病害顯癥、地理和寄主擴張方面發揮重要作用。新暗色柱節孢雖然為攜帶MAT1-1的異宗交配型真菌^[26]，但尚未發現它的有性生殖，繁殖主要依賴于田間條件下的菌絲斷裂形成節孢子，遺傳物質交換不夠充分，遺傳分化較為保守，因此新暗色柱節孢寄主專化性較高，對木本植物的致病力有限，這符合GARCIA等^[27]對新暗色柱節孢致病性的描述和田間病害發生的實際情況。

本研究使用ISSR標記探討了我國火龍果主要產區潰瘍病菌新暗色柱節孢的遺傳多樣性。研究結果顯示，雖然新暗色柱節孢種群顯示出一定的遺傳分化，但多樣性指數相對較低，自然地域種群的遺傳親緣關系與其地理來源之間并無明顯的相關性，這為研究我國南方火龍果潰瘍病的傳播規律以及致病力差異提供理論依據。未來還需開展新暗色柱節孢致病機制研究，為病害的預防和治理提供科學指導。

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