關鍵詞：苯丙烯菌酮；煙草花葉病毒；誘導抗病性；轉錄組學分析中圖分類號： S432.4⁺1 ;S435.72 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）13-0147-08

煙草花葉病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）是一種正鏈植物RNA病毒，寄主范圍廣泛，感染多種植物，呈世界性分布，導致植物產量和生產力下降目前對TMV的防治主要依賴于抗病毒藥劑，但有效防控作物病毒病害的藥劑屈指可數，因此尋求環境相容性好、經濟且高效的植保新方法是解決此問題的關鍵。植物免疫誘抗劑因具有免疫誘抗周期長、對環境污染小等優點，且符合農業可持續發展的要求，成為農藥熱門發展領域之—[2] 。

能夠激活植物產生免疫反應的物質被稱為激發子，它們對于提高植物的抗病性具有至關重要的作用。目前已有研究表明，蛋白多肽類、寡糖類、小分子代謝物類，以及水楊酸和茉莉酸及其類似物等多種類型的激發子可有效控制植物病毒病[3]。Zhu等研究表明，美洲商陸抗病毒蛋白（pokeweedantiviralproteins，PAPs）通過激活超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及過氧化物酶（POD）等抗氧化酶來調節煙草中的活性氧代謝，從而增強本氏煙草對TMV感染的系統抵抗力[4]。盧航等研究發現， 50μg/mL 寡聚半乳糖醛酸噴施煙草后，通過激活煙草葉片SOD和CAT的活性，誘導煙草對TMV 產生抗性[5]。Spletzer 等研究發現，對番茄植株進行水楊酸（SA）噴霧處理后，番茄葉片內的SA含量顯著提高，且病程相關蛋白基因 （PR-I） 表達量顯著提高，誘導番茄植株產生系統獲得抗性（SAR）[6]。Jia等研究發現， 50mg/kg 殼寡糖處理擬南芥 24h 后接種TMV，可有效降低擬南芥體內TMV外殼蛋白的含量，通過激活SA信號通路，使抗性標記基因 PR-I 表達量上調，誘導擬南芥對TMV產生抗病性[7]。 β- 氨基丁酸（ β - aminobutyricacid，BABA）通過提高煙草體內的SA和 H₂O₂ 含量及PR蛋白基因的表達，誘導煙草產生 SAR^[8] 。外源應用茉莉酸甲酯（MeJA）能顯著激活植物體內的防御相關基因表達，進而誘導寄主植物產生抗病性。因此，MeJA已成為果蔬采后病害防治研究領域的重要研究對象[9]。可見，植物免疫誘抗劑已成為防治植物病害的主流方法。

植物源生物農藥苯丙烯菌酮（IBC）是從豆科植物補骨脂種子中提取的抑菌活性成分，主要用于防治水稻稻瘟病、蘋果腐爛病、黃瓜細菌性角斑病等農業生產中常見的植物病害[10-13]。但在實際應用中發現，IBC不僅可以預防和控制植物病原真菌和細菌引起的疾病，還可以在田間預防和控制煙草花葉病毒病害，但作用機制尚不明確[14]。為此，本研究通過考查經IBC處理的煙草在TMV接種后葉片內防御酶活性的變化及轉錄組學分析，探究IBC誘導煙草產生抗病性的機制，為新型植物免疫誘抗劑的開發提供理論依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：以普通煙NC89（Nicotianatabacumvar.NC89）為試驗材料，其種子由沈陽農業大學植物保護學院饋贈。供試病毒：TMV由沈陽農業大學植物保護學院植物病毒室饋贈， -80^°C 冰箱保存。主要試劑：苯丙烯菌酮（四川省維克奇生物科技有限公司） 2% 氨基寡糖素水劑（大連凱飛化學股份有限公司）植物RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]、HiScriptIIQRT試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、引物（北京六合華大基因有限公司）。

