火龍果hAT-MITE轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)性分子標記開發(fā)與品種鑒別

摘" 要：微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子（MITE）作為真核基因組中活躍的可移動元件，其插入多態(tài)性為種質(zhì)遺傳多樣性分析提供了新型分子標記。本研究基于火龍果品種莞華白全基因組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法系統(tǒng)鑒定hAT家族MITE轉(zhuǎn)座子，共篩選出2350個具有完整末端反向重復(fù)（TIR）和靶位點重復(fù)（TSD）特征的候選元件，平均每對染色體213個。基于序列特異性及多態(tài)性分析，從中選出110個（每對染色體10個）高差異位點設(shè)計引物，經(jīng)PCR擴增驗證后成功開發(fā)出41個穩(wěn)定多態(tài)性hAT-MITE標記。進一步利用41對引物對48份火龍果種質(zhì)進行全基因組掃描，通過瓊脂糖凝膠電泳共檢測到81個多態(tài)性位點（多態(tài)率為97.59%）；UPGMA聚類分析表明，48份材料存在著豐富的變異和遺傳多樣性（遺傳相似系數(shù)在0.57～0.91之間），在遺傳相似系數(shù)為0.63時，將品種資源劃分為4個遺傳結(jié)構(gòu)顯著差異的類群。基于引物-帶型組合法，精選4對核心引物（HU-MIT-02/06/26/75）構(gòu)建覆蓋全部種質(zhì)資源的數(shù)字化指紋圖譜，其品種鑒別準確率達100%。本研究首次建立火龍果hAT-MITE分子標記技術(shù)體系，所開發(fā)的標記庫及標準化鑒定流程為火龍果種質(zhì)資源精準分類、品種鑒定和品種權(quán)保護提供了高效工具，對火龍果種業(yè)知識產(chǎn)權(quán)保護具有重要應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：火龍果；hAT-MITE轉(zhuǎn)座子；指紋圖譜；品種鑒定；遺傳多樣性中圖分類號：S667.9 """""文獻標志碼：A

Development of hAT-MITE Transposon Insertion Polymorphism Molecular Markers and Cultivars Identification in Pitaya

HU Wenbin^1，3，4， WANG Hao^1，3，4， ZHOU Xincheng²， PU Wenhui^1，3，4， FENG Yanli^1，3，4， LI Hongli^1，3，4*，LI Qiong^1，3，4*

1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Innovation in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 4. Key Laboratory of Genetic Improvement and Innovation of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Miniature inverted-repeat transposable elements （MITEs）， as active mobile elements in eukaryotic genomes， provide novel molecular markers for germplasm genetic diversity analysis through the insertion polymorphisms. This study systematically identified hAT family MITE transposons in pitaya using bioinformatics approaches based on the whole-genome data of the Guanhua Bai cultivar. A total of 2350 candidate elements with complete terminal inverted repeats （TIRs） and target site duplications （TSDs） were screened， with an average of"213 elements per chromosome pair. Through sequence specificity and polymorphism analysis， 110 highly divergent loci （10 per chromosome pair） were selected for primer design， ultimately yielding 41 stable polymorphic hAT-MITE markers after PCR validation. Genome-wide scanning of 48 pitaya germplasms using the 41 primer pairs detected 81 polymorphic loci （polymorphism rate： 97.59%） via agarose gel electrophoresis. UPGMA cluster analysis revealed substantial genetic variation and diversity among the 48 accessions， with genetic similarity coefficients ranging from 0.57 to 0.91. At a genetic similarity threshold of 0.63，"the germplasm resources were categorized into four genetically distinct groups. A digital fingerprinting system covering all germplasm resources was constructed using four core primer pairs （HU-MIT-02/06/26/75） based on the primer-band pattern combination method， achieving 100% cultivar identification accuracy. This study established the first hAT-MITE molecular marker system for pitaya， providing an efficient toolkit including a marker library and standardized identification protocols for precise germplasm classification， cultivar identification and varieties property protection of pitaya. The advancements is of significant application value for intellectual property protection in the pitaya seed industry.

