198份小麥種質成株期抗葉銹病鑒定與分析

中圖分類號： 5435.121.4⁺3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）12-0136-10

小麥葉銹病是由小麥葉銹菌（Pucciniatriticina）侵染引起的真菌性病害，是影響小麥產量的重要因素之一，病害嚴重流行年份可造成產量損失達 40% 以上[1]。氣候的變暖、密植品種的推廣和播種方式的轉變，協同加劇了小麥葉銹病的發生與流行[2-3] 。不定期、范圍大、危害重，是目前小麥銹病的發生特點。究其原因，一是病原菌變異快、品種抗性下降，二是推廣品種的抗病能力不強[4-6]。在生產中控制小麥葉銹病流行危害，最經濟有效的措施依然是選育并種植抗病品種。

病原菌、種質的抗性、氣候條件等因素影響著小麥葉銹病的發生。長期種植單一化的抗病品種是小麥葉銹病流行的主要原因之一，當病原菌群體的毒性變異持續積累且氣候適宜，載體原有的抗病能力就會隨之減弱或喪失。因此，合理布局抗病品種、培育抗葉銹病新種質十分重要。近年來，國內外使用標記檢測和基因推導技術鑒定小麥材料苗期及成株期的抗病性，其中21份具有較好抗性的種質被陳萬權等鑒定出來[7-8]。對我國小麥試驗品種（系）進行抗病性鑒定評價，發現抗性品種比例僅為9.9% 左右，感病品種達 70.4% 左右[9]。通過對陜西、貴州、四川、湖北等地的近200個國內小麥品種及引進國外的100多個小麥品種進行抗葉銹性鑒定，共鑒定出 LrI，Lr3，Lr9，LrIO，Lr26，Lr34 等幾十個基因[10-14]。關于小麥品種對小麥葉銹病苗期和成株期抗性的研究很多，但對貴州省小麥自育品種（系）、地方品種及國內外部分小麥高代材料的抗葉銹病鑒定的相關研究尚不多見。

因此，了解主要小麥品種（系）對葉銹病的抗性狀況，對小麥安全生產、保障糧食安全有較好的現實指導意義。為此，于2020—2022年對提供的198份小麥品種（系）進行葉銹病抗性鑒定，包括基因型鑒定、田間成株期抗性表型鑒定，以期篩選出優秀的種質資源并豐富抗性品種。

1材料和方法

1.1 試驗材料

由小麥研究課題組提供198份小麥種質資源（表1），其中貴州自育品種（系）為116份，四川品種為49份，其他地區品種為12份，國外品種為21份。致病菌為 PHT，THT2 種混合菌株，是生產上的流行小種，由中國農業科學院植物保護研究所提供。供試的省外品種（系）的農藝性狀經篩選表現較好。

表1198份小麥品種葉銹病抗性及Lr基因分布

表1（續）

表1（續）

表1（續）

表1（續）

注：空白處表示來源不詳。

2020年10月開始播種，1行種植6份小麥種質，采用開溝條播法，行長 1.2m ，每 20cm 播種1份種質，每份種質播種8～10粒，行距為 25cm ，間隔種植1行感病對照小麥品種銘賢169（1行/20行）。拔節初期，將葉銹菌混合菌系均勻地撒到葉片上進行接種，接種后用可降解塑料袋覆蓋葉片保濕 15h 左右，隔天拂曉移開塑料袋。當銘賢169完全發病時，再調查供試小麥品種（系）的發病情況，按照中華人民共和國農業行業標準（NY/T1443.1—2007）分別記錄各品種反應型、嚴重度、發病率，反應型采用0、 這6級標準進行統計，其中0、0；1、2級為抗病，3、4級為感病。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 于第2年春季取幼嫩小麥葉片，用于提取DNA。

