斯里蘭卡木薯花葉病毒TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

摘" 要：由斯里蘭卡木薯花葉病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus，SLCMV）侵染引起的斯里蘭卡木薯花葉病是近年來(lái)我國(guó)木薯種植中新發(fā)的危險(xiǎn)性病害。現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)存在靈敏度低、效率不高等不足，限制了相關(guān)工作的開(kāi)展。本研究根據(jù)病毒基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，制備陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立SLCMV的TaqMan熒光定量檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)其應(yīng)用效果等進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法僅對(duì)SLCMV DNA樣品產(chǎn)生特異性熒光信號(hào)，對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出量為4.5×10¹ copies/μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，C_t值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系，曲線斜率為-3.1312，相關(guān)系數(shù)（R²）為0.9969，擴(kuò)增效率（E）為97.9%，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.1312x+34.599。利用該技術(shù)對(duì)廣西和福建的2個(gè)木薯種植園供試樣品進(jìn)行檢測(cè)，葉片陽(yáng)性檢出率分別達(dá)95.45%和78.57%，最低檢測(cè)拷貝數(shù)為1.45×10⁵copies/g，而田間煙粉虱攜毒率為86%，最低帶毒量為9.42×10⁴ copies/頭。該技術(shù)具有良好的靈敏度、特異性和重復(fù)性，可為該病的田間鑒定、早期診斷、無(wú)毒種莖評(píng)價(jià)等監(jiān)控工作提供有效的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：木薯；斯里蘭卡木薯花葉病毒；TaqMan熒光定量PCR中圖分類(lèi)號(hào)：S435.33 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Establishment and Application of TaqMan Fluorescence Quantitative PCR （TaqMan qPCR） Detection Method of Sri Lankan Cassava Mosaic Virus

HUANG Jingshan^1，2， WANG Guofen²， SHI Tao²， LI Chaoping²， CHEN Yipeng²， CAI Jimiao²， LI Boxun²， LIU Xianbao²， HUANG Guixiu^2，3*

1. College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163319， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haokou， Hainan 571101， China; 3. Sanya Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / State Key Laboratory of Tropical Crop Breeding， Sanya， Hainan 572024， China

Abstract： Sri Lankan cassava mosaic disease， caused by Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV）， is a recently emerging dangerous disease in China. Existing detection methods of SLCMV are constrained by low sensitivity and poor efficiency， impeding related research and applications. Primers and probes were designed according to the gene sequences of the SLCMV， and a positive plasmid standard was prepared. The TaqMan fluorescence quantitative detection technology for SLCMV was established， and its application effect was verified. The method only generated specific fluorescence signals for SLCMV DNA samples， and the minimum detectable amount of the positive plasmid standard was 4.5×101 copies/μL. The standard curve showed that there was a good linear relationship between the C_t value and the logarithm of the copy number. The slope of the curve was –3.1312， the correlation coefficient R2 was 0.9969， the amplification efficiency （E） was 97.9%， and the equation of the standard curve was y=–3.1312x+34.599. Using this technology to detect the tested samples from two cassava plantations in Guangxi and Fujian， the positive detection rate of leaves was 95.45% and 78.57%， respectively， and the minimum detectable copy number was 1.45×10⁵copies/g. The virus-carrying rate of Bemisia tabaci in the field was 86%， and the minimum virus-carrying amount was 9.42×10⁴ copies/B. tabaci. This technology has good sensitivity， specificity， and repeatability， and could provide effective technical support for the monitoring and control work such as field identification， early diagnosis， and evaluation of virus-free stem cuttings of the disease.