Keywords： pitaya; hAT-MITE transposon; fingerprint; variety identification; genetic diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.005

火龍果是新興的重要的熱帶果樹，在中國、越南、哥倫比亞、厄瓜多爾、澳大利亞等國家有大規(guī)模種植。目前中國是全球最大的火龍果生產(chǎn)國，種植面積約6.8萬hm²，主要分布在廣東、廣西、海南、貴州、云南、福建等省（區(qū)），在我國脫貧攻堅、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮重要作用。火龍果在長期的自然演化、突變和人工選育過程中形成了豐富的種質(zhì)資源，但種質(zhì)資源缺乏系統(tǒng)研究，存在遺傳基礎(chǔ)不清問題。火龍果現(xiàn)有主栽品種外形特征極為相似，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類手段難以有效鑒定，存在品種混淆問題。利用分子標記技術(shù)可為火龍果種質(zhì)資源準確鑒定提供依據(jù)，而轉(zhuǎn)座子標記是開展種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、品種鑒別的重要標記之一。

轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座是植物基因組進化的重要動力，是植物遺傳多樣性的重要來源，在植物基因組進化、基因表達調(diào)控、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性評價方面具有重要作用^[1]。基于轉(zhuǎn)座子的分子標記可以用于品種及物種鑒定、遺傳多樣性分析和功能標記。在植物中，數(shù)量較多的DNA類型轉(zhuǎn)座子包括hAT（hobo，Activator and Tam3）、CACTA以及Mutator超家族，基因組上常見的MITE（miniature inverted-repeat transposon element，微型倒置重復(fù)轉(zhuǎn)座元件）是屬于非自主型DNA類型的轉(zhuǎn)座子家族。一些MITE元件在基因組上可達幾千到上萬個拷貝^[2]。同一作物不同品種間在相同位點常有MITE插入與缺失形成的多態(tài)性，即有的品種在某位點有MITE轉(zhuǎn)座元件，有的品種則沒有^[3]。插入缺失標記（InDel）可以用于作物的指紋圖譜^[4]，MITE轉(zhuǎn)座元件是否插入基因組上某位點，本質(zhì)上也屬于InDel標記，因此其也可以作為指紋圖譜用于鑒別作物品種^[5-6]。另外，在物種演化方面，MITE的這種多態(tài)性也可以用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，常被用于屬內(nèi)不同物種親緣關(guān)系的研究^[7-9]。與單核苷酸多態(tài)性（SNP）、簡單序列重復(fù)（SSR）等分子標記一樣，MITE等轉(zhuǎn)座子在植物基因組中數(shù)量大、分布廣，但是相比于SNP、SSR等標記，MITE產(chǎn)生的插入缺失標記多態(tài)性明確、易識別、開發(fā)方便、試驗成本低且操作簡單（瓊脂糖電泳足以分辨），是種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、構(gòu)建品種指紋圖譜的良好標記之一。MITE標記在花生^[10-11]、油菜^[12]、水稻^[13]等農(nóng)作物品種鑒定、雜交種真?zhèn)舞b定上得到應(yīng)用，目前ISSR^[14-15]、SSR^[16-18]等標記在火龍果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建中已得到應(yīng)用。陶金等^[19]開發(fā)了基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP分子標記，用于火龍果遺傳多樣性分析，但尚未有基于MITE標記的分子身份證構(gòu)建相關(guān)報道。

前人研究表明，在火龍果等仙人掌科植物基因組中，DNA轉(zhuǎn)座子的占比均大幅高于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，且絕大多數(shù)DNA轉(zhuǎn)座子屬于TIR類型，在TIR類型的DNA轉(zhuǎn)座子中，hAT超家族在轉(zhuǎn)座子代表性數(shù)據(jù)集中占比最大^[20]。本研究從火龍果基因組中發(fā)掘出hAT-MITE轉(zhuǎn)座子序列，基于轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)性開發(fā)適于火龍果品種的分子標記，并以48份火龍果主要商業(yè)品種為材料，開展遺傳多樣性分析和分子身份證構(gòu)建研究，以期為火龍果種質(zhì)分類、品種鑒定和品種權(quán)保護提供重要的理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1" 材料與方法

1.1" 材料

供試的48份火龍果品種資源（表1）主要包括國內(nèi)主要審認定品種、地方品種和特色資源。

其中H5、H18、H31、H37、H40、H41、H45、H46作為核心引物篩選的材料。以上材料均保存于海南儋州中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所省級火龍果種質(zhì)資源圃。

1.2" 方法

1.2.1" 火龍果hAT類MITEs的鑒定 "從火龍果基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.pitayagenomic.com/）^[21]和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ PRJNA691451）數(shù)據(jù)庫中下載火龍果基因組序列和基因注釋信息，利用MITE-Hunter等軟件對火龍果基因組進行分析，主要是查找適合做分子標記的hAT家族MITE等DNA類型轉(zhuǎn)座元件，對其類型、分布、偏好性進行分析。利用primer 3軟件在位于基因間隔區(qū)、基因區(qū)和啟動子區(qū)轉(zhuǎn)座子外側(cè)設(shè)計引物。

