檳榔黃化相關病毒的提純及抗血清制備

摘" 要：檳榔黃化相關病毒（Areca palm velarivirus 1， APV1）引起的檳榔黃化病嚴重危害檳榔種植業，為防控檳榔黃化病的快速蔓延，亟需開發APV1病毒的快速檢測技術。本研究以APV1侵染性克隆侵染的本氏煙草（Nicotiana benthamiana）作為分離提純APV1病毒粒子的材料，利用聚乙二醇沉淀法、超速離心沉淀法、不連續蔗糖密度梯度離心法、親和磁珠法等方法分離提純APV1；利用透射電鏡觀察、SDS-PAGE、Western blot等方法鑒定提純APV1病毒粒子的質量，將提純的APV1病毒粒子免疫BALB/c小鼠制備APV1多抗血清用于APV1病毒檢測。結果表明：使用5%聚乙二醇6000（PEG-6000）和0.6% NaCl（m/V）可以將APV1病毒粒子從煙草勻漿液中充分沉淀，重懸經55%蔗糖墊超速離心后，APV1病毒粒子分布于蔗糖層下部或沉淀于離心管底部；粗提純的APV1病毒粒子經30%、40%、50%、60%、70%不連續蔗糖密度梯度140 000×g離心2 h進行精提純，分級取樣檢測顯示APV1病毒粒子富集于60%、70%蔗糖層；親和磁珠可以富集APV1病毒粒子，但洗脫時少量抗體脫落影響病毒純度。提純的病毒粒子在透射電鏡下呈細長線形，長為650～2200 nm，直徑為10～13 nm；將提純的APV1病毒粒子免疫小鼠，獲得對APV1高度特異、效價為1∶25 600的抗血清。該研究結果為APV1的分離提純提供新的思路，為APV1病毒快速檢測提供重要的技術支撐。

關鍵詞：APV1；病毒提純；聚乙二醇；密度梯度離心；抗血清制備中圖分類號：S763.7 """""文獻標志碼：A

Purification and Preparation of Anti-serum Against Areca Palm Velarivirus 1 （APV1）

ZHANG Haiyue^1，2， LU Jie^1，2， GAO Baosen^1，2 ， WANG Hongxing^2*

1. School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737， China; 2. School of Breeding and Multiplication （Sanya Institute of Breeding and Multiplication）， Hainan University， Sanya， Hainan 572025， China

Abstract： Areca palm velarivirus 1 （APV1） is identified as a causative agent of yellow leaf disease （YLD）， which emerges as a prominent threat to betel palm plantation. Developing methods for rapid detection of APV1 is necessary for preventing and controlling YLD in betel palm cultivation. In this work， APV1 virions were extracted from APV1-infected Nicotiana benthamiana by using polyethylene glycol （PEG） precipitation， ultracentrifugation， sucrose density gradient centrifugation， and affinity magnetic beads. The purified APV1 virions were identified by transmission electron microscopy （TEM）， SDS-PAGE and Western blotting. The purified APV1 virions were used to immunize BALB/c mice to produce polyclonal antiserum for detection of APV1. APV1 virions were precipitated from N. benthamiana homogenates by applying 5% PEG6000 and 0.6% NaCl. After resuspension and ultracentrifugation with 55% sucrose cushion， APV1 virions were distributed in the lower part of the sucrose layer or precipitated at the bottom of the centrifuge tube. APV1 was purified by 30%， 40%， 50%， 60% and 70% discontinuous sucrose density gradient centrifugation at 140 000×g for 2 h， and the results showed that APV1 was enriched in 60% and 70% sucrose layers. Affinity magnetic beads could efficiently purify APV1 virions. The purified virions were elongated， about 650–2200 nm in length and 10–13 nm in diameter. BALB/c mice were immunized with the extracted APV1 virions to obtain antiserum with high specificity for APV1 and titer of 1∶25 600. The results would provide a new idea for the separation and purification of APV1， and an important technical support for rapid detection of APV1.