Keywords： cassava; Sri Lankan cassava mosaic virus; TaqMan qPCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.003

木薯（Manihot esculenta）屬于大戟科木薯屬，原產(chǎn)于南美洲亞馬孫平原南部邊緣，目前在熱帶和部分亞熱帶地區(qū)廣泛種植。木薯塊根肉質(zhì)，富含淀粉，被譽(yù)為“淀粉之王”“地下糧倉(cāng)”，與馬鈴薯、甘薯并稱為世界三大薯類(lèi)，也是全球第六大糧食作物。木薯在我國(guó)華南地區(qū)廣泛種植，鮮薯收獲后，除少量直接鮮食或飼用外，主要用作工業(yè)原料，可加工出多達(dá)3000種產(chǎn)品，覆蓋人民生活的各個(gè)領(lǐng)域^[1]。目前，廣西是國(guó)內(nèi)木薯最大的種植區(qū)域，海南、廣東等地區(qū)也是重要的種植區(qū)^[2]。

斯里蘭卡木薯花葉病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus，SLCMV）屬于雙生病毒科（Gemini-vieidae）菜豆金黃花葉病毒屬（Begomovirus），是已知11種木薯花葉雙生病毒（Cassava Mosaic geminiviruses， CMGs）中的一種。SLCMV侵染后，首先在發(fā)病葉片部分部位出現(xiàn)褪綠、黃化，隨后擴(kuò)大且出現(xiàn)類(lèi)似“花葉”的癥狀，典型癥狀為葉片黃化、皺縮畸形及斑駁等癥狀。SLCMV主要通過(guò)帶毒種莖進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播^[3]，田間條件下主要通過(guò)煙粉虱進(jìn)行短距離擴(kuò)散^[4]。該病毒引起的斯里蘭卡木薯花葉病毒病（Sri Lankan cassava mosaic disease，SLCMD）是亞洲地區(qū)重要的木薯病害，近年來(lái)在東南亞地區(qū)的木薯園內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重為害^[5]。2018年，本團(tuán)隊(duì)首次在海南儋州和澄邁發(fā)現(xiàn)該病害^[6]，隨后調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病在主要種植區(qū)均有零星發(fā)生，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)木薯種植業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的潛在威脅。

SLCMV的早期檢測(cè)對(duì)于病害的田間防控工作具有重要的指導(dǎo)意義。王國(guó)芬等^[7]初步建立了SLCMV的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)，周司珊^[8]進(jìn)一步開(kāi)展了巢式PCR檢測(cè)技術(shù)的研究和應(yīng)用工作。AYAKA等^[9]、ARUTSELVAN等^[10]先后開(kāi)展了SLCMV的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amp-liffcation，LAMP）檢測(cè)技術(shù)研究，并獲得靈敏度比常規(guī)方法高100倍的效果。SLCMD為我國(guó)木薯新發(fā)病害，常規(guī)PCR和巢式PCR檢測(cè)方法存在靈敏度低、效率不高等不足，而LAMP技術(shù)常獲得假陽(yáng)性結(jié)果^[10]，對(duì)于新發(fā)病害并不適用。因此，本研究基于SLCMV外殼蛋白AV1基因保守序列，設(shè)計(jì)引物和探針，開(kāi)展TaqMan熒光定量PCR（TaqMan qPCR）檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)工作，旨在為該病害的早期診斷和有效防控提供技術(shù)支持。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 樣品采集 "木薯葉片樣品由本團(tuán)隊(duì)于2024年分別在廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣和福建省大田縣發(fā)病木薯園內(nèi)，采集出現(xiàn)異常褪綠、花葉等癥狀的SLCMD疑似病葉，同時(shí)在附近無(wú)病薯園內(nèi)收集無(wú)病葉片。煙粉虱（Bemisia tabaci）樣品于2024年采集于廣西壯族自治區(qū)北海市鐵山港區(qū)發(fā)病薯園。木薯無(wú)病葉片基因組DNA、木薯普通花葉病毒（Cassava common mosaic virus， CsCMV）cDNA、木薯細(xì)菌性萎蔫病菌（cassava bacterial blight，CBB）基因組DNA、SLCMV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（載體為pMD 18-T vector，克隆有該病毒外殼蛋白AV1編碼序列，GenBank登錄號(hào)為WCR23751）等均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2" 主要試劑與儀器" Ex Taq酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、pMD 18-T Vector、質(zhì)粒提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（探針?lè)ǎ┰噭┖械确謩e購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司和天根生化科技（北京）有限公司；熒光探針、引物由深圳華大基因科技有限公司合成。所用主要儀器為qTower 3G實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購(gòu)自德國(guó)椰拿分析儀器有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" 樣品總DNA提取" 參考王國(guó)芬等^[7]和何海芳^[11]的方法，分別提取木薯葉片、單頭煙粉虱