1.2.2" DNA提取" 使用天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物基因組"DNA"提取試劑盒（DP360）提取48份火龍果品種資源嫩莖的總DNA，操作參照產(chǎn)品說明書進行。樣品統(tǒng)一稀釋至20 ng/μL后，–20"℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3" 核心引物篩選" 每條染色體分別選10個以上的多態(tài)性位點，在其兩端一定位置處分別設(shè)計PCR引物。如果因為序列不合適等原因無法設(shè)計引物，可選擇一端引物位于轉(zhuǎn)座子內(nèi)部，另一端在轉(zhuǎn)座子外。合成引物后，對8個代表性火龍果種質(zhì)進行擴增，明確引物擴增片段大小、PCR退火溫度等信息。每條染色體上至少獲得2個在群體內(nèi)呈現(xiàn)多態(tài)性的標記。

1.2.4" hAT-MITE程序及PCR產(chǎn)物檢測" 引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。MITE-PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，含2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL，F(xiàn)-primer（10 μmol/L）0.8 μL，R-primer（10 μmol/L）0.8 μL，模板DNA（20 ng/μL）3.0 μL，ddH₂O 5.4 μL。擴增程序為：94"℃預(yù)變性5 min；94"℃變性30 s，復(fù)性30 s（根據(jù)引物Tm值設(shè)計退火溫度），72"℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72"℃延伸10"min。4"℃保存。PCR擴增結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。

1.2.5" 數(shù)據(jù)處理與遺傳多樣性分析" 根據(jù)電泳結(jié)果，選擇條帶清晰、多態(tài)性高的進行統(tǒng)計，將同一位點的所有等位基因從小到大排列，有條帶記為“1”，空白記為“0”，統(tǒng)計所得的數(shù)據(jù)利用Excel軟件轉(zhuǎn)換成NTSYS 2.10所需要的格式，利用軟件NTSYSpc 2.10計算遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA），利用篩選出的hAT-MITE核心引物對48份火龍果種質(zhì)資源進行聚類分析。

1.2.6" 指紋圖譜構(gòu)建 "從上述結(jié)果中選擇鑒定力強的hAT-MITE引物構(gòu)建火龍果品種資源的指紋圖譜，以所分析的hAT-MITE引物名稱為前綴，該標記在某樣品上擴增帶的分子量為后綴，得到每個品種在某個標記的帶型編號，按照固定的引物排序結(jié)合不同引物分析結(jié)果，串聯(lián)各帶型編號，形成該品種的hAT-MITE指紋圖譜。根據(jù)指紋圖譜出現(xiàn)的概率公式P＝1/2ⁿ（n為多態(tài)位點數(shù)，2ⁿ則為檢測n個位點涉及的所有可能的試驗材料個數(shù)），統(tǒng)計圖譜的置信概率。

2" 結(jié)果與分析

2.1" hAT-MITEs的鑒定與特征分析

利用MITE-Hunter軟件對栽培種莞華白火龍果基因組進行分析，鑒定和篩選出hAT家族的MITE轉(zhuǎn)座子，同時統(tǒng)計hAT-MITE元件在基因區(qū)、基因間隔區(qū)和啟動子區(qū)的數(shù)量，并對其插入偏好性進行分析。根據(jù)火龍果基因組基因結(jié)構(gòu)注釋結(jié)果計算基因區(qū)的總長度（基因區(qū)包括內(nèi)含子區(qū)、外顯子區(qū)），啟動子區(qū)為基因區(qū)上游2000"bp，基因組上其他區(qū)域則為非基因區(qū)，統(tǒng)計分析結(jié)果見表2。栽培種莞華白的基因組存在2350個完整結(jié)構(gòu)的hAT-MITE轉(zhuǎn)座子，其中243個位于基因啟動子區(qū)，1882個位于基因間隔區(qū)，225個位于基因區(qū)，207個位于內(nèi)含子區(qū)，18個位于外顯子區(qū)和UTR區(qū)。基因區(qū)平均每兆堿基（平均拷貝數(shù)）有1.459個，略低于基因間隔區(qū)1.527個。而啟動子區(qū)每兆堿基含4.381個轉(zhuǎn)座元件，表明hAT- MITE轉(zhuǎn)座子更傾向于分布在基因啟動子區(qū)。

根據(jù)火龍果基因組序列信息和基因結(jié)構(gòu)注釋結(jié)果信息分析hAT-MITE元件在栽培種莞華白火龍果基因組各染色體上的數(shù)量，以及在每一條染色體基因區(qū)、基因間隔區(qū)和啟動子區(qū)的數(shù)量，結(jié)果見表3。hAT-MITE在染色體上分布最多的是1號染色體，為239個；最少的是10號染色體，有178個；平均每對染色體有213個。大部分轉(zhuǎn)座子分布在基因間區(qū)、啟動子區(qū)，而基因區(qū)主要存在于內(nèi)含子區(qū)，外顯子區(qū)很少。