Keywords： Areca palm velarivirus 1 （APV1）; virus purification; polyethylene glycol （PEG）; density gradient centrifugation; antiserum preparation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.012

檳榔（Areca catechu L.）屬于棕櫚科常綠喬木，是我國四大南藥之一^[1]。檳榔在海南種植面積達20萬hm²，檳榔產業年產值達1 000億元，成為海南200萬農村人口主要的經濟來源^[2-3]。檳榔黃化病（yellow leaf disease， YLD）是嚴重威脅檳榔種植業的一種傳染性病害，染病植株大多數表現為葉片黃化型癥狀，癥狀最初從最下部葉片的小葉尖端和中冠開始；黃化（泛黃）向維管組織方向擴展，而中脈保持綠色，形成黃綠色邊界^[4]；隨后葉片黃化癥狀逐年加重，檳榔樹冠幅變小，抽生的花穗短小，果實常提前脫落，少量存留的果實也品質變差，并在5～7年內枯頂死亡^[5]。檳榔黃化病在海南迅速蔓延，造成檳榔園減產甚至失收，成為限制檳榔產業持續健康發展的重要因素之一^[6-7]。2015年在海南檳榔黃化病樣品中鑒定出一種新病毒，該病毒被命名Areca palm velarivirus 1（APV1，直譯為檳榔隱癥病毒1）^[8]，但未受到重視。WANG等^[9]發現APV1與YLD高度相關，APV1很可能是YLD的病原。進一步通過雙條拂粉蚧（Ferrisia virgata）和柑橘棘粉蚧（Pseudococcus cryptus）以非循環半持久型方式傳播到檳榔植株并引發YLD典型癥狀^[10-11]，證明APV1是侵染檳榔引發YLD的關鍵病原之一。由APV1引起的檳榔黃化病田間癥狀會隨季節變化而發生改變，夏季高溫，病毒積累量低，黃化癥狀得到緩解，而冬季氣溫低，病毒積累量高，黃化癥狀加重，并且感染病毒的檳榔幼苗癥狀不明顯^[12]。因此，在檳榔生長早期，根據田間癥狀特征難以準確識別APV1引起的YLD，建立快速準確的病毒檢測方法迫在眉睫。

免疫學檢測方法是一種重要的植物病毒病檢測技術，其中的酶聯免疫吸附法（ELISA）使用經標記的抗體，可以快速地通過顏色變化顯示結果^[13-14]。病毒的特異性抗體是免疫學檢測方法的基礎，將完整的病毒粒子或病毒蛋白注射到動物體內，可以誘發動物的免疫反應產生對應的病毒抗體。因此制備抗體需要先提純病毒粒子。

病毒提純過程一般分為提取緩沖液配制、植物材料勻漿、抽提液澄清、病毒粒子濃縮與分離等步驟。提純方法有沉淀法、凝膠過濾法、超速離心法、密度梯度離心法等^[15-17]。APV1屬于長線形病毒科（Closteroviridae）、隱癥病毒屬（Velarivirus），由于病毒粒子主要分布于寄主檳榔韌皮部，提純較為困難，目前尚無提純APV1病毒粒子制備抗體的報道。同一個科、屬的病毒通常提純方法相似，KLAASSEN等^[18]提純萵苣傳染性黃化病毒（Lettuce infectious yellows virus， LIYV）使用的超速離心的方法是長線形病毒科病毒最經典的提純方法，以此提純方法為基礎改良成功提純了多種同科其他病毒^[19-20]。關于柑橘衰退病毒（Citrus Tristeza Virus， CTV）的提純研究較多，已報道的有超速離心法、聚乙二醇沉淀法、凝膠柱層析法等提純方法^[21-23]。除上述方法外，又新興了親和磁珠法分離植物病毒的方法^[24]。

本研究以APV1侵染性克隆侵染的本氏煙草（Nicotiana benthamiana）為材料，在參考長線形科病毒提純方法的基礎上，比較聚乙二醇沉淀法和超速離心沉淀法粗提純APV1病毒粒子的提取效率和得率，進一步利用蔗糖密度梯度離心法或親和磁珠法精提純APV1病毒粒子，免疫BALB/c小鼠，制備APV1鼠多抗血清，該研究結果為APV1檢測及病毒防控提供技術支持。