1.2植物試材培養

煙草種子經溫湯浸種，播種于育苗盆內。在光照強度為 70～100μmol（m²/s） 、溫度 23～26^°C 光照 16h/d 、濕度 50%～60% 的培養箱中進行培養。1.3IBC對煙草抗病相關防御酶活性的影響待煙苗長至8葉期時，選取長勢一致的煙苗分為4組，空白對照（CK）接種對照（ CK+TMV ） .2% 氨基寡糖素水劑 40mg/L （ An+TMV ） .IBC40mg/L （ IBC+TMV ，將IBC以重量比 1： 1 溶于二甲基亞砜（DMSO）中，加入 1% Tween80，用蒸餾水稀釋成有效成分 40mg/L ）。空白對照組和接種對照組用等量的模擬溶液（蒸餾水中加人等量的DMSO和Tween80）處理。每隔5d施藥1次，在第3次施藥24h 后接種TMV（ 10mg/L ），分別于接種后0、1、3、5、7、9d 取各處理煙株相同部位的葉片，迅速放入液氮中冷凍，置于- 80^°C 冰箱中保存，用于防御酶活性的測定和RNA的提取。

取 新鮮煙草葉片于預冷的研缽中搗碎，按1：5 （重量體積比）加入 50mmol/L 磷酸緩沖液[pH值7.2，含有 1. 0mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）和 2% 的聚乙烯吡咯烷酮]冰浴研磨至勻漿。于 4‰ 下 10 000r/min 離心 10min ，上清液分裝至離心管中作為粗酶液。POD活性測定參照Altunkaya等的方法[15]并有所改進，在 470nm 下測定 3min 內吸光度變化，每分鐘變化0.01為1個酶活性單位 。PPO活性測定參照Aydemir等的方法[并有所改進，在 420nm 下測定5min 內吸光度變化，每分鐘變化0.01為1個酶活性單位 ）。PAL活性測定參照Kovacik等的方法[17]并有所改進，在 290nm 處測量吸光度，每小時變化0.01為1個酶活性單位 。SOD 活性測定參照Diaz等的方法[18并有所改進，在 560nm 處監測SOD活性，以抑制NBT光化還原的 50% 為一個酶活性單位（ U/g 。

1.4轉錄組學文庫的構建和測序

采用PlantTotalRNAExtractionKit提取CK、CK+TMV 與 IBC+TMV 3 組樣品的總RNA。后續質檢、文庫的構建、測序數據的質量控制及生物學信息等分析委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行。使用fastp軟件對原始數據進行過濾，從而得到高質量的測序數據（cleandata）以保證后續分析的順利進行，并計算Q20、Q30和GC含量等質量指標[19]。利用 DESeq2 軟件以 P 值校正 lt;0. 05 或|log₂FC|gt;=1 為篩選條件獲得比較組間差異表達基因（DEGs），將其對比至GO數據庫（GeneOntology，http：//www.geneontology.org/）和 KEGG數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http ：//www. genome. jp/kegg/）[20]

1.5實時熒光定量PCR檢測IBC對煙草抗病相關基因表達的影響

選擇7個差異表達基因進行定量反轉錄PCR中 RT-qPCR ）驗證，以Actin為內參基因，采用相對定量 方法計算相對基因表達量[2]。NCBI（http：//www.ncbi.nlm/nih/gov）設計基因特異性引物，所設計的引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，使用HiScript IIQRT 試劑盒對每個樣品中約 1μg 的總RNA進行逆轉錄。RT-qPCR擴增條件為： 95^°C 預變性 5min;95°C 變性 10s，60^°C 變性 30s ，進行40個循環。引物序列見表1。

表1RT-qPCR驗證所用引物

1.6 統計學分析

熒光定量數據采用 法進行分析，并使用GraphPadPrism8.0繪圖及進行差異顯著性分析。根據GO和KEGG數據庫對DEGs進行功能分析（ Plt;0.05 作為判定DEGs顯著富集的閾值）。