2.2" hAT-MITE引物多態(tài)性的篩選

從每條染色體基因區(qū)、基因間隔區(qū)和啟動子區(qū)選取代表性位點，每條染色體選10個多態(tài)性位點，共110個，設(shè)計引物。用形態(tài)、遺傳背景差異較大的8份火龍果種質(zhì)資源對110對hAT-MITE引物進行引物初步篩選。利用這110對hAT-MITE引物在8份火龍果種質(zhì)資源中共檢測出193個條帶，平均每對引物擴增出1.7個，多態(tài)性條帶數(shù)為121個，多態(tài)位點百分率達62.69%，條帶大小在250～2000 bp之間。經(jīng)2輪篩選后，選出41對具有明顯多態(tài)性、條帶清晰、帶型穩(wěn)定引物（表4）。

2.3 "hAT-MITE標記多態(tài)性引物在不同火龍果品種資源間的遺傳多樣性分析

利用篩選出來的41對火龍果hAT-MITE標記核心引物，對48份樣品進行遺傳多樣性分析（部分檢測結(jié)果見圖1）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示41對hAT-MITE引物在48份火龍果種質(zhì)資源中共檢測出83個等位變異，多態(tài)性條帶數(shù)為81個，多態(tài)位點百分率達97.59%，等位基因數(shù)變化范圍為2～5。

根據(jù)41對核心引物擴增數(shù)據(jù)，利用NTSYS- pc 2.1軟件，依據(jù)遺傳相似系數(shù)采用UPGMA算法對48個火龍果品種資源進行聚類分析（圖2）。結(jié)果表明，48份材料遺傳相似系數(shù)在0.57～0.91之間，說明這些火龍果品種資源之間存在著豐富的變異和遺傳多樣性。在遺傳相似系數(shù)為0.63時，48份火龍果材料總體上被分為4個類群，其中第Ⅰ類只包含了H39（黃麒麟-G）；第Ⅱ類包括H37（紅皮燕窩）；第Ⅲ類H26（大花蛇鞭柱）、H48（S3）蛇鞭柱屬野生資源；第Ⅳ類為常見的火龍果主栽品種和地方品種，共計44份，包括桂紅龍1號、莞華粉紅、莞華紅、粵紅、粵紅3號、雙色1號、紅冠2號、紫龍等廣東、廣西、海南審認定品種，也包括大翼水晶、白水晶、紅水晶、紫蜜龍、紅花青龍、檸檬、黃錦、桂族雙色、紅寶龍等地方特色品種，還包括巴西粉肉、康尼梅椰、越南白肉、翠西亞、EL、秘魯燕窩、BNM等來自越南、澳大利亞、巴西等國的栽培品種。這些品種的遺傳相似系數(shù)基本在0.80以上，說明現(xiàn)有火龍果品種資源多樣性較好，但是現(xiàn)有栽培品種差異較小，遺傳背景較狹窄，其中H3（蜜寶）與H4（紫龍）之間的相似系數(shù)接近0.91，說明其親緣關(guān)系較近。

2.4" 指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)41對核心引物擴增結(jié)果可以將所有品種區(qū)分開，但從41對核心引物中選取最優(yōu)的4對引物組合（HU-MIT2、HU-MIT6、HU-MIT26、HU-MIT75）可以將48份品種資源完全區(qū)分。

HU-MIT2、HU-MIT6、HU-MIT26、HU-MIT75的多態(tài)性好，分別有3、5、3、5個等位變異，對應(yīng)的基因型有6、12、8、16個，有很高的鑒別能力，可以將48份材料鑒別出來，可以作為指紋圖譜構(gòu)建的優(yōu)選引物。將代表每個樣品等位基因位點按順序組成數(shù)字指紋，構(gòu)建了48份火龍果品種資源的指紋圖譜（表5）。這些引物的多態(tài)性位點有16個，根據(jù)概率公式1/2ⁿ可知，理論上在2¹⁶（65536）份品種中才有可能存在2個品種的電泳圖譜完全相同，置信概率幾乎為100%，該指紋圖譜可準確檢測其中任何品種。