1 "材料與方法

1.1 "材料

1.1.1 "植物材料" APV1侵染的本氏煙草（Nicotiana benthamiana），由本實驗室構建的APV1侵染性克隆侵染野生型本氏煙草獲得^[25]。

待測APV1檳榔樣品，在海南三亞崖州區隨機取樣。

1.1.2 "實驗儀器" 超速離心機（Thermo Scientific^TM Sorvall^TM WX90+），高速離心機（HITACHI CR22GⅢ）等。

1.2" 方法

1.2.1" APV1侵染的本氏煙草檢測 "使用天根生化科技（北京）有限公司生產的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（#DP441）提取本氏煙草總RNA，利用賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產的RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒（#K1622）進行反轉錄；使用生工生物工程（上海）股份有限公司生產的2×SanTaq PCR Mix預混液（#B532061）和檢測引物CP-new、YLDV4^[26]進行RT-PCR擴增。

1.2.2" 聚乙二醇沉淀法沉淀APV1" 經檢測確認被APV1侵染的本氏煙草，取其葉片和莖稈置于研缽中，加液氮研磨成粉末，按1∶5（m/V）比例加預冷至4"℃的提取緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl，0.5% Na₂SO₃，0.5% TrtionX-100，0.5% β-巰基乙醇，5%蔗糖，pH為7.4），攪拌1 h，于4"℃，13"400×g離心15"min，棄沉淀，上清液中加入5%聚乙二醇（PEG-6000）和0.6% NaCl（m/V），攪拌1 h至PEG-6000完全溶解，于4"℃，8000×g離心15"min棄上清液，沉淀按1∶10（m/V）用TE緩沖液（0.01 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH為7.4）重懸，重懸液置于透析袋中透析過夜；第2天于4"℃，25 000×g離心10 min，取上清液，沉淀再次用TE緩沖液重懸，于4"℃，25 000×g離心10 min，取上清液，合并2次上清液。

1.2.3" 超速離心沉淀法粗提純APV1" 在離心管底部依次注入1 mL 20%蔗糖、2 mL 55%蔗糖，加入1.2.2中得到的病毒提取液補齊至離心管的瓶頸處，于4"℃，90 000×g離心3 h，分別收集蔗糖層和沉淀，沉淀用TE緩沖液重懸后，于4"℃，10"000×g離心10 min去除沉淀，獲得的上清液即為病毒粗提取液。

1.2.4 "蔗糖密度梯度精提純APV1" 用TE緩沖液分別配制30%、40%、50%、60%、70%蔗糖溶液，制備不連續蔗糖密度梯度。加入1.2.3中得到的病毒粗提取液補齊至離心管瓶頸處，于4"℃，140"000×g離心2 h。從上至下依次收集密度梯度蔗糖層，經Western blot檢測確定APV1病毒粒子分布。

1.2.5 "親和磁珠精提純APV1" 制備APV1親和磁珠。將原核表達APV1外殼蛋白制備的兔多抗血清^[27]與Protein A/G磁珠（金瑞思公司）交聯，按說明書操作，將APV1親和磁珠，按100"μL磁珠加5 mL病毒粗提液的比例混合，于4"℃孵育過夜，用洗滌液（20 mol/L Na₂HPO₄， 0.15 mol/L NaCl， pH 7.0）洗滌3次，用洗脫液（0.1 mol/L glycine， pH 3.0）洗脫。

1.2.6" 不同方法提純病毒粒子SDS-PAGE和Western blot分析" 取適量樣品與5×SDS上樣緩沖液混合煮沸變性，點樣，電泳（150 V， 50 min）經10% SDS-PAGE膠（雅酶公司）分離不同蛋白，將分離膠浸泡于考馬斯亮藍染色液1 h，用脫色液脫色；通過電轉方法將SDS-PAGE膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2"h后轉移至5%脫脂奶粉稀釋的APV1-CP小鼠單克隆抗體^[28]（1∶5000），于4"℃孵育過夜，經PBST洗滌后，再將PVDF膜移至稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（1∶5000），常溫孵育2 h，PBST洗滌后，在PVDF膜上滴加賽默飛ECL顯影劑，用化學發光檢測儀器觀察結果。

