南瓜RPW8基因家族鑒定及響應白粉病侵染表達分析

中圖分類號：S642.101；S436.5 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）12-0041-07

南瓜Cucurbitamoschata為葫蘆科南瓜屬植物。南瓜在生產中往往因為種植密度大，田間管理不當等原因，極易產生嚴重的白粉病，從而影響果實的品質及產量。在實際生產中，化學藥劑若不能在最佳防治時期施用會嚴重影響南瓜白粉病的化學防治。同時，白粉病菌的耐藥性也嚴重制約了藥劑對白粉病的防治效果。因此，培育南瓜高抗白粉病品種對生產尤為重要。

RPW8是植物廣譜抗病蛋白，主要分為RPW8/RPW8-X和RPW8-NBS這2種類型。前人已相繼在煙草、甘藍型油菜、西瓜等植物中確定RPW8基因對白粉病的抗性功能[1-3]。編碼 RPW8的基因通過水楊酸通路和增強疾病敏感性通路，使擬南芥對白粉病產生抗性[4-5]。Wang等對西葫蘆CpPM10.1基因進行鑒定和定位分析，發現該基因中的RPW8結構域可調控白粉病的抗性6]RPW8.2在葡萄中的異位表達不僅顯著增強水楊酸依賴的防御信號，而且可改變其他激素相關基因的表達，提高葡萄對白粉病的抗性[7]。此外，綦聰對西葫蘆的抗白粉病基因精細定位時發現了3個抗病基因中均含有RPW8結構域[8]。因此，本研究對南瓜RPW8基因家族成員進行鑒定，通過理化性質、序列特征和系統進化等分析，揭示中國南瓜RPW8基因家族成員特性，為南瓜抗病育種研究提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為蜜本南瓜，試驗時間為2021年5月，試驗在昆明學院農學與生命科學學院進行。

1.2 試驗方法

1.2.1南瓜RPW8基因家族成員鑒定從南瓜基因組數據庫（http：//cucurbitgenomics.org/organism/9）中下載相關序列，版本為V1。利用隱馬爾可夫模型（PF05659）進行hmmsearch，獲得 E 值小于 1× 10^-5 的序列，后續進行人工逐條確認。使用TBtools軟件對鑒定的RPW8基因進行染色體定位分析。其余葫蘆科植物RPW8基因家族成員鑒定方法同上。

1.2.2南瓜RPW8基因家族成員序列特征分析利用SOSUI、ExPASy和Plant-mPLoc對南瓜RPW8基因家族成員編碼的蛋白質進行氨基酸長度、平均疏水性、跨膜結構域、等電點、分子量和亞細胞定位預測。使用TBtools軟件中的VisualizeGeneStructure進行基因結構分析[9]。使用MEME和NCBI的BatchCD-Search工具進行motif和序列保守結構域分析。使用PlantCARE在線工具分析啟動子區域的順式作用元件。

1.2.3南瓜和葫蘆科植物RPW8基因家族成員系統進化分析利用MEGA6軟件對南瓜和葫蘆科植物RPW8基因家族蛋白序列構建系統進化樹（鄰接法）。相關參數設置為：Bootstrapmethod1000;Poissonmodel;Partialdeletion95;其余參數默認。

1.2.4南瓜基因組共線性分析使用MCScanX對南瓜及葫蘆科植物進行物種內及物種間的共線性分析。葫蘆科植物包括筍瓜（Cucurbitamaxima）、西葫蘆（Cucurbitapepo）、墨西哥南瓜（Cucurbitaargyrosperma）、葫蘆（Lagenariasiceraria）、甜瓜（Cucumismelo）、西瓜（Citrulluslanatus）、黃瓜（Cucumis sativus）和冬瓜（Benincasa hispida）。

1.2.5南瓜RPW8基因家族成員表達特征分析從南瓜基因組數據庫下載RPW8基因在果實、葉片、根和莖中的表達量數據，繪制熱圖，并對其進行分析。

1.2.6 南瓜RPW8基因家族成員RT-qPCR驗證

以蜜本南瓜為材料，待長至3葉1心時，葉面噴施白粉病孢子懸浮液。采集接種后 0，12，24，96h 這4個時期的葉片，以噴施等體積無菌水處理為對照，每個時期選取3個生物學重復。取樣后液氮冷凍置于 -80°C 冰箱保存，以備后續試驗。6個RPW8基因引物來自qPrimerDB－qPCR引物數據庫（https：//biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）。RNA提取與純化采用SteadyPurePlantRNAExtractionKit（AccurateBiology，AG21019）試劑盒。使用超微量分光光度計（BioDrop， μLite ）檢測提取的RNA濃度和純度。用EvoM-MLVRTPremixforqPCR（AccurateBiology，AG11706）試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。熒光定量PCR儀型號為Mastercyclereprealplex4S，試劑盒采用SYBRGreenqPCRMix（biosharp，BL698A），反應體系配置參照使用說明進行，每個樣品設置3個技術重復。以CAC作為內參基因[10]。采用 法計算各個基因的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1南瓜RPW8基因家族成員鑒定