總DNA，方法略有改進(jìn)，每0.1"g葉片及每頭煙粉虱的DNA樣品分別用50 μL和30 μL去離子水進(jìn)行溶解。

1.2.2" 引物與探針設(shè)計(jì)與合成 "參照周司珊^[8]的方法，合成引物對(duì)SL12/SL13和CP1F/CP1R（表1）進(jìn)行樣品的巢式PCR檢測(cè)。基于SLCMV外殼蛋白AV1基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物SLCMV-QF638/SLCMV-QR699和探針Probe-661（表1），用于TaqMan qPCR研究。

1.2.3" TaqMan qPCR引物驗(yàn)證" 隨機(jī)選取2份SLCMD陽(yáng)性樣品和2份無(wú)病木薯樣品DNA（陰性對(duì)照），以ddH₂O為空白對(duì)照，參照林兆威等^[12]的方法，用SLCMV-QF638/SLCMV-QR699引物對(duì)和探針Probe- 661進(jìn)行TaqMan qPCR。

1.2.4 "陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備及靈敏度、特異性與重復(fù)性驗(yàn)證 "參考林兆威等^[12]的方法進(jìn)行陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備。以感染斯里蘭卡木薯花葉病毒病（SLCMV）的木薯葉片DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以木薯無(wú)病葉片基因組DNA、木薯普通花葉病毒cDNA、木薯細(xì)菌性萎蔫病菌基因組DNA、無(wú)菌水等為陰性對(duì)照進(jìn)行特異性試驗(yàn)。以不同濃度梯度的的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行靈敏度和重復(fù)性驗(yàn)證。各處理重復(fù)3次。

1.2.5" 田間樣本檢測(cè) 選取分別來(lái)自廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣和福建省大田縣發(fā)病木薯園的疑似SLCMD樣品，以及來(lái)自北海市鐵山港區(qū)的煙粉虱樣品，分別進(jìn)行巢式PCR和TaqMan qPCR檢測(cè)，并計(jì)算其拷貝數(shù)區(qū)間。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 熒光定量PCR引物驗(yàn)證

隨機(jī)選取2份具有SLCMD典型癥狀陽(yáng)性樣品和2份無(wú)病陰性樣品的基因組為模板，以ddH₂O為空白對(duì)照，利用引物SLCMV-QF638/SLCMV- QR699和探針Probe-661進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增。陰性樣品和空白對(duì)照未產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，呈一條直線，而2份陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度均出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)，表現(xiàn)為“S”形擴(kuò)增曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的引物/探針組合能有效檢測(cè)到SLCMV，可進(jìn)行進(jìn)一步研究（圖1）。

2.2" 靈敏度試驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

SLCMV重組質(zhì)粒提取后，用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)其質(zhì)量濃度為38.5"ng/μL，A_260/280比值為1.79，換算成拷貝數(shù)為4.5×10¹⁰ copies/μL。以陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品4.5×10⁹～4.5×10⁰ copies/μL等10個(gè)濃度梯度為模板，無(wú)病木薯樣品為陰性對(duì)照，用本研究設(shè)計(jì)的引物對(duì)和探針進(jìn)行TaqMan qPCR。當(dāng)質(zhì)粒濃度在4.5×10¹ copies/μL以上時(shí)，該反應(yīng)體系均可檢出（圖2）。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明C_t值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，斜率為?3.1312，相關(guān)系數(shù)（R²）為0.9969，擴(kuò)增效率（E）為97.9%，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=?3.1312x+ 34.599（圖3）。

