蠶豆霜霉病病原菌鑒定、生物學特性分析及生防菌篩選

中圖分類號：S436.43 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）12-0146-07

蠶豆（ViciafabaL.）為豆科野豌豆屬，是一種一年生或者越年生的草本植物，在江蘇省種植歷史悠久，因蛋白質含量高，富含氨基酸、維生素和礦質元素[1]，可將其用作鮮食蔬菜、飼料、綠肥和食品加工等。在生產過程中，植物病害是影響蠶豆產量和品質的關鍵因素之一[2]，最常發生的病害有赤斑病、根腐病和銹病[3-6]。霜霉病也是蠶豆上一種常見的真菌性病害，其造成的危害沒有其他3種病害大，關于其病原菌的研究也較少，但近些年該病呈現愈加嚴重的趨勢，在一些地區嚴重影響了蠶豆的產量和品質[7]。近些年來，霜霉病在葡萄和黃瓜上的研究較多[8-9]，在豆類作物上的報道較少。

蠶豆霜霉病的病原菌為野豌豆霜霉，別稱蠶豆霜霉，拉丁學名為Peronosporaviciae（Berk.）de Bary，異名Peronosporaviciae（Berk.）Caspary，屬于卵菌門霜霉屬，是一種專性活體營養寄生物[0]。野豌豆霜霉除了危害蠶豆外，還可以導致豌豆、箭筈豌豆等豆類作物發生霜霉病[11-12]，其主要分為豌豆專化型（Peronosporaviciaef.sp.pisi）和蠶豆專化型（Peronospora viciaef.sp.fabae）[13]。霜霉菌主要經歷人侵、潛育及發病3個階段，以完成對宿主植物蠶豆的侵染[14]。霜霉菌以卵孢子的形式在病株殘體或種子上過冬，翌年在外界條件合適時形成游動孢子，從下胚軸入侵，隨著生長點往上延伸，侵入芽或者真葉，系統地侵染蠶豆植株，隨后生成大量的孢子囊和孢子，繼續侵染植株，經過連續多次的侵染，蠶豆霜霉病廣泛發生流行[15]。高溫高濕的外界條件利于蠶豆霜霉病的發生，通常情況下在氣溫為20～24^°C 的雨季發病嚴重。

蠶豆霜霉病的防治手段一般包括選育抗病種質資源、農業防治、化學防治以及生物防治。培育適應不同地區的霜霉病抗性品種周期長且困難，化學藥劑的反復使用使得病原菌產生了抗藥性，并導致食品上農藥殘留、污染環境等一系列的問題，因此，從生物防治的角度開展蠶豆霜霉病的研究有著很大的現實意義。本研究以江蘇南通的發病蠶豆為研究對象，分離純化其病原菌，根據形態學特性和ITS序列分析，明確蠶豆霜霉病的病原菌種類，進行致病性測定，同時分析病原菌的生物學特性并篩選對其有抑制效果的生防菌，以期為科學合理地防治蠶豆霜霉病提供理論基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試病原菌2023、2024 年分別于江蘇沿江地區農業科學研究所如皋基地、南通市吳窯鎮鑫磊生態家庭農場采集典型霜霉病癥狀病葉，放置于裝有冰袋的低溫取樣箱中，帶到實驗室拍照后備用。1.1.2試劑及儀器植物基因組DNA 提取試劑盒（DP305），北京天根生化科技有限公司；3GTaq？MasterMixforPAGE，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；2000DNAmarker、凝膠回收試劑盒，北京全式金生物技術股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。TL3200B光學顯微鏡，上海締倫生物有限公司；RTOP-310Y人工氣候箱，浙江托普云農科技股份有限公司；恒溫水浴鍋，上海拓赫機電科技有限公司；PCR儀，東勝國際貿易有限公司；電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統，上海培清科技有限公司；氣浴恒溫振蕩器，常州旭日實驗儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌形態學觀察用毛筆輕輕刷取病葉上的霉層，溶解到無菌水中混勻配成孢子囊懸浮液，用滴管吸取1～2滴孢子囊懸浮液，于光學顯微鏡下進行觀察。對典型的孢囊梗和孢子囊拍照，測量孢囊梗的總長度、主干的寬度、末端長度、基部寬度、孢子囊的長度和寬度，并對孢囊梗的分枝次數進行計數[16]。每個指標30個重復。