經篩選后最終確認南瓜中有6個RPW8基因家族成員。染色體定位顯示，該家族成員位于1、3、5、7、9號染色體上，其余染色體上無分布。其中3號染色體有2個成員，其余均為1個（圖1）。

2.2南瓜RPW8基因家族成員序列特征分析

通過對鑒定出的RPW8家族成員理化性質分析可知，該家族成員編碼的蛋白質氨基酸長度為386～847aa;分子量為 43896.82～95681.29u ；等電點為 6.52～8.65 ;平均疏水性為 -0.243 264～ -0.06687 。僅有CmoCh07G007360.1具有跨膜結構域。亞細胞定位顯示CmoCh03G010060.1和CmoCh07G007360.1均定位在細胞膜和細胞質；CmoCh03G010070.1定位在葉綠體和細胞質；其余成員則僅定位在細胞質中（表1）。

通過對基因結構分析發現，該家族成員結構較為保守，每一個南瓜RPW8基因家族成員都具有MLKL_NTD超家族保守結構域。大部分成員具有5個外顯子及4個內含子。僅有1個成員的外顯子數量為3，內含子為2。通過蛋白motif分析得出，CmoCh03G010070.1僅含有motif10和motif9；其余成員的蛋白motif結構保守性較強（圖2、表2）。

圖1南瓜RPW8基因染色體定位

表1南瓜RPW8基因家族成員理化性質

通過對RPW8基因上游 2000bp 區域進行順式作用元件分析發現，該家族成員含有大量與光響應相關的順式作用元件。此外還包括茉莉酸、防御和應激、MYB、低溫、脫落酸、生長素、赤霉素、水楊酸等響應作用元件。除CmoCh09G001990.1外，所有基因含有茉莉素響應元件。防御和應激響應元件只在 CmoCh03G010060.1、CmoCh09G001990.1、CmoCh03G010070.1 和 CmoCh01G019260.1 中分布（圖3）。

2.3南瓜RPW8基因家族成員系統進化分析利用MEGA6軟件構建的系統進化樹可知，南瓜RPW8基因家族成員分為兩大類。第一類為RPW8-X類型（僅包含CmoCh03G010070.1）;第二類為RPW8-NBS類型（其余5個成員均為此類）。在第二類型中，CmoCh03G010060.1、CmoCh07G007360.1和CmoCh05G012040.1遺傳距離較近，CmoCh09G001990.1與CmoCh01G019260.1位于另一分支（圖3）。

2.4葫蘆科植物RPW8基因家族成員系統進化分析

從西葫蘆中鑒定出8個RPW8成員，墨西哥南瓜7個，筍瓜6個，冬瓜、葫蘆、黃瓜、甜瓜和西瓜均為4個。從系統發育樹可知，葫蘆科植物RPW8基因家族成員可分為4類。1類為RPW8-X類型；其余3類均為RPW8-NBS類型（圖4）。9種葫蘆科植物的RPW8基因在4個類型中均有分布，西葫蘆在每類中的數量均為2，而西瓜、黃瓜、冬瓜、甜瓜和葫蘆在每類中均只有1個成員。南瓜、筍瓜、西葫蘆和墨西哥南瓜的RPW8基因聚為一簇，同源性高。其次，黃瓜（CsaV34G034000.1）與甜瓜（MEL03C016725T1）也具有較高的相似性。西瓜的RPW8基因在I類和IV類中與冬瓜親緣性較高，而在Ⅱ類和Ⅲ類中則與葫蘆有更高的親緣關系。

表2蛋白motif分析

圖3南瓜RPW8基因順式作用元件分析

2.5 共線性分析

利用MCScanX軟件分析中國南瓜基因組共線性關系得出，CmoCh03G010060.1、CmoCh07G007360.1、CmoCh09G001990.1、CmoCh01G019260.1可能來自全基因組復制或片段復制，CmoCh05G012040.1基因可能通過轉座方式產生，CmoCh03G010070.1通過串聯重復而來。由全基因組復制或片段復制而產生的4個基因和串聯重復產生的1個基因均表現出共線性關系；而轉座產生的1個基因與其余的RPW8家族成員不存在共線性關系（圖5）。

對南瓜與葫蘆科植物進行共線性分析可知，南瓜與筍瓜南瓜共線基因對數量最多（圖6－A），其次為西葫蘆（圖6-B）墨西哥南瓜（圖6-C）、葫蘆（圖6-D）和甜瓜（圖6-E）。而西瓜（圖6-F）、黃瓜（圖6-G）和冬瓜（圖6-H）與中國南瓜的共線基因數量最少，均為5。

