桃溪蜜柚果實發育期有機酸含量變化及檸檬酸代謝相關基因表達分析

中圖分類號：S666.301 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）12-0183-06

桃溪蜜柚是省吉安市井岡蜜柚主導品種之一，9月中下旬成熟，具有果肉脆嫩、果汁多、甜爽可口等優良特性[1-2]。除了可溶性糖之外，有機酸組分含量是影響果實口感以及果實質量的重要影響因子[3]。因此本試驗以在果實發育期（花后 60～ 150d）的桃溪蜜柚為對象，研究桃溪蜜柚在該時期的有機酸組分含量變化，以及檸檬酸含量與相關基因之間的聯系。

前人對于柑橘類有機酸代謝的研究報道有很多，不同柑橘品種的有機酸種類及比例存在明顯差異。Albertini等比較了高酸和低酸的7種柑橘品種發現，在果實發育前期50d，二者都是奎寧酸含量占比最高；在果實發育后期，高酸品種與低酸品種相比，前者以檸檬酸為主，后者以蘋果酸為主[4]。在碰柑和紐荷爾臍橙果實中，有機酸含量都是主要以檸檬酸為主，而碰柑中含量最少的為酒石酸，紐荷爾臍橙則是奎寧酸含量最少[5-6」。馬家柚的總有機酸含量中，檸檬酸占比最多，其次為蘋果酸[]。PEPC通過使PEP羧化形成OAA，以及通過氧化PEP形成的AcCoA經檸檬酸合酶（CS）的催化形成了檸檬酸，隨之轉運并貯藏于植物細胞液泡中，其中包括2種類型的V型質子泵（V-ATPase和V-PPase）[8-10]。而 VHA-c4 和 VHP 分別是液泡H⁺ -ATPase J⁺-PPase 中的基因，在檸檬酸轉運到液泡貯藏的過程中發揮著關鍵作用[\"]。同時也有試驗表明，在柑橘中，CHX和DIC轉運蛋白可能參與果實液泡中的檸檬酸向細胞質的轉運[12]。檸檬酸降解基因與檸檬酸的積累有著密切聯系，檸檬酸主要通過谷氨酰胺 ??γ- 氨基丁酸（GABA）和乙酰輔酶A這3個途徑進行降解代謝。在柑橘中，因品種的多樣，其差異明顯。易明亮等研究發現，溫州蜜柑在果實發育期中的檸檬酸合成基因PEPC、CS隨著時間的推移其表達量呈增長的趨勢，而降解基因 ACO3，GAD4，GS 與檸檬酸含量成反比，且檸檬酸經過GABA途徑進行降解[13]。楊歡研究發現，溫州蜜柑、早香柚、紐荷爾臍橙主要以檸檬酸積累為主，且檸檬酸含量的積累主要與 Mit-Aco.CsCit 的負調控和質子泵的正調控有關[14]。Lin等研究了以高酸含量為代表的高橙和以低酸含量為代表的溫州蜜柑，發現前者中CitCHX、CitDIC基因的表達量要顯著低于后者[12]。在克里曼丁柑橘中，降解基因ACL與檸檬酸含量的積累成反比[15]。高陽等研究表明，靖安柱柑在果實發育期檸檬酸含量與CitIDH表達量呈負相關，表明基因CitIDH在靖安碰柑檸檬酸含量形成過程中起到十分重要的作用[16]。

在前期的桃溪蜜柚相關研究中，果樹栽培及養分管理、果實貯藏品質分析等方面研究較多[17-18] ，但是在果實發育過程中桃溪蜜柚有機酸組分含量及分子調控的研究鮮有報道。因此，本試驗主要分析測定其有機酸含量變化以及檸檬酸代謝相關基因的表達量，了解其有機酸代謝的可能分子調控機制，為桃溪蜜柚果實的品質調控提供理論參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