1.2.2病原菌致病性測定利用活體和離體接種的方法測定病原菌致病性[16-17]。用毛筆輕輕刷取霜霉病葉上的霉層，溶解到無菌水中混勻，配成 1× 10⁵CFU/mL 的孢子囊懸浮液待用。蠶豆種子浸泡24h 后進行催芽，待種子露白后于50孔穴盤進行播種和育苗。待蠶豆長至6張真葉時，用小型手持噴霧器接種孢子囊懸浮液于蠶豆植株，對照接種無菌水。同時，取健康蠶豆植株相同部位的葉片，沖洗其表面雜質，然后置于 75% 乙醇中浸泡 30s ，無菌水清洗干凈后再用無菌濾紙吸干葉片表面殘留的水分。用打孔器打取直徑為 10mm 的葉盤（避開葉片主脈），放置在鋪有濕潤無菌紗布的一次性培養皿中，每皿10個葉盤或1張整葉，葉背向上。每個葉盤中央滴 30μL 孢子囊懸浮液，每張整葉均勻點接孢子囊懸浮液，每點 5μL ，對照接種等體積的無菌水，接種后用保鮮膜封口。葉片和葉盤均3個重復。接種后的蠶豆植株、葉盤和葉片放置在溫度25^qC 、濕度 100% 的人工氣候箱中，黑暗培養 24h 后， ^12h 光暗交替條件培養，5d后觀察發病情況。1.2.3病原菌分子生物學鑒定采集霜霉病嚴重、霉層厚的蠶豆病葉，用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用套式PCR擴增霜霉病菌的rDNA-ITS序列，第1輪PCR的引物為真菌通用引物ITS5：5^′ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- ?3^′ 和 P3：5^′- GCCGCTTCACTCGCCGTTAC- -3^′ ，第二輪PCR的引物為霜霉菌特異性引物psml： 5^′ -AACTTTCCACGTGAACTGTAT -3^′ 和 psm2：5^′ -TGAGATGCCGCGCG（204號 ACCGAAG-3^′[18-19] ，所用引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。PCR產物膠回收后送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，所得結果提交到GenBank數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行序列比對，采用MEGA11.0軟件以鄰接法構建系統進化樹，明確病原菌種類[20]

1.2.4病原菌生物學特性測定溫度對孢子囊萌發的影響：配制新鮮孢子囊懸浮液，采用懸滴法培養，依次放置于 5、10、18、25‰ 條件下進行處理，在3、6、9、12、24h 后檢測孢子囊的萌發率。每個處理設定3次重復。

pH 值對孢子囊萌發的影響：用 Na₂HPO₄ 和Na₂HPO₄ 配制 4.94～9.18 范圍內7個不同 pH 值的磷酸緩沖液， 18^°C 懸滴法培養，在 3、6、9、12、24h 后檢測孢子囊的萌發率。每個處理設定3次重復。

碳源對孢子囊萌發的影響：配制 5% 的碳源溶液，所用碳源依次為甘油、葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉。 18^°C 懸滴法培養，在 3、6、9、12、24h 后檢測孢子囊的萌發率。每個處理設定3次重復[21]

1.2.5病原菌生防菌的篩選和鑒定采用離體葉片和葉盤法進行蠶豆霜霉病病原菌生防菌的篩選[22-23]。將從健康植株根際土壤中分離獲得的 21株生防菌（包含細菌和真菌，對多種病原菌具有拮抗作用）接種于裝有 100mL LB或PDB培養基的錐形瓶中， 28^°C ， 180r/min 培養 ^72h 后，將它們稀釋成 1×10⁸ CFU/mL待用。取健康蠶豆植株相同部位的葉片，在21株生防菌液中充分浸泡30s，待菌液吸收干后，打取直徑為 10mm 的葉盤或1張整葉，放置在鋪有濕潤無菌紗布的一次性培養血中，葉背向上。培養 24h 后，每個葉盤中央滴 30μL 孢子囊懸浮液，每張整葉均勻點接孢子囊懸浮液，每點 5_μL ，設置病原對照及無菌空白對照。接種后的葉片和葉盤置于溫度 25^°C 、濕度 100% 的人工氣候箱中，黑暗培養 24h 后， 12h 光暗交替條件培養，5d后觀察發病情況。每個處理3個重復。