2.6表達量分析

從數據庫中選取南瓜RPW8基因家族成員在果實、葉片、根、莖中的表達量繪制熱圖。分析發現CmoCh01G019260.1在南瓜果實、葉片、根和莖中的表達量較其他成員高。CmoCh03G010070.1在果實、根、莖中的表達量極低。CmoCh09G001990.1在葉片和莖中的表達量比在果實和根中的表達量高，而CmoCh05G012040.1與之相反。CmoCh07G007360.1在4個部位均有表達，果實中的表達量相對較高。而CmoCh03G010060.1在4個部位中的表達量均較低（圖7）。

圖5南瓜RPW8基因共線性關系

2.7南瓜RPW8基因家族成員RT-qPCR驗證

對南瓜RPW8基因家族成員進行熒光定量分析。結果表明：CmoCh03G010060.1在接種后表達下調，24h 的表達水平僅為對照的 41.8% ^96h 表達水平上升，但仍處于較低的表達水平。CmoCh07G007360.1接種后 ^12h 表達輕微上調，而 ^24，96h 表達水平均低于對照。CmoCh05G012040.1在接種后僅在 96h 有顯著下調。CmoCh09G001990.1接種后先上升，后下降與對照趨平。CmoCh03G010070.1在接種后24h 表達水平明顯下調，僅為對照的 29.9% ，而96h 后表達水平比對照高52. 8% 。CmoCh01G019260.1在接種后的3個時間段表達水平均顯著上升，12、24、 96h 分別上調為對照的3.4、2.2、3.7倍。雖然 24h 的表達水平相對 12h 有所下降，但仍處于較高的表達水平（圖8）。

圖6南瓜與葫蘆科植物RPW8基因共線性關系

A—筍瓜-南瓜；B—西葫蘆-南瓜；C—墨西哥南瓜-南瓜；D—葫蘆-南瓜；E—甜瓜-南瓜； F—西瓜-南瓜；G—黃瓜-南瓜；H—冬瓜-南瓜

3討論

RPW8結構域最早出現在陸生植物小立碗蘚Physcomitrellapatens中。研究發現該結構很可能是由非編碼序列或重復后的結構域分化重新產生，它可通過整合到NBS-LRR蛋白中，形成RPW8編碼基因的一個主要亞類，即RPW8-NBS 編碼基因[1]

本研究從南瓜中鑒定出6個RPW8基因家族成員。根據系統進化樹及保守結構域分析可將該6個成員分為兩大類。一類為RPW8-X類型，另一類為含有NBS結構域類型。RPW8-X類型的基因含有PH-like結構域，它們通常參與蛋白質靶向細胞或與結合伴侶相互作用[12]。含有NBS結構域的成員又分為2類，一類含有PLN03210結構域，該結構域為擬南芥中對丁香假單胞菌Pseudomonassyringae的抗性結構域[13]；另一類為富含亮氨酸的重復蛋白（LRR）。本研究鑒定的2類成員在理化性質、基因結構、保守結構方面具有差異，而同一類的成員較為相似，該分類結論與前人研究結果[1]相符。

圖8接種白粉菌后不同時間段南瓜RPW8基因表達

前人在野薔薇、蘋果、梨、桃和梅中分別鑒定出58.51、41、21、24個RPW8家族成員[11]，本研究鑒定到6個。通過共線性分析發現，南瓜RPW8基因家族成員大部分通過全基因組復制或片段復制產生，僅有1個基因（CmoCh03G010070.1）通過串聯重復而來。在大部分植物中，串聯重復是RPW8編碼基因擴增的重要方式[11]。本研究結果的差異可能來源于物種的特異性。

本研究鑒定的順式作用元件大部分與激素相關，同時也包含干旱、低溫和防御應激的作用元件。茉莉酸涉及到植物生長、開花、衰老、生物和非生物脅迫的各種反應[14-15]。前人研究發現外源施用茉莉酸能明顯增強玉米對赤霉莖腐病的抗性[16]。在番茄中施用褪黑激素能激活茉莉酸信號通路，提高果實對灰葡萄孢菌的抗性[7]。而南瓜大部分RPW8成員中均有茉莉酸響應元件，由此可推測茉莉酸在南瓜抗白粉病過程中可能具有重要作用。

RPW8識別白粉病病原體后，通過水楊酸和過敏反應通路對白粉病產生抗性[18]。同時RPW8 也能增強乙烯信號通路，后者反過來負調節RPW8.1介導的細胞死亡和防御反應[19]。CmoCh01G019260.1在接種白粉病菌后，表達水平均顯著上升。從在公共數據庫中獲得的表達量數據可見，該基因在葉片上的表達也極其顯著。參照RPW8在擬南芥中對白粉病的抗性機制，推測CmoCh01G019260.1在南瓜中可能充當著相同的角色，但該基因在南瓜中如何參與對白粉病的抗性作用，相關機制及調控網絡仍需進一步深入研究。

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