DNA提取步驟： （1）1.5mL 離心管中放3個大鋼珠，再放入葉子放入液氮中，然后上機打樣；（2）1.5mL 離心管中加人經加熱后的CTAB溶液800μL ，置于 58^°C 的水浴鍋，水浴 40min ;（3）水浴結束后，加入 800μL 三氯甲烷，輕柔地上下顛倒至乳化狀后，靜止 3min ，置于低溫離心機中，10 000r/min 離心 10min ;（4）吸出上清液至對應的空離心管中，加入 800μL 三氯甲烷，輕柔地上下顛倒至乳化狀后，靜止 3min ，置于低溫離心機中，10 000r/min 離心 10min ;（5）吸出上清液至對應的空離心管中，加入 500μL 冰凍異丙醇，立即輕柔地上下顛倒混勻至有白色絮狀出現；（6）將異丙醇倒掉，先用 75% 的乙醇清洗2遍，再用無水乙醇清洗2遍，放至無乙醇味后，加入雙蒸水，待DNA溶解；（7）DNA電泳檢測： 1% 的瓊脂糖凝膠電泳；（8）DNA光度法檢測（ND-1000微量紫外分光光度計）。

試驗方法。PCR擴增體系為 10μL ，包括： 10× Buffer 1μL，2.5 mmol/L dNTPs 1μL ，正反向引物各0.5μmol/L ，TaqDNA聚合酶1U，熒光素-dUTP10pmol ，DNA5 ng，加 ddH₂0 至 10μL 。PCR擴增程序： 94^9C 預變性 4min;94^°C 變性 ^30s，58°C 退火30s，72°C 延伸 30s ，共35個循環； 72^°C 下再延伸10min ，在 4°C 環境下保存供用。基因名稱及標記引物序列見表2。本研究同時采用瓊脂糖電泳分析和競爭性等位基因特異性PCR（KASP）分型。其中， Lr67 同時采用瓊脂糖電泳法、KASP分型，其余目標基因均采用瓊脂糖電泳分析。

表2基因及標記引物序列

1.2.2葉銹病表型抗性鑒定2020 年10月中下旬在貴州省貴陽市花溪區試驗點進行試驗，試驗占地面積 300m² ，均采用隨機區組設計，每份試驗品種種植1個小區，每個小區面積 0.6m² （行長1.2m ，行間距 0.25m，2 行/區），每間隔5份試驗品種（系）設1個感病對照（SL95－71），共148個小區。試驗地四周及過道設有誘發行，播種銘賢169。常規田間管理，采用噴霧法在拔節期接種葉銹病菌孢子懸液，1行噴霧1個分蘗，于灌漿中期調查葉銹病病害等級，調查2次，中間間隔1周，按0～4級法進行病級劃分。劃分標準：0級（免疫型），葉上無可見癥狀；0；級（近免疫型），葉上產生小枯斑，無孢子堆；1級（高抗型），夏孢子堆小，周圍有枯斑;2級（中抗型），夏孢子堆小到中等，生在綠色組織上，周圍有枯斑；3級（中感型），夏孢子堆較大，周圍組織有褪綠現象；4級（高感型），夏孢子堆大，周圍不褪綠。分別于2021、2022年春鑒定葉銹病抗性，抗性結果取發病嚴重的等級。

2 結果與分析

2.1葉銹病成株期表型抗性鑒定與評價

使用上述混合流行菌種進行人為誘發，在貴州省農業科學院鑒定198份種質的成株期表型抗性。由表3可知，表現出成株期抗性的種質有150份（反應型 ?2 ），包括85份貴州品種（系）（占比73.28% ） ?36 份四川品種（系）（占比 73.47% ）、8份其他省份品種（系）（占比 66.67% ）、21份國外品種（系）（占比 100% ），鑒定圃位于貴陽市花溪區。貴州收集到的材料結果表明：國外品種（系）的小麥葉銹病抗性水平較國內品種（系）抗性水平高，國內貴州、四川抗性水平較高，但對比國外，貴州葉銹病抗病選育工作需要進一步加強。