提取篩選出的生防菌的DNA，擴增其16SrDNA序列，引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^′ 和1492R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3^′[22] ，所用引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。擴增產物送到北京擎科生物科技股份有限公司進行測序，所得結果提交至GenBank數據庫進行序列比對，采用MEGA11.0軟件以鄰接法構建系統進化樹，明確生防菌種類。

2 結果與分析

2.1蠶豆霜霉病的田間發病癥狀

蠶豆霜霉病一般在早春開始發生，孢子從下胚軸入侵，菌絲隨著生長點往上延伸，系統地侵染植株，隨后產生大量的孢子囊，在高溫高濕的天氣迅速傳播，導致整個植株受到感染（圖1-A、圖1-B）。霜霉病發病早期，葉片上呈現形狀不規則、輪廓不明顯的褪綠色斑塊（圖1-C）。發病中期，病斑逐漸變成黃綠色至灰黃色，開始出現霉層（圖1-D、圖1-E）。發病晚期，發病葉片開始慢慢卷曲，霉層加厚（圖1-F）。

A、B一蠶豆霜霉病田間發病癥狀；C～F一不同發病時期的霜霉病葉片

圖1蠶豆霜霉病田間發病癥狀

2.2蠶豆霜霉菌的形態學特征

蠶豆霜霉菌是一種專性寄生菌，無法在人工培養基上離體培養和保存。對其孢子懸浮液進行顯微觀察，發現孢囊梗單生或束生，樹形，全長313.12～581.51μm （平均 421.96μm ），有明顯主干，主干寬7.21～13.02upmum （平均 9.33μm ），二叉狀銳角分枝，分枝4～8次（圖2-A）。末端彎曲至弧形，頂端尖鈍形，末端長 7.04～27.86μm （平均 15.80μm ），基部寬 2.13～5.01μm （平均 3.60μm ）（圖2-B）。孢子囊橢球形至短橢球形，淺褐色，長 23.86～ 37.12μm （平均 30.77μm ，寬 18.08～28.23upmum （平均 21.60μm ），長寬比為 1.19～1.85 ，末端有凸出的梗（圖2-C）。孢子囊萌發形成1個至多個芽管（圖2-D、圖2-E），孢子囊還可萌發產生孢囊梗和次生孢子囊（圖2-F）。

圖2霜霉病病原菌的形態學

2.3蠶豆霜霉菌的致病性

對活體蠶豆植株進行孢子囊懸浮液接種，發現接種后4d，葉片邊緣開始褪綠，呈灰黃色，隨著接種時間的增加，病斑逐漸擴大，接種后7d，葉片的邊緣呈現黃褐色（圖3－A），接種無菌水的蠶豆植株一直未發生病變（圖3-B）。對離體的蠶豆葉片和葉盤進行孢子囊懸浮液的接種，發現接種后4d，葉片和葉盤上開始出現黃褐色病斑，隨著接種天數的遞增，病斑逐漸擴散，接種后7d，病斑明顯（圖3-C、圖3-E），接種無菌水的葉片和葉盤未出現任何病斑（圖3-D、圖3-F）。

2.4蠶豆霜霉菌的分子生物學鑒定

將蠶豆霜霉病菌（命名為VFLSM）的ITS序列在GenBank數據庫中進行比對，發現其與Peronosporacf.viciae（登錄號為MF693897.1）和Peronosporaviciae（登錄號分別為AY225471.1、MN784447.1和EF174953.1）的序列相似性達到99% 以上。將VFLSM與其他霜霉屬真菌構建系統進化樹，以假霜霉屬作為外群，發現其與 P .viciae聚在一支上（圖4），結合形態學特性分析，將VFLSM鑒定為野豌豆霜霉（P.viciae）。