桃溪蜜柚果實采摘時間為盛花（4月16日）后60～150d ，試驗時間為6—10月，采摘地點為吉安泰和果園。選擇樹冠外形基本一致的果樹，于盛花后60d（S1）開始采集第1批果實，此后每間隔15d采摘1次，直至 150d（S7） 果實成熟，摘取的果實表皮光滑無損傷且無病蟲害，直徑大小一致，將要進行試驗的果肉切碎后快速置于液氮中，便于后續試驗。

1.2 測定指標及方法

1.2.1有機酸的提取與含量測定參照Chen等的方法對果實進行有機酸提取，采用高效液相色譜法（HPLC）測定有機酸含量[19]

1.2.2RNA的提取與逆轉錄取桃溪蜜柚盛花后60～150d 的果肉，采用華越洋試劑盒進行RNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，TaKaRa公司反轉錄試劑盒進行反轉錄。

1.2.3熒光定量在Bio-RadCFX96-PCR儀上進行基因的表達量分析。所需的引物參照Lin等的設計[12.20]，并由擎科生物科技有限公司合成。依照Jiang等的設計[21]設置PCR反應體系。設置3個生物學重復，最后參照 方法計算基因的表達量。

1.3 數據統計與分析

使用Excel、DPS軟件分析數據，采用Origin2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1果實發育階段有機酸含量的動態分析

圖1是桃溪蜜柚果實發育期有機酸總量及組分含量測定結果。可以發現，檸檬酸含量占比最多，為總有機酸含量的 25.94%～70.95% ，蘋果酸、酒石酸、奎寧酸含量占比依次為 11.15%～28.63% 、3.56%～26.14% .6.89%～22.38% 。果實總有機酸含量在 S1～S2 時期呈現下降趨勢，在S5時期達到最高值后下降；檸檬酸為有機酸的主要成分，其含量在果實發育期 ΔS1_Δ～S7 呈上升趨勢，其中 S3～ S4變化顯著；而其他3種酸含量在果實發育階段中雖然存在波動，但整體變化不明顯。

圖1桃溪蜜柚果實發育階段有機酸含量的動態分析

2.2檸檬酸合成相關基因的表達分析

對檸檬酸含量緩慢增加期（S2～S3）、快速增加期（ S3～S4） 以及相對穩定期（ S4～S6 進行檸檬酸合成相關基因的表達分析。從圖2-a可以看出，在桃溪蜜柚果實的整個發育過程中，CmPEPC1基因的相對表達量在S2～S3時期呈上升趨勢，在 S3～S6 時期整體呈下降趨勢。由圖2-b、圖2-c可知，CmPEPC2和 CmCSI 基因相對表達量在果實發育時期整體呈逐漸增加趨勢，與檸檬酸含量的表達趨勢一致。從圖2-d看出， CmCS2 基因的相對表達量在 S2～S3 時期呈下降趨勢，在 S3～S4 時期呈顯著上升的趨勢， S4～S6 時期呈下降趨勢。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下圖同

圖2桃溪蜜柚果實發育階段檸檬酸合成相關基因的表達量

2.3檸檬酸轉運相關基因的表達分析

在桃溪蜜柚果實發育期， H⁺ 反向轉運蛋白基因 CmCHX 在 S3～S4 時期出現顯著下調表達，隨后在 S4～S6 時期顯著上調表達（圖3－a）。CmDIC基因的相對表達量在 S2～S4 時期顯著下降，而在S4～S6時期顯著上升（圖3-b）。CmVHA-c4 在S2～S3時期基因出現顯著下調表達，而S3～S6時期變化不顯著（圖3-c）。CmVHP2基因在S3和S4時期的相對表達量顯著高于其他時期（圖3-d）。