2 結果與分析

2.1IBC誘導煙草抗病防御酶活性

由圖1-A可知，施藥3次后IBC處理組與接種對照組相比，POD活性增高，為 750.5U/（g?min） 但無顯著性差異。接種TMV1d后，POD活性迅速上升，為 1179.5U/（g?min） ，極顯著高于接種對照組（ CK+TMV） ，隨后POD活性逐漸下降，9d又繼續上升，此時POD活性為 1411.5U/（g?min） ，顯著高于接種對照組。由圖1－B可知，與接種對照組相比，IBC處理后的PPO活性顯著上升，為232.92U/（g?min） 。接種TMV后，IBC處理后的PPO活性呈先下降后上升再下降的趨勢，在7d達到峰值，此時PPO活性為 281.58U/（g?min） ，極顯著高于接種對照組，隨后酶活性下降。由圖1-C可知，與接種對照組相比，IBC處理后的PAL活性極顯著上升，為 。接種TMV后，IBC處理后的PAL活性明顯上升，分別在5d和7d達到峰值，此時PAL活性分別為 957.98.965.78U/（g?h） ，極顯著高于接種對照組，隨后酶活性下降。由圖1-D可知，與接種對照相比，IBC處理后的SOD活性迅速上升，為 152.81U/g ，但無顯著性差異。在接種TMV后，IBC處理后的SOD活性在7d達到峰值，此時SOD活性為 289.30U/g ，極顯著高于接種對照組，隨后酶活性下降

*表示 P?0.05 ， ^** 表示 P?0.01 ， *** 表示 P?0.001 ，ns表示 Pgt;0.05 圖5同

圖1IBC處理后煙草葉片內的防御酶活性變化

2.2轉錄組數據質量分析

以 CK、CK + TMV、IBC + TMV3組樣本的RNA為模板，每個樣本進行3次生物學重復，構建cDNA文庫。采用IlluminaHiSeq測序儀測序，原始測序數據過濾后獲得高質量數據。所有樣品的Q20、Q30和GC含量見表2。

表2各樣本的數據質量評估結果

2.3差異表達基因的篩選

用DESeq2軟件以 P 值校正 lt;0.05 amp; |log₂FC|≥1 為篩選條件獲得比較組間差異表達基因，由圖2可知，與 CK+TMV 組相比， IBC+TMV 組共有637個差異表達基因，其中上調基因348個，下調基因289個。

圖2不同處理之間差異基因火山圖

2.4差異表達基因的GO功能富集分析

由圖3可知，差異表達基因被涉及在分子功能（MF）、生物過程（BP）及細胞組分（CC）3個一級分類過程。大多數MF基因參與激酶活性（66個基因）、乙醇基作為受體的磷酸轉移酶（55個基因）、蛋白激酶活性（52個基因）、轉錄調控因子活性（39個基因）。屬于BP的基因主要參與谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程（10個基因）、谷氨酰胺代謝過程（8個基因）、細胞饑餓反應（7個基因）過渡金屬離子穩態（6個基因）。屬于CC的基因主要在液泡（12個基因）。

2.5 DEGs的KEGG富集通路分析

差異表達基因富集的前20條通路顯示在圖4中，其主要富集在植物激素信號轉導（23個基因）、植物MAPK信號（14個基因）等通路。可見，IBC主要通過MAPK、植物激素信號轉導途徑有效地誘導了植物的抗病性。