1.2.7 "多抗血清制備" 用蔗糖密度梯度提純的APV1病毒粒子注射6～8周齡的BALB/C小鼠制備多抗血清^[29]。每只小鼠注射30 μL的APV1病毒粒子和30"μL弗氏完全佐劑的混合物，共免疫3次。每次間隔2周，最后1次注射1周后，從小鼠臉頰取少量血樣檢測抗血清效價，抗血清效價達到預期后利用眼球取血法取小鼠全血，于5 000 r/min離心10 min得到抗血清，保存于–80"℃，備用。

1.2.8" 利用ELISA檢測疑似YLD樣品" 待測檳榔樣品用適量PBST緩沖液充分研磨，取上清液用抗原包被液按1∶10稀釋，添加到酶標板上，每孔加樣100"μL，蓋上酶標板蓋于4"℃過夜；倒掉包被液，用PBST洗滌3次，每次5 min；加入封閉液，于37"℃孵育2 h；倒出封閉液，每孔加入200 μL洗滌緩沖液洗滌，每5 min 1次，共洗滌3次；APV1小鼠多抗用抗體稀釋液按1∶5 000稀釋，每孔加樣100 μL，于37"℃孵育2 h；倒出抗體稀釋液，每孔加入200 μL PBST洗滌，每5"min 1次，共洗滌3次；HRP標記的山羊抗小鼠抗體用抗體稀釋液按1∶5000稀釋，每孔加樣100"μL，于37"℃孵育2 h；倒出抗體稀釋液，每孔加入200 μL PBST洗滌，每5 min 1次，共洗滌3次；每孔加入顯色底物100"μL，避光室溫放置30 min。每孔加入50 μL 1 mon/L HCl終止反應，觀察顏色變化或利用酶標儀測量OD₄₅₀數值。

2" 結果與分析

2.1" 本氏煙草RT-PCR檢測

由于通過農桿菌注射接種APV1侵染性克隆侵染本氏煙草效率較低^[25]。本研究所用侵染APV1病毒本氏煙草由APV1侵染性克隆侵染陽性植株組培擴繁；鑒于組培具有一定脫毒概率，需要對組培得到的本氏煙草進行APV1檢測，隨機選擇17株組培獲得的本氏煙草用于檢測，選取APV1檢測陽性本氏煙草用于病毒粒子提純，檢測引物為CP-new和YLDV4，煙草PDS基因為內參，經RT-PCR檢測結果顯示組培本氏煙草帶毒率為76%（圖1）。

2.2" 聚乙二醇沉淀法和超速離心法粗提APV1病毒粒子

對聚乙二醇沉淀法提純中不同階段的樣品進行Western blot檢測，結果顯示經PEG-6000沉淀后的上清液中未檢測到APV1特異性條帶，沉淀重懸后的上清液中含有APV1。沉淀重懸后剩余的沉淀中也存在APV1，但含量少于重懸上清液中的APV1（圖2A）。說明PEG-6000可以將APV1從提取液中充分沉淀下來，APV1可以重新懸浮于緩沖液中。在沉淀和重懸的過程中，去除了大量本氏煙草的成分，實現了APV1的粗提純。透射電鏡顯示，聚乙二醇沉淀法粗提純的病毒粒子為細長線形，長為650～2200 nm，直徑為10～13 nm（圖2B）。