表3小麥材料的成株期抗葉銹病鑒定結果

由表4可知，供試材料中僅69份免疫材料，其中包括54份國內品種（系）15份國外品種（系）；37份近免疫材料，包括32份國內品種（系）、5份國外品種（系）；23份高抗材料，包括22份國內品種（系）1份國外品種；21份中抗材料、25份中感材料、23份高感材料均來自國內。研究發現，該批材料國外品種（系）均達到高抗以上水平；國內自育品種（系）共計151份，103份達抗病水平，抗病率達68.21% ；同時發現利用國外種質作為親本選育的品種（系）共22份，其中僅有1份表現中感水平，其余均表現中抗以上水平（表1）；貴州地方品種均達到中抗以上水平，其中18份達免疫水平。選育過程中可優先選用抗性較好的種質，這些種質既可作為下一步進行抗病育種的資源，也可用于小麥生產。

表4小麥材料的成株期抗葉銹鑒定結果

2.2抗葉銹病基因檢測結果

利用已知葉銹病抗性基因 Lr9，LrI9，Lr24 Lr38、Lr67、Lr68 的功能標記或緊密連鎖標記，對198份材料進行基因型檢測，發現15份材料含有 LrI9，5 份材料攜帶 Lr38，17 份材料攜帶Lr68，其中3份材料含有2個Lr基因，未檢測到 Lr9，Lr24，Lr67 等基因（表1）。為了確保檢驗結果的可靠性，同時采用瓊脂糖電泳分析、KASP分型技術對Lr67基因進行雙重驗證，所得結果一致，證實了檢測數據的準確性和可重復性（圖1、圖2）。

圖1編號1-24材料Lr67的瓊脂糖電泳條帶結果

圖2編號1～92材料Lr67的KASP結果

質含有 Lrl9+Lr68 基因的感病率為0。同時發現，不含目標基因的供試種質的感病率為 25.61% （表5）。

表5基因類型的感病率

Lr19基因載體種質的感病水平為 13.33% 。Lr38 基因在材料中分布較少，5份材料含有 Lr38 基因且其中4份為中抗以上水平，感病率為 20% 。Lr68基因載體種質的感病水平為 17.65% 。供試種含有抗性目標基因的種質，其感病率較不含有目標基因的種質低；目標基因聚合的種質，其感病率更是遠遠低于含單個目標基因的種質。

此外，國外品種和貴州地方品種的種質不含有目標檢測基因，但它們抗性在中抗以上水平，推測可能含有其他抗性基因。

2.3抗葉銹病綜合分析

目標基因的聚合能夠提高小麥品種（系）的抗性水平，與前人研究結果[15]一樣。推測國外品種和貴州地方種質可能含有其他抗性基因，進一步挖掘和標記小麥葉銹病新抗病基因，是培育抗病品種、控制葉銹病發生的重要基礎。國內在選育品種的過程中，部分抗性有逐漸喪失的趨勢，這既有毒力小種變異的因素，也有選育方式方法不夠科學的因素。進一步運用分子標記輔助選擇尤為重要，可大大提高育種效率和成功率。

共計篩選含有目標基因的高抗種質24份。其中表現高抗以上且含有 LrI9 的材料有9份，分別為黔13夏 245F₈-5 黔 1597F₆-3 、黔16夏 370F₆ 12、黔 13275F₁₀-2 夏-2、節燕普3號、牛04206、貴農19、滇麥7號、綿麥903；表現高抗以上且含有Lr38的材料為3份，分別是黔貴 AF₅ 黔 16389F₆ 11-1-2-1黔 15317F₇-3-2-3-1 ；表現高抗以上且含有 Lr68 的材料有9份，分別是 2-56F₆-2- 1-2.2-316F₉-2-3 夏-1、黔 18243F₅-3 夏-5、黔 15314F₈-4-2 夏-2、黔 13275F₉-1 夏-1、黔13275F₁₀-2 夏-1、川輻14、貴農麥1803、貴農麥18-6;表現高抗以上且含有 Lrl9+Lr68 的材料有3份，分別是 2-164F₆-1-2-3.2-316F₉-2-4 夏-1、綿麥1302。