2.4檸檬酸降解相關基因的表達分析

CmACLI基因在 S2～S3 時期出現顯著下調表達，而 S3～S6 時期變化不顯著（圖4-a）。CmACL3基因的相對表達量先在S2～S4時期下降，然后在S4～S6 時期上升（圖4-b）。CmAco3基因的相對表達量在果實發育期間整體呈緩慢上升的趨勢（圖4-c）。CmNAD-IDH2、 CmNAD-IDH3 和CmGS2基因的相對表達量變化趨勢相似，在 S2～S4 時期無顯著差異， S4～S6 時期呈整體上升趨勢（圖4-d、圖4-e、圖4-f）。CmGAD5的相對表達量在果實發育期間波動較大， S2～S3 時期呈上升的趨勢，S3～S5 時期下降，S5～S6時期又呈現上升趨勢（圖4-g）。 CmGABA 的相對表達量在 S2～S3 時期下降， S3～S4 時期呈顯著上升趨勢， S4～S6 時期整體又呈下降的趨勢（圖4-h）。

3討論

在柚類果實中，有機酸組分含量也因品種不同差異較大。江東等采用GBS技術，將不同來源的286份柚子材料進行分類，其中國內的柚類材料大致分為文旦柚、沙田柚以及墊江柚等系列[22]。通過對文旦柚系列的琯溪蜜柚有機酸的研究，趙宇洪等發現，琯溪蜜柚及其4個芽變品種（紅肉蜜柚、三紅蜜柚、紅綿蜜柚和黃金蜜柚）中檸檬酸含量占比達到 90% 左右[23]。此外，馬有軍通過對紅肉蜜柚和三紅蜜柚的研究證實了以上結果[24]。陳青英等對沙田柚系列的玉環柚進行了研究，發現有機酸中檸檬酸含量占比最高[25]。本試驗結果與其他柚類結果一致，發現桃溪蜜柚中檸檬酸為主要的有機酸成分，其含量占總有機酸含量的 25.94%～70.95% 。但檸檬酸含量在果實發育期的變化趨勢因柚類的品種不同還存在一定的差異。露地栽培的玉環柚檸檬酸含量呈先升后降再上升的趨勢，檸檬酸主要積累時期為5月29日至8月27日[25]。紅肉蜜柚和三紅蜜柚檸檬酸含量均呈先升后降的趨勢，在花后 40d 檸檬酸含量積累最低。隨著果實的不斷發育，紅肉蜜柚檸檬酸含量在花后 140d 達到最高，三紅蜜柚則是在花后 150d 達到高峰[24]。本研究中，桃溪蜜柚在盛花后至果實成熟（S1～S7）期間，檸檬酸含量整體呈上升的趨勢，在花后 75d 時檸檬酸含量最低，為 1.726mg/g ，檸檬酸主要積累時期在花后 90～105d ，而花后 150d 時檸檬酸含量達到最高，為 6.179mg/g 。前人關于柑橘類檸檬酸代謝機制的研究有很多，主要涉及合成、降解和轉運。對于桃溪蜜柚而言，合成基因CmCS1、CmPEPC2皆參與了果實檸檬酸的表達。與奉節晚橙、臍橙、琯溪蜜柚結果[26-28]一致。而 Sadka等認為，CitCSs 和CitPEPCs的基因表達與檸檬酸含量并無聯系[29-30]。在轉運相關基因中，有試驗發現，高酸含量品種相對于低酸含量品種而言，CiutCHX和CitDIC基因的表達量呈顯著下降的趨勢，并通過異位表達證實CitCHX、CiutDIC與柑橘檸檬酸積累呈負相關[12]。Tan等發現，VHP 基因的下調減少了液泡對檸檬酸鹽的轉運能力[11，20]。馬家柚果實發育中轉運蛋白基因CmDIC表達量的降低，促進了檸檬酸的積累[7]。而在桃溪蜜柚中，同樣也發現CmCHX、CmDIC、CmVHP2基因在檸檬酸的積累中發揮著不可替代的作用。檸檬酸降解基因的表達量對檸檬酸的積累有著十分重要的作用。前人研究發現，在6個柑橘品種的成熟過程中ACL基因的表達情況不同，其中溫州蜜柑和紐荷爾臍橙果實中檸檬酸含量降低與檸檬酸降解基因ACL基因表達上升有關[31]Lin等認為，溫州蜜柑中檸檬酸的積累與CitAco基因有重要聯系[12]。還有研究表明，碰柑果實遭受水分脅迫后有機酸含量顯著上升，可能受檸檬酸降解基因CitGAD4、CitGAD5、CitAco3、CitIDH相對表達量的下調影響[32]。在溫州蜜柑中， 與檸檬酸的積累呈負相關，皆參與了檸檬酸含量的積累[14]。而本研究結果中顯示，在桃溪蜜柚果實發育期檸檬酸的積累中，降解基因CmACL3、CmAco3、CmNAD-IDH2、CmNAD-IDH3、CmGS2和 CmGAD5 也起到十分重要的作用，與以上結果一致。