2.3" 特異性試驗(yàn)

以無(wú)菌水為空白對(duì)照（blank control，BC），

無(wú)病葉片（disease-free leaves，DFL）的基因組DNA、木薯普通花葉病毒cDNA和木薯細(xì)菌性萎蔫病菌基因組DNA等為陰性對(duì)照進(jìn)行SLCMV的TaqMan qPCR檢測(cè)。結(jié)果僅SLCMV出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，空白對(duì)照、木薯無(wú)病葉片的基因組DNA、木薯普通花葉病毒cDNA、木薯細(xì)菌性萎蔫病菌基因組DNA等樣品均未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4），表明該方法對(duì)SLCMV的檢測(cè)效果具有良好的特異性，無(wú)病木薯組織及2種常見(jiàn)病害均不會(huì)對(duì)本檢測(cè)方法產(chǎn)生非特異性干擾。

2.4" 重復(fù)性驗(yàn)證

分別制備濃度為4.5×10⁶、4.5×10⁷、4.5×10⁸、4.5×10⁹ copies/μL的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以其為模板進(jìn)行TaqMan qPCR的組內(nèi)、組間的重復(fù)性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，C_t值的變異系數(shù)為0.53%～0.84%。以相同的試驗(yàn)條件，對(duì)每個(gè)稀釋濃度分別進(jìn)行3次獨(dú)立的重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明C_t值的變異系數(shù)為0.67%～1.58%。組內(nèi)變異系數(shù)小于1%，而組間變異系數(shù)小于2%，表明建立的TaqMan qPCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好（表2）。

2.5" 田間樣本檢測(cè)

隨機(jī)選取分別來(lái)自廣西合浦和福建大田的病樣，利用本試驗(yàn)建立的TaqMan qPCR和巢式PCR技術(shù)分別進(jìn)行檢測(cè)。巢式PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，廣西合浦田間22份樣品中有7份為陽(yáng)性，而TaqMan qPCR檢測(cè)出21份陽(yáng)性。福建大田樣品用巢式PCR檢測(cè)出11份為陽(yáng)性，而TaqMan qPCR檢測(cè)出14份陽(yáng)性。相關(guān)結(jié)果表明，TaqMan qPCR檢出率顯著高于巢式PCR技術(shù)，這與該方法靈敏度更高一致。計(jì)算其最低和最高拷貝數(shù)，得出其陽(yáng)性的病毒拷貝數(shù)，合浦地區(qū)木薯樣品病毒拷貝數(shù)在1.43×10⁵～4.09×10¹¹ copies/g之間，而福建大田木薯樣品病毒拷貝數(shù)在6.70×10⁵～1.88× 10⁹ copies/g之間（表3）。

在廣西北海鐵山港區(qū)發(fā)病木薯園隨機(jī)選擇14株受害植株，各抓取1頭煙粉虱，提取基因組DNA后應(yīng)用TaqMan qPCR方法對(duì)營(yíng)盤(pán)鎮(zhèn)田間疑似SLCMV感染的木薯煙粉虱種群進(jìn)行單頭定量檢測(cè)。結(jié)果表明，12頭煙粉虱攜帶有SLCMV，比例為85.71%，其C_t值均低于23.65，而單頭煙粉虱攜帶病毒數(shù)量在9.42×10⁴～2.33×10⁹ copies/頭之間（表4）。