利用超速離心法粗提APV1后，提取液顏色變淡，在蔗糖層和提取液之間聚集了綠色物質，離心管底部存在少量沉淀。對未處理提取液，超速離心后的上清、蔗糖層、沉淀進行了Western blot檢測，結果顯示超速離心后APV1主要存在于離心管底部的沉淀中，蔗糖層中也存在部分APV1，上清液中也存在少量APV1。經超速離心后，病毒粒子大部分沉淀于離心管底部，而大部分的本氏煙草成分無法穿過蔗糖層而與病毒分離，沉淀下來的病毒粒子重懸后低速離心又除去了部分本氏煙草成分（圖2C）。透射電鏡下超速離心粗提取的病毒粒子為細長線形，長為650～ 2200 nm，直徑為10～13 nm（圖2D）。

粗提純產物與原核表達的CP（攜帶his標簽）標準品的WB灰度值分析估算聚乙二醇沉淀法粗提純病毒的濃度為1 ng/μL，超速離心沉淀法粗提純的病毒濃度為2 ng/μL（圖2E），超速離心沉淀法提純的病毒得率高于聚乙二醇沉淀法。

2.3 "蔗糖密度梯度與親和磁珠法精提純APV1效果分析

密度梯度離心后，用長針頭分層收集蔗糖層，從上至下共取6層，每層約1 mL。對收集的蔗糖層進行Western blot和SDS-PAGE檢測，結果表明蔗糖密度梯度離心后，在SDS-PAGE膠上分級6可見較清晰的與病毒外殼蛋白（CP）大小一致的條帶（圖3A），未見其他明顯條帶，說明所得病毒粒子純度較高。Western blot結果表明分級5和6存在最亮的CP特異性條帶（圖3B）。病毒主要集中在分級5和6，對應的離心管位置為60%和70%蔗糖層。

對親和磁珠提純APV1過程中的洗滌液和洗脫液進行Western blot檢測，結果顯示在第2次洗脫液中存在病毒（圖3C），說明親和磁珠可以吸附病毒粒子，且結合足夠緊密不會在洗滌過程中脫落，也較容易洗脫，在第2次洗脫時即可全部洗脫，但偶聯在磁珠上的抗體也有少量脫落（圖3A）。

蔗糖密度梯度法精提純的APV1病毒粒子，病毒粒子會分散到的不同梯度蔗糖層；而磁珠法精提純的APV1病毒粒子被集中到洗脫液中，但洗脫步驟中病毒粒子抗體可能會被洗脫液洗脫下來（圖3A）。結果顯示，磁珠法提純的病毒粒子濃度更高，但由于病毒粒子抗體被洗脫，混入提純的病毒粒子，易造成病毒粒子不純，純度不如蔗糖密度梯度離心法提純的病毒粒子，因此本研究利用蔗糖密度梯度法提純病毒粒子免疫小鼠。

2.4 "多抗血清效價和特異性

采用間接ELISA法測定制備的多抗血清效價，多抗血清從1∶200開始倍比稀釋，以健康檳榔樣品作為陰性對照，結果顯示當抗體稀釋到1∶25 600時仍能檢測出APV1病毒，表明制備的抗血清滿足要求（圖4A，圖4B）。提取感染APV1的檳榔葉片總蛋白，用制備的多抗血清作為第一抗體進行Western blot檢測，抗血清稀釋比例為1∶6400，以純化的原核表達APV1-CP制備的小鼠單克隆抗體^[25]作為對照，結果顯示，制備的多抗血清與原核表達APV1-CP制備的小鼠單克隆抗體存在一致的條帶，無明顯雜帶，表明該多抗血清特異性高（圖4C）。

2.5" APV1病毒抗血清田間準確性檢測

為了確認APV1病毒多抗血清用于血清學檢測的準確性，在海南三亞崖州區隨機取21份檳榔葉片，采用RT-PCR、APV1病毒鼠多抗血清間接ELISA和APV1病毒CP單克隆抗體Western blot檢測方法分別對APV1進行檢測（圖5）。結果表明，3種方法的檢測結果一致，說明APV1病毒鼠多抗血清用于血清學檢測具有較高的準確性。