圖3桃溪蜜柚果實發育階段檸檬酸轉運相關基因的表達量

圖4桃溪蜜柚果實發育階段檸檬酸降解相關基因的表達量

4結論

綜上所述，本研究結果表明，檸檬酸為桃溪蜜柚有機酸的主要成分，在果實發育階段整體呈上升趨勢，其中 S3～S4 （盛花后 90～105d ）變化顯著。

檸檬酸合成基因CmPEPC2和CmCS1共同參與了桃溪蜜柚果實檸檬酸的表達，檸檬酸快速增加期主要受 H⁺ 反向轉運蛋白基因CmCHX和降解相關基因CmACL3和CmGAD5的調控，而隨后檸檬酸降解相關基因（CmACL3、CmAco3、CmNAD-IDH2、CmNAD-IDH3.CmGS2 和 CmGAD5 ）和轉運相關基因 （CmCHX，CmDIC，CmVHP2） 的表達減緩了果實檸檬酸的積累，使檸檬酸含量趨于穩定。

參考文獻：

[1]李宏祥，馬巧利，林雄，等．采收成熟度對桃溪蜜柚貯藏品質及 抗氧化性的影響[J]．食品與發酵工業，2019，45（13）：191－198.

[2]勒思，魏清江，雷常玉，等．基于多元統計法的不同果實大小桃 溪蜜柚品質綜合評價[J]．農業大學學報，2021，43（4）： 740 -749.

[3]LuXP，LiuYZ，ZhouGF，etal.Identification of organicacidrelated genes and their expression profilesin two pear（Pyrus pyrifolia）cultivars with difference in predominant acid type at fruit ripening stage[J]. Scientia Horticulturae，2011，129（4）：680-687.

[4]AlbertiniMV，CarcouetE，PaillyO，et al.Changes inorganic acids and sugars during early stages of development of acidic and acidless citrus fruit[J]. Agric Food Chem，2006，54（21） ：8335-8339.

[5]李紹佳.CitERF13與 CitWHA-c4 協同調控柑橘果實檸檬酸代謝 研究[D]．杭州：浙江大學，2016：29-31.

[6]孫達，張紅艷，程運江，等.11個產地紐荷爾臍橙果實風味物 質含量差異[J]．植物科學學報，2015，33（4）：513-520.

[7]易明亮，張王妮，楊莉，等．馬家柚果實發育期有機酸含量變 化及檸檬酸代謝相關基因的表達分析［J]．農業大學學報， 2022，44（4） ：841-851.

[8]SadkaA，DahanE，CohenL，etal.Aconitase activity and expression during the development of lemon fruit[J].Physiologia Plantarum， 2000，108（3） ：255-262.

[9]Ratajczak R. Structure，function and regulation of the plant vacuolar H⁺ - translocating ATPase[J]．Biochim Biophys Acta，2000，1465 （1/2）：17-36.

[10]Maeshima M. Vacuolar H⁺ -pyrophosphatase［J]．Biochim Biophys Acta，2000，1465（1/2）：37-51.

[11]Tan FQ，Zhang M，XieKD，etal.Polyploidy remodelsfruit metabolismby modifying carbon source utilization and metabolic flux in Ponkan mandarin（Citrus reticulata Blanco）[J]．Plant Sci， 2019，289：110276-110287.

[12]LinQ，Li SJ，Dong W C，et al. Involvement of CitCHX and CitDIC indevelopmental -related and postharvest-hot-air driven citrate degradationincitrusfruits[J].PLoSOne，2015，10（3）： e0119410 - e0119425.