3" 討論

在植物病毒快速檢測(cè)方法研發(fā)中，靈敏度和特異性是主要考慮的因素。TaqMan qPCR具有很高的靈敏度，可檢測(cè)低至幾個(gè)拷貝的病毒核酸，尤其適用于早期感染或低濃度病原物的檢測(cè)。在甘薯雙生病毒^[13]、番茄褪綠病毒^[14]、香蕉線條病毒^[15]和柑橘褪綠矮縮病毒^[16]等的檢測(cè)中，TaqMan qPCR比常規(guī)PCR的靈敏度高100倍，同時(shí)對(duì)一些難于分離和核酸提取的微量病原物，如檳榔黃化植原體和檳榔隱癥病毒1型，具有明顯的優(yōu)勢(shì)^[12]。在特異性方面，TaqMan qPCR利用上下游引物和中間探針進(jìn)行雙重驗(yàn)證，使其特異性更強(qiáng)，有效避免非特異性擴(kuò)增，減少了假陽(yáng)性結(jié)果。探針?lè)ǖ膬?yōu)勢(shì)還在于能對(duì)樣品進(jìn)行定量和定性分析，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可精確計(jì)算病毒載量，為病害流行學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持。檢測(cè)過(guò)程完全封閉減少交叉污染，且后續(xù)無(wú)需處理，進(jìn)一步提高檢測(cè)工作的效率。

在我國(guó)，木薯主要病害的早期侵染癥狀具有較高的相似性。木薯普通花葉病由木薯普通花葉病毒（屬于RNA病毒）侵染引起，受害葉片同樣形成和SLCMD相似的“花葉狀”^[7]，僅能通過(guò)分子檢測(cè)才能確認(rèn)。細(xì)菌性萎蔫病是我國(guó)木薯種植中為害最嚴(yán)重的病害，發(fā)病葉片最初同樣出現(xiàn)相似的褪綠癥狀，只有癥狀充分形成后才能夠準(zhǔn)確識(shí)別。因此，病害的早期診斷，一直是監(jiān)控工作中的難題。傳統(tǒng)的田間識(shí)別方法依賴典型癥狀的識(shí)別，往往延誤防控時(shí)機(jī)。此外，田間條件下，常存在多種病原的復(fù)合侵染現(xiàn)象，進(jìn)一步增加了診斷難度。本研究建立的TaqMan qPCR技術(shù)針對(duì)木薯花葉病毒（SLCMV）的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件（如退火溫度、引物濃度等），可實(shí)現(xiàn)對(duì)木薯組織、煙粉虱等的SLCMV精準(zhǔn)檢測(cè)，且具有良好的特異性。另外，周司珊^[8]發(fā)現(xiàn)巢式PCR的靈敏度比常規(guī)PCR高100倍。與巢式PCR相比，本研究建立的TaqMan qPCR技術(shù)，靈敏度進(jìn)一步提高了10倍，從而有助于實(shí)現(xiàn)病害的早期精準(zhǔn)診斷，2種方法的田間檢測(cè)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。此外，本技術(shù)還實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒傳播媒介煙粉虱的攜毒檢測(cè)，從而能夠有效監(jiān)測(cè)田間帶毒介體數(shù)量，為該病害的早期預(yù)警和綜合防控提供技術(shù)支持。

4" 結(jié)論

SLCMD是國(guó)際木薯危險(xiǎn)性病害，本研究成功建立一種基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，用于檢測(cè)斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV）。該方法具有高靈敏度、強(qiáng)特異性和良好的重復(fù)性，能夠有效檢測(cè)SLCMV的早期感染。和常規(guī)PCR相比，該方法檢測(cè)效率提高1000倍，也比巢式PCR高10倍。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，C_t值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率為97.9%，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=–3.1312x+34.599。特異性研究表明該方法僅能針對(duì)SLCMV進(jìn)行有效擴(kuò)增，無(wú)病葉片、木薯普通花葉病等病原均不能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。田間應(yīng)用表明，該方法可有效提高病毒樣品的檢出率，能夠?yàn)樵摬〉奶镩g鑒定、早期診斷、無(wú)毒種莖評(píng)價(jià)等監(jiān)控工作提供有效的技術(shù)支持，有望在該病田間監(jiān)控工作中發(fā)揮重要作用。

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