2.5蠶豆霜霉菌的生物學特性

2.5.1溫度對霜霉菌孢子囊萌發的作影響由表1可知， .5～25‰ 孢子囊均可萌發，但在 5°C 條件下前 ^9h 未發現孢子囊萌發。孢子囊萌發率隨著溫度的上升呈現先上升后下降的趨勢， 18^°C 條件下孢子囊萌發率最高，培養 24h 后萌發率達到 13.78% 。偏高或偏低的溫度均會影響孢子囊的萌發率。

A一活體接菌后7d；B—活體接無菌水后7d（對照）； C—離體葉片接菌后7d；D—離體葉片接無菌水后7d（對照）； E—葉盤接菌后7d；F—葉盤接無菌水后7d（對照）

圖3接種霜霉病病原菌后的發病情況

2.5.2 ΔpH 值對霜霉菌孢子囊萌發的影響由表2可以看出， pH 值在 4.94～9.18 范圍內孢子囊均可萌發，但 ΔpH 值為9.18時， ³h 內未發現孢子囊萌發。孢子囊萌發率隨著 pH 值的上升呈先升后降的趨勢，pH值為7.17條件下孢子囊萌發率最高，培養24h 后萌發率達到 12.12% ，但低于蒸餾水中的孢子囊萌發率。偏高或偏低的 pH 值均會影響孢子囊的萌發率。

表1不同溫度下蠶豆霜霉菌孢子囊的萌發率

表2不同pH值下蠶豆霜霉菌孢子囊的萌發率

2.5.3碳源對霜霉菌孢子囊萌發的影響由表3可知，4種碳源環境下，孢子囊均可萌發。可溶性淀粉作為碳源時，孢子囊萌發率最高，培養 24h 后萌發率達到 14.16% ，高于蒸餾水中的孢子囊萌發率。其次為甘油，培養 24h 后萌發率達 11.76% ，低于蒸餾水中的孢子囊萌發率。

表3不同碳源下蠶豆霜霉菌孢子囊的萌發率

2.6蠶豆霜霉菌生防菌的篩選與鑒定

采用離體葉片和葉盤法對蠶豆霜霉菌的生防菌進行篩選，結果表明，經過菌株SF11和SF19處理的蠶豆葉片和葉盤，病斑數明顯少于其他生防菌和病原對照處理的葉片和葉盤，其中SF11處理的葉片和葉盤未出現任何病斑（表4、圖5）。

將菌株SF11的16SrDNA序列在GenBank數據庫中比對，并與其他芽孢桿菌屬細菌構建系統進化樹，以類芽孢桿菌屬作為外群，發現其與Bacillusvelezensis聚在一支上（圖6），將菌株SF11鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。

表4不同生防菌對蠶豆霜霉菌的防治效果

注：-表示葉片、葉盤無病斑； + 表示病斑面積占葉片、葉盤面積的1/3以下； ⁺+ 表示病斑面積占葉片、葉盤面積的 1/3～1/2 ⁺⁺⁺ 表示病斑面積占葉片、葉盤面積的 1/2～2/3 ： ⁺⁺⁺⁺ 表示病斑面積占葉片、葉盤面積的2/3以上。

圖5SF11對蠶豆離體葉片和葉盤的霜霉病防治效果

D一病原對照

3討論

形態學鑒定是判斷病原菌種類的一個重要方法，也是鑒定病害的一步不可缺少的重要環節。本研究中觀察發現，蠶豆霜霉病病原菌的形態學特性與已報道病原菌 P ：viciae的形態學特性一致[24]，但孢囊梗和孢子囊大小存在差異，這也許和生長的環境條件、蠶豆品種以及病原菌生理小種有關[25]rDNA-ITS序列分析常用于真菌近緣種的鑒別和系統發育研究，在藜麥、黃瓜、烏頭等作物的霜霉病病原菌鑒定上也被廣泛應用[16.19，26]。本研究中依據rDNA-ITS序列構建的系統進化樹顯示，蠶豆霜霉病的病原菌與 P ：viciae聚在一支，結合上述形態學鑒定結果，將江蘇南通蠶豆霜霉病的病原菌確定為蠶豆霜霉（ P ：viciae）。蠶豆霜霉是一種專性寄生菌，因寄主植物是蠶豆，所以本研究分離出來的病原菌應為蠶豆專化型霜霉（Peronosporaviciaef.sp.fabae）。