[13]易明亮，肖灑，劉德春，等．溫州蜜柑完熟栽培期間果實糖酸 變化及其相關基因表達分析[J]．農業大學學報，2022，44 （1） ：35 -44.

[14]楊歡．柑橘果實發育過程中檸檬酸積累相關基因表達分析 [D]．武漢：華中農業大學，2018：25-38

[15]Cercós M，Soler G，IglesiasD J，et al.Global analysis of gene expression during development and ripening of citrus fruit flesh ： a proposed mechanism for citric acid utilization[J].Plant Molecular Biology，2006，62（4/5） ：513-527.

[16]高陽，闞超楠，陳楚英，等.靖安碰柑果實發育階段檸檬酸含 （8） ：936 -946.

[17]占敏宣，魏清江，林雄，等.PCA再分析采收成熟度對桃溪蜜 柚貯藏品質變化模式的影響[J]．食品與發酵工業，2021，47 （9） ：183 -190.

[18]戴祥生，趙曉東，張績，等．施肥處理對桃溪蜜柚養分吸收、產 量及品質的影響[J]．安徽農業科學，2019，47（21）：148-150， 174.

[19]Chen M，XieXL，LinQ，etal.Differential expression of organic acid degradation-related genes during fruit development of navel oranges（Citrussinensis）in two habitats[J].Plant Molecular BiologyReporter，2013，31（5） ：1131-1140.

[20]GuoL X，Shi CY，Liu X，etal.Citrate accumulation-related gene expression and/orenzymeactivityanalysiscombinedwith metabolomics provide a novel insight for an orange mutant[J]. Scientific Reports，2016，6（1） ：29343-293454.

[21]Jiang Z Q，HuangQ，JiaD F，et al.Characterization of organic acid metabolism and expression of related genes during fruit development of Actinidia eriantha‘Ganmi6’[J]. Plants，2020，9（3）：332- 346.

[22]江東，王旭，李仁靜，等.基于GBS技術開展柚類資源群體 遺傳評價并發掘酸含量相關基因[J]．中國農業科學，2023，56 （8） ：1547 -1560.

[23]趙宇洪，何文，李根，等．四川地區琯溪蜜柚及其芽變品種 的果實品質[J]．浙江農業學報，2022，34（5）：995－1004.

[24]馬有軍.紅肉蜜柚和三紅蜜柚果實發育規律及外源ABA對其 果實品質的影響[D]．雅安：四川農業大學，2019：28-32.

[25]陳青英，陳俊偉，徐紅霞，等.大棚栽培玉環柚果實發育與糖酸 積累特性[J]．福建農業學報，2015，30（5）：492-497.

[26]付莉莉，吳巨勛，伊華林.臍橙晚熟突變體及其野生型果實檸檬 酸代謝基因表達分析[J]．園藝學報，2016，43（1）：38-46.

[27]文濤，熊慶娥，曾偉光，等．臍橙果實發育過程中有機酸合成 代謝酶活性的變化[J]．園藝學報，2001（2）：161－163.

[28]張小紅，趙依杰，潘東明，等.琯溪蜜柚果實采后有機酸代謝 [J]．果樹學報，2010，27（2）：193-197.

[29]Sadka A，Artzi B，Cohen L，etal.Arsenite reducesacid content in citrus fruit，inhibitsactivity of citrate synthase butinducesitsgene expression[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，2000，125（3）：288-293.

[30]Luo A C，Yang X H，Deng Y Y，et al. Organic Acid concentrations and the relative enzymatic changes during the development of the citrus fruits[J]. Agricultural Sciences in China，2003，2（6）：653- 657.

[31]胡小梅.柑橘ATP-檸檬酸裂解酶基因的挖掘與其在檸檬酸代 謝中的作用研究[D].武漢：華中農業大學，2015：33-35.

[32]張規富．水分脅迫對寬皮柑橘果實品質及檸檬酸代謝相關基因 表達的影響[D]．長沙：湖南農業大學，2015：79-90.