3" 討論

前人研究表明，在火龍果等8個仙人掌科植物基因組TIR類型的轉(zhuǎn)座子中，hAT超家族在轉(zhuǎn)座子代表性數(shù)據(jù)集中占比最大，其比例為21.07%～ 31.86%^[20]。因此hAT類MITE是分析火龍果遺傳多樣性和構(gòu)建指紋圖譜最適合的轉(zhuǎn)座子標記。而本課題組前期開展火龍果栽培種David Bowie的基因組hAT類MITE轉(zhuǎn)座子分析發(fā)現(xiàn)，2191個完整結(jié)構(gòu)的hAT類MITE轉(zhuǎn)座子，其中1714個位于基因間隔區(qū)，231個位于基因啟動子區(qū)，基因區(qū)則為246個，平均每對染色體199個；而栽培種莞華白的基因組有2350個完整結(jié)構(gòu)的hAT類MITE轉(zhuǎn)座子，其中基因間隔區(qū)含有1882個，243個位于基因啟動子區(qū)，基因區(qū)共含225個，平均每對染色體213個，高于栽培種David Bowie火龍果基因組。本研究中選擇從莞華白火龍果的基因組上開發(fā)轉(zhuǎn)座子標記，每條染色體分別選10個多態(tài)性位點，從110個位點中篩選出41個核心多態(tài)性位點，平均每條染色體3.7個，每個染色體至少有3個，既有多態(tài)性，又有代表性。

本研究鑒定開發(fā)的41個hAT-MITE標記，對48份樣品進行遺傳多樣性分析結(jié)果中，共檢測出83個等位變異，多態(tài)性條帶數(shù)為81個，多態(tài)位點百分率達97.59%。等位基因數(shù)變化范圍為2～5，平均每個位點等位基因數(shù)2.2個，多態(tài)性較好。能有效揭示48份火龍果種質(zhì)資源的遺傳多樣性，也能很好地鑒別現(xiàn)有主要商業(yè)品種。聚類分析結(jié)果表明，除了其中第Ⅰ類只包含了H39（黃麒麟- G）；第Ⅱ類包括H37（紅皮燕窩）；第Ⅲ類H26（大花蛇鞭柱）、H48（S3）蛇鞭柱屬野生資源；其他的大部分材料遺傳相似系數(shù)基本在0.80以上，說明現(xiàn)有品種資源遺傳背景較狹窄，相似度較高，但也存在明顯的多樣性。本研究對hAT-MITE轉(zhuǎn)座子在國內(nèi)外火龍果品種資源中的多態(tài)性分布情況做出了初步的判斷，為后期的火龍果種質(zhì)資源收集、分類以及品種選育提供一定的理論參考依據(jù)。

目前品種鑒定主要使用SSR、SNP標記。前期本課題組利用SSR標記構(gòu)建了現(xiàn)有主要商業(yè)品種的分子身份證，對完成現(xiàn)有主要商業(yè)品種分類、品種鑒定和品種權(quán)保護提供了技術(shù)支撐^[16-17]。而利用SNP（單核苷酸序列多態(tài)性）標記進行品種鑒定在玉米^[22]、大豆^[23]等主要農(nóng)作物均得到廣泛利用。但是SSR標記法存在SSR位點差異小、檢測方法成本高、容易出現(xiàn)錯誤基因型等問題；SNP標記法存在單個SNP位點鑒定能力有限、SNP位點多、檢測成本高等。而MITE標記產(chǎn)生的插入缺失標記多態(tài)性明確、易識別、開發(fā)方便、試驗成本低且操作簡單利用，實驗條件簡單，能滿足大部分研究人員開展種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、構(gòu)建品種指紋圖譜研究。有研究表明，MITE轉(zhuǎn)座子分子標記揭示栽培種花生的DNA多態(tài)性要明顯高于SSR分子標記，展示了其潛在的應(yīng)用前景^[24]。另外，MITE較高的轉(zhuǎn)座活性和轉(zhuǎn)座傾向于插入基因或基因附近區(qū)域的特性，常分布在基因的啟動子區(qū)或內(nèi)含子區(qū)，對基因的表達起到調(diào)控作用^[1]，可以用于QTL和功能基因定位和功能標記開發(fā)。hAT超家族的MITE轉(zhuǎn)座子非常適合開發(fā)為新一代的分子標記。

本課題組將結(jié)合MITE與SSR、SNP、MNP標記法開展火龍果種質(zhì)資源鑒定與遺傳多樣性研究，建立品種鑒定技術(shù)規(guī)程，開發(fā)功能標記，更系統(tǒng)更準確地對火龍果種質(zhì)資源鑒定評價，提高火龍果育種的效率，為火龍果分類、育種、品種鑒定、品種權(quán)保護提供重要的技術(shù)支撐和理論依據(jù)，加快培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)異品種，推動我國火龍果產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

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