3 "討論

檳榔黃化病的爆發和蔓延給檳榔產業帶來毀滅性危害，由此造成的海南農民返貧問題非常突出，其中APV1病毒引起檳榔黃化病危害最大^[6]，迫切需要快速有效的病毒檢測技術。目前APV1病毒檢測主要包括RT-PCR^[5]、TaqMan實時熒光定量PCR^[30]、ELISA^[27]等技術，然而PCR技術需要提取檳榔RNA，成本高，費時費力，不利于大規模田間檢測^[31-32]。血清學檢測具有速度快，能夠進行大批量樣品檢測的優點，因此建立檳榔APV1病毒血清學檢測方法顯得極為重要。目前，基于原核表達APV1病毒外殼蛋白（capsid protein，CP）制備多克隆抗體，通過ELISA檢測APV1病毒已有報道^[27]。原核表達通常僅表達病毒的CP，免疫后獲得的抗體多針對該特定蛋白的線性表位或其在原核環境中可能形成的局部結構表位。由于缺乏病毒顆粒的完整結構，抗體可能對病毒粒子中的其他蛋白或完整病毒顆粒的構象表位沒有反應^[27]。通過分離提純病毒粒子免疫動物獲得抗血清可避免出現上述問題，病毒粒子包含完整的衣殼蛋白及其正確組裝的三維結構，同時可能還包括病毒基因組及其他附屬因子。免疫后獲得的抗體不僅針對CP，還可能識別病毒粒子表面的構象表位及其他病毒相關成分，特異性更廣^[33]。

由于APV1為韌皮部限制病毒，在檳榔葉片細胞中的含量低，同時檳榔葉片具有蠟質層，粗纖維多，病毒粒子本身容易與葉片纖維糾纏斷裂，病毒純化難度較大^[22]。本研究利用農桿菌介導的APV1侵染性克隆侵染本氏煙草體系，得到被APV1病毒侵染的本氏煙草作為提純材料^[25]。采用聚乙二醇沉淀法、超速離心沉淀法、不連續蔗糖密度梯度離心、親和磁珠等方法分離提純APV1病毒粒子，聚乙二醇沉淀法粗提病毒的缺點是宿主成分與病毒一起沉淀，病毒因雜質覆蓋較難重懸而得率較低，但對設備要求低，一次可以處理大量材料；超速離心沉淀法的優點是蔗糖層阻隔了大部分宿主成分，病毒容易重懸所以得率高，缺點是超速離心機價格昂貴，轉子容量較小，一次只能處理少量材料；密度梯度離心對設備和操作要求均較高，但提純的病毒具有較高的純度；磁珠法操作簡單，無需離心設備，理論上可以獲得高純度病毒，但前提是已經存在對應的病毒抗體，本研究中使用原核表達的CP抗體制備親和磁珠，該磁珠可以有效富集APV1并集中洗脫，但由于抗體偶聯磁珠技術不成熟，在洗脫時部分抗體會脫落，影響病毒的純度。提純的病毒粒子在透射電鏡下均呈細長線形，長為650～2200 nm，直徑為10～13 nm，與文獻^{[5， 25]}報道一致；將提純的APV1病毒粒子免疫小鼠，獲得效價為1∶25"600的多抗血清。以此建立的APV1間接ELISA檢測方法，可用于APV1的快速檢測，該方法與RT-PCR、Western blot等檢測方法的結果基本一致。

目前許多農戶對檳榔種植的熱情很高，對栽培的檳榔種苗，未經檢測，無法證明栽培的檳榔種苗是否健康，給檳榔黃化病的爆發和蔓延帶來了隱患，導致健康種苗保障體系的建設不足，特別是缺乏便攜且田間快速準確的檳榔黃化病檢測產品。目前關于APV1病毒引起的檳榔黃化病，尚無有效的防治藥劑，早期精準的病原診斷對黃化病的早期治療和防控具有重要意義，基于病毒粒子制備的多抗血清的ELISA檢測方法可以推動檳榔APV1病毒田間大規模普查，具有經濟、便捷和高效的優勢，實現黃化病的早發現、早控制、低蔓延，維護檳榔產業健康發展。

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