2.6參與植物激素信號轉導通路的差異表達基因

由表3可知，在SA路徑中， CK+TMV 與 IBC+ TMV組編碼下游病程相關蛋白PR-1的4個基因的表達量顯著上調，其FC值分別為 18.209.9.809 15.199和13.929；在茉莉酸（JA）路徑中， CK+TMV 與 IBC+TMV 組對茉莉酸信號通路起正調控作用的茉莉酸酰胺合成酶的編碼基因JARI（LOC10780652）的表達量顯著上調，FC值為3.067。而負調控茉莉酸ZIM結構域蛋白JAZ的2個基因TIFY10A-like（LOC107801671）、TIFY10B-like（LOC107767880）表達量均顯著下調，其FC值分別為 0.465、0.463 ；在脫落酸（ABA）路徑中， CK+TMV 與 IBC+TMV 組對脫落酸信號通路起正調控作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2C的編碼基因SnRK2（LOC107817951）以及編碼ABA反應元件結合因子ABF（L0C107773674）均顯著上調，FC值分別為5.7314.178。同時，編碼脫落酸受體PYR/PYL蛋白家族的基因PYL（LOC107759771）表達量顯著下調，FC值為0.255×10-3

2.7參與MAPK信號通路的差異表達基因由表4可知，在MAPK信號通路中， CK+TMV 與 IBC+TMV 組LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體FLS2（LOC107771937）的表達量顯著上調，FC 值為5.616。下游病程相關蛋白 PR-I 的4個基因PR- 1B（LOC107807832）、PR- 1B樣（LOC107807833） 、PR-IC （LOC107763263）和 PR- IC 樣（LOC107808770）表達量均顯著上調，其FC值分別為18.209、9.809、15.199和13.929。

圖3不同處理組間差異表達基因GO富集分析

圖4不同處理組間差異基因KEGG富集

2.8 RT-qPCR分析驗證RNA-Seq數據

為驗證轉錄組學數據，選擇7個與植物激素信號轉導、MAPK信號轉導途徑相關的DEGs進行RT-qPCR分析（圖5），與接種對照組相比， PR-I 病程相關基因非表達子（NPRI）ABF、SnRK2、JAR1、FLS2的表達量均極顯著上調，負調控因子 JAZ 表達量顯著下調，這與之前的轉錄組學結果一致。

3討論與結論

植物誘導系統性抗性（inducedsystemicresistance，ISR）通過誘導植物抗病性相關的防御性酶活性變化來增強植物抵抗病害壓力的能力。POD、PPO、PAL和SOD是具有代表性的抗性相關酶，參與宿主對各種脅迫的抗性[22]。Ma等研究發現，蛋白類激發子BcGs1通過提高PAL和POD活性，促進木質素的積累，提高蕃茄對灰霉病的抗性[23];BTH是水楊酸結構類似物，研究發現經BTH處理后辣椒葉片POD、PPO、PAL活性顯著增加，誘導辣椒對白粉病產生抗性[24];PevD1通過與 Nbnrpl蛋白互作，引起煙草體內PPO、PAL等酶活性增強，植物產生抗病性[25]。在本研究中，與空白對照和接種對照組相比，IBC處理可提高煙草葉片內POD、PPO、PAL和SOD的活性，誘導煙草對TMV產生抗性。

表3植物激素信號轉導通路中的差異表達基因統計

表4植物激素信號轉導通路中的差異表達基因統計

當植物面臨逆境脅迫時，為響應外部環境的變化，其細胞內的部分基因在轉錄水平發生變動。通過轉錄組測序，可以在RNA水平上進一步對植物抗病機制進行深入研究。在植物與病原體的互作過程中，MAPK信號通路被激活，通過MAPKKK-MAPKK-MAPK的逐級磷酸化級聯反應，觸發抗病相關基因的表達，進而參與并調控植物對病原侵染的防御信號傳遞過程[26]。Asai等在擬南芥中發現，FLS2可以在鞭毛蛋白 flg22 的感知下與BAK1結合，刺激MAPK級聯途徑，進而磷酸化下游轉錄因子AtWRKY22、AtWRKY29，賦予了對細菌和真菌病原體的抗性[27]。此外，郭依等研究表明，FLS2 基因在煙草BY-2細胞內的高水平表達可以使細胞產生早期防衛反應[28]。在本研究中，IBC處理使煙草葉片FLS2的表達量顯著上調，刺激MAPK級聯途徑，通過磷酸化和去磷酸化反應來放大MAPK級聯信號，進而引起下游病程相關蛋白PR-1表達量顯著上調，從而提高植物系統抗病性。