蠶豆霜霉是一類專性寄生的卵菌，無法進行離體培養，也不易保存，這在一定程度上阻礙了蠶豆霜霉病的研究進程。本研究測定了病原菌的致病性，發現無論是活體還是離體接種蠶豆健康葉片，接種后葉片發病快、重復性好，其中離體葉片接種方法效果最佳，可用于之后抗霜霉病蠶豆品種的篩選及蠶豆抗霜霉病育種。生物學特性的分析有利于了解病原菌的最適生存環境，了解病害的發生特點[27]，從而便于在之后的田間生產中通過控制外界環境來減少霜霉病的發生及流行。本研究發現，蠶豆霜霉在 18^°C 條件下孢子囊萌發率最高，溫度過低或過高都會影響其萌發，南通地區蠶豆霜霉病一般于4月份大量發生，這可能和 18^qC 的最佳萌發溫度相關。蠶豆霜霉在 pH 值為7.17條件下孢子囊萌發率最高，南通地區的土壤一般為堿性土，但肥料的施用會使土壤酸化，這可能也與蠶豆霜霉病的發生相關。可溶性淀粉作為碳源時，蠶豆霜霉的孢子囊萌發率最高，蔗糖作為碳源時，萌發率最低。鑒于上述結果，在實際田間生產過程中，可以通過改善土壤pH值、向土壤中施加蔗糖等措施來防治蠶豆霜霉病。

霜霉病的生防因子包括生防真菌、細菌、放線菌和植物源活性物質等，這些生防因子通過不同的作用方式抑制霜霉病菌的生長發育，從而防止霜霉病的發生和流行[28]。前人研究發現，對霜霉菌有防治效果的生防菌主要有真菌哈茨木霉、層出鐮孢菌、小光殼屬的 Leptosphaerulina australis[29-31]，細菌枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、甲基營養型芽孢桿菌、蒼白桿菌[22-23.32-37]，以及放線菌暗黑鏈霉菌、細黃鏈霉菌等[38-39]。貝萊斯芽孢桿菌屬于一類新型生防細菌，許多貝萊斯芽孢桿菌菌株對植物病害有良好的防治效果，可用于防治灰霉病、白粉病、稻瘟病、炭疽病等[40-43]，本研究分離篩選出的貝萊斯芽孢桿菌對蠶豆根腐病、赤斑病、葉斑病和枯萎病病原菌也均有良好的抑制效果。由于寄主植物和病原菌的不同，利用貝萊斯芽孢桿菌防治霜霉病的研究近兩年只在黃瓜上有報道[23.35]，在其他植物上未見報道，本研究也是首次發現貝萊斯芽孢桿菌對蠶豆霜霉有抑制作用。此外，本研究也檢測了哈茨木霉、綠色木霉、解淀粉芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌等常見霜霉病生防菌對蠶豆霜霉病的防治效果，發現其均不能有效地抑制蠶豆霜霉病的發生，表明不同的寄主植物及不同的病原菌，其有抑制效果的生防菌也明顯不同。

4結論

江蘇南通地區蠶豆霜霉病的病原菌為蠶豆霜霉（野豌豆霜霉）（Peronosporaviciae），其孢囊梗樹形，二叉狀分枝4～8次，孢子囊橢球至短橢球形，淺褐色，末端有凸出的梗。蠶豆霜霉有較強的致病性，其孢子囊最適萌發溫度為 18^°C ，最適萌發pH值為7.17，最適萌發碳源為可溶性淀粉。生防菌篩選獲得1株對蠶豆霜霉防治效果較好的SF11菌株，經測序鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）。

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