在本次研究中，參試的198份品種（系）中，抗葉銹病種質有150份，感葉銹病的有48份，分子標記檢測到34份材料是含有抗性基因的。部分種質含有自標基因，但其田間表型卻為感病表現，可見小麥葉銹病的抗性表達還與接種病菌和鑒定環境有關。

3討論

葉銹病是一種真菌性病害，其抗性表現屬于數量性狀。通過建立種質資源庫和保護區，可確保種質資源的可持續利用。我國小麥的抗葉銹病種質資源很多，需要進一步挖掘；分析發現，國外種質資源的葉銹病抗性較好，可以作為今后葉銹病抗性育種的重點考慮因素。到目前為止，正式命名的小麥抗葉銹病基因有幾十種，小麥抗葉銹病基因Lr9來源于小麥-小傘山羊草（Aegilopsumbellulata），對我國葉銹菌優勢生理小種THT、PHT表現高度抵抗[16]。Lr19是一種非常有效的抗性基因，來源于長穗偃麥草，其致病菌株在1994年的墨西哥被首次報道，至今只有少數幾個菌株對之有毒性，因此找尋其連鎖的分子標記。克隆抗病基因、分子標記輔助育種等有重要意義[17]。來源于長穗偃麥草（Agropyronelongatum）的抗葉銹基因 Lr24（3Ag/3D） 0對我國目前葉銹菌優勢致病類型均表現高度抵抗[18-20]。 Lr38 為高抗葉銹病基因，可為小麥抗葉銹病育種提供依據[2I]。本研究選取的 Lr67，Lr68 的抗病效果持久[22]

就貴州收集到的小麥資源來看，貴州小麥抗性比例較高，但低于國外品種；國外品種均不感病。這跟貴州小麥生產季節田間復雜高濕環境有關，感病種質更易表現，利于篩選；同時說明貴州葉銹病選育工作需要進一步加強。分析發現，選育品種（系）的感病率在上升，可見變異的葉銹菌毒性小種和優勢小種的更換使得抗病種質容易喪失抵抗力。因此，及時篩選和挖掘新抗病基因資源，將是小麥葉銹病抗性育種的核心策略。通過加速抗性品種的更新迭代，結合科學的品種布局規劃及病原菌變異抑制措施，使得抗病品種使用年限得以延長[23]

貴州屬于西南麥區，為冬小麥種植區域。西南麥區病害的發生受貴州麥區的影響[24]。全球性氣候變暖，導致小麥葉銹病發病嚴重，溫度和濕度的變化有可能更利于小麥葉銹病的孳生，因此最經濟有效的措施便是選育和利用小麥抗病品種[3.23]。本研究供試的國外種質以及含有國外親本血緣的種質具有良好抗性表現，說明融合國外血緣來選育抗病品種不失為一種有效的育種方式。

共計篩選含有目標基因的高抗種質24份。根據目標基因的特性、聚合情況及抗病情況，本研究2-164F₆-1-2-3.2-316F₉-2-4 夏-1、綿麥1302等3份材料具有較大的應用價值。

部分種質含有目標基因，但其田間表型卻為感病表現，說明環境因素在葉銹病表達的過程中起到很大的作用；在氣候適宜的年份，小麥葉銹病仍然威脅著小麥的生產。含有聚合抗性基因種質的田間表型為抗性，說明通過綜合鑒定小麥材料的抗銹病能力，選出兼具抗病能力與高產的材料，可同時滿足小麥產量和質量的提高。在抗病育種中應充分利用優異的抗葉銹材料，基因的聚合注重使用不同的抗源，不僅可以豐富抗病基因，又可使抗性水平的持久性得以提高，從而實現貴州小麥銹病的綜合防控和品種抗性的合理布局[25]

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