NPRI是SA信號路徑中的關鍵調節因子，它參與了SAR的建立過程，并在植物抵御病原菌侵染中發揮著不可或缺的重要作用[29]。Thakkar等研究發現，植株在受到病原物侵染時，能夠迅速誘導NPRI的表達。例如，在馬鈴薯葉片上接種馬鈴薯晚疫病病菌后， ^2h 之內便能檢測到NPR1蛋白的表達[30]。Kumar等研究發現，核內單體化的NPR1作為輔因子與TGATFs結合，誘導擬南芥病程相關基因的表達[31]。在本研究中，與接種對照組相比，IBC 處理組水楊酸路徑下游病程相關蛋白PR-1表達量顯著上調，且RT-qPCR結果顯示，IBC處理后的煙草體內 PR、NPRI 的表達量分別在接種TMV后1、3d顯著提高。可見IBC通過介導SA信號路徑，誘導煙草對TMV產生抗病性。

圖5基于RT-qPCR檢測PR-1、NPR1、ABF、SnRK2、JAR1、FLS2、JAZ的相對表達量

當植物遭遇脅迫時，茉莉酸作為信號分子會啟動其介導的信號途徑，進而激活茉莉酸應答基因的表達。李娜等研究發現，冠菌素通過激活番茄體內JA途徑相關基因，如 _LoxF，LoxD 和 AOS 等基因均上調表達，誘導番茄對青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的青枯病產生抗病性[32]。在本研究中，與接種對照組相比，IBC處理組煙草葉片JARI的表達量顯著上調，促進茉莉酸酰胺合成酶（JA-Ile）的合成。隨后， JA-Ile 與COIl結合，共同參與負調控因子 JAZ 的降解過程。JARI的上調不僅導致 JAZ 的降解，還使得 JAZ 本身的表達量下降，進而導致下游轉錄因子MYC2的釋放，從而啟動應答反應。

作為ABF轉錄因子的直接上游激酶，SnRK2通過磷酸化作用激活ABF轉錄因子的活性，從而發揮其關鍵的調節作用[33-35]。Yoshida 等發現，擬南芥中的AREB1/ABF2、AREB2/ABF4和ABF3蛋白，分別受到激酶SnRK2.2、SnRK2.6和SnRK2.3的磷酸化作用而得以激活，共同參與調控ABA信號路徑，從而在植物體內發揮重要的調控作用[36]。在本研究中，IBC處理使煙草葉片SnRK2表達量顯著上調，其磷酸化后直接使其下游轉錄因子ABF表達量顯著上調，最終激活ABA信號應答反應。同時，ABA受體 PYLA-like 表達量下降，可能是由ABA應答反應對此信號轉導路徑的反饋調節引起。

綜上所述，IBC通過激活煙草葉片防御相關酶活性，增強煙草對TMV感染的抗性。同時，激活MAPK信號通路，調控SA Ω，JA 、ABA植物激素信號網絡協調免疫應答反應來誘導煙草對TMV產生抗病性。本研究旨在揭示IBC如何介導煙草-TMV互作的抗性反應，為進一步研究IBC在農業生產中的應用提供理論依據。

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［３５］ＦｕｒｉｈａｔａＴ，ＭａｒｕｙａｍａＫ，ＦｕｊｉｔａＹ，ｅｔａｌ．Ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｕｌｔｉｓｉｔｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒＡＲＥＢ１［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００６，１０３（６）：１９８８－ １９９３．

［３６］ＹｏｓｈｉｄａＲ，ＨｏｂｏＴ，ＩｃｈｉｍｕｒａＫ，ｅｔａｌ．ＡＢＡ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｎＲＫ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ＆ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００２，４３（１２）：１４７３－ １４８３．