威海地區(qū)西洋參根腐病病原菌鑒定及生防木霉篩選

中圖分類(lèi)號(hào)：P41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-4026（2025）04-0067-11

Abstract：Inorder toexploreefectivebiologicalcontrolresourcesforthecultivationofAmericanginseng，idenificationof pathogenspeciesand screeningof highlyeffective biocontrolTrichodermawere carredoutfor theroot rotof American ginseng in Weihai. Through tissue isolation，morphological analysis，and dual-gene （ITS/TEF1- ?∝ ）phylogenetic analysis， the pathogens responsibleforroot rot were isolatedand identified.The pathogenicitywasconfirmedusing Koch's postulates，andtheabundance of keypathogens inthe rhizospheresoilsof diseasedand healthy plants wasanalyzed throughquantiativepolymerasechain reaction（qPCR）.Finaly，biocontrol Trichoderma strains werescreened through plateantagonismassaysandpot experiments.Theresults showedthat125fungal strains wereisolatedfromtherottenrots of American ginseng，with Fusarium being the dominant genus，accounting for 70.91% .Four pathogenic strains were identified ： F. solani （XYS-1）， F. oxysporum（XYS-2）， F. proliferatum（XYS-33），and Alternaria alternata （XYS-44）. qPCR analysis revealed that the abundance of F solani， F ，oxysporum，and A. alternata in the rhizosphere soils of diseased plants was 42.35% ， 13.80% ，and 33.44% higher，respectively，than healthy plants.Three Trichoderma strains showed significant inhibitory effects against these pathogens.Specifically，strain HB20111 inhibited F solani by 66.94% ，strain KZ23651 inhibited F. oxysporum by 76.00% ，and strain QT20747 inhibited A. alternata by 65.20% .Greenhouse pot experimentsshowedthatTrichodermainoculation increasedplant height，rootfreshweight，chlorophyllcontentinthe leaf， and rootactivityof American ginseng whilereducingtheincidenceof root rot.Inthis study，weidentified the pathogens causingtherot rot of Americanginseng in Weihaiand screenedbiocontrol Trichoderma strains，which provideda foundation for sustainable control of the root rot of American ginseng in this region.

Key words ： American ginseng； root rot；pathogen identification；pathogen abundance；Trichoderma；biocontrol

西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根，是一種價(jià)值極高的藥用植物[1]。近年來(lái)，隨著西洋參市場(chǎng)需求的持續(xù)增長(zhǎng)，其種植面積也隨之增加，但西洋參需要3～4年的生長(zhǎng)史，這種栽培方式使其極易受到各種土傳病害的影響。危害西洋參主要的土傳病害是根腐病[23」，該病害會(huì)使西洋參葉片褪綠變黃并逐漸萎蔫，使其根部糟朽、內(nèi)部中空，對(duì)西洋參的種植造成嚴(yán)重?fù)p失，甚至絕產(chǎn)[4-5]。因此，急需開(kāi)展對(duì)西洋參病原菌的分離和鑒定。

關(guān)于引起西洋參根腐病的病原真菌，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道主要有鐮孢屬Fusarium，如腐皮鐮孢F.solani[6]、尖孢鐮孢 F. ，oxysporum[」以及柱孢屬Cylindrocarpon 的毀滅柱孢C.destructans[8」。不同地區(qū)西洋參根腐病的癥狀類(lèi)似，但主要的病原菌存在著顯著的差異。畢武等9從西洋參中分離出了4種病原菌，其中腐皮鐮孢 F .solani和尖孢鐮孢 F .oxysporum是引起北京地區(qū)栽培西洋參根腐病的主要病原菌。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，通常采用噴施化學(xué)藥劑等方法來(lái)緩解植物根腐病，但易引起土壤環(huán)境污染、食品藥物殘留等問(wèn)題，故急需尋找綠色、無(wú)污染的生物防治方法[10]。生物防治是利用生防菌及其代謝產(chǎn)物來(lái)調(diào)節(jié)土壤微生物從而控制土傳病害發(fā)生的綠色手段]，常見(jiàn)的生防菌包括木霉（Trichoderma）類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）、芽孢桿菌（Bacillus）等[12-13]。張子恒[14]研究發(fā)現(xiàn)生防菌JA38（Burkholderiacepacia）對(duì)人參根部7種主要的真菌病害都具有良好的拮抗效果。陳國(guó)忠等[15]篩選出的多粘類(lèi)芽孢桿菌（P.polymyxa）DN67，發(fā)酵液處理組與對(duì)照相比顯著控制了西洋參根腐病的發(fā)生。牛兆穎等[16]制備的巨大芽孢桿菌（B.megaterium）Yt2001 生防菌劑對(duì)西洋參根腐病的防治效果達(dá)到了 80% 以上。張悅麗等[17]發(fā)現(xiàn)施加哈茨木霉（T.harzianum）生物菌肥可以大大降低西洋參根腐病的發(fā)病率。以上研究表明，利用生防菌對(duì)西洋參根腐病進(jìn)行生物防治，可為西洋參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有效途徑。

山東省威海市是我國(guó)西洋參的主要產(chǎn)區(qū)之一[18]。近年來(lái)該地區(qū)根腐病嚴(yán)重影響了西洋參的產(chǎn)量[19]，但有關(guān)根腐病病原菌的研究較少。為明確導(dǎo)致威海西洋參根腐病發(fā)生的主要病原菌，該研究采用組織分離的方法對(duì)該地西洋參根腐病病原菌進(jìn)行分離，運(yùn)用形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，明確病原菌的分類(lèi)地位，科學(xué)認(rèn)識(shí)該地區(qū)西洋參病害的病原特性，同時(shí)篩選具有防治潛力的木霉菌株，以期為西洋參根腐病的防控提供生防材料。

1儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

奧林巴斯生物顯微鏡（Olympus Corporation，CX-31），超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆，YT-1300），生化培養(yǎng)箱

（上海新苗器械，SPX-250B-Z），熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad CFX96TM Optics Module），電泳儀（BIO-RADLaboratories），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，UniveralHood III）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

2× SYBRPremixExTaq（湖南艾科瑞生物工程有限公司）， 2× PowerPolPCRMixwithDye（生工生物工程（上海）股份有限公司），DNeasy PowerSoil土壤DNA 提取試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司），Tris-HCl和 NaOH（均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)），瓊脂糖（上海貝晶生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

供試植物和土壤：2021年8月調(diào)查威海榮成虎山鎮(zhèn)、文登侯家鎮(zhèn)1～3年生西洋參生長(zhǎng)情況，分別選取10 個(gè)種植地，每個(gè)種植地3個(gè)點(diǎn)采樣，每個(gè)點(diǎn)分別選取3株以上發(fā)病株和健康株，小心挖出完整植株，抖掉與根系結(jié)合較松的土壤，用毛刷清理收集與根系緊密結(jié)合的土壤作為根際土壤;分別將植株和根際土壤裝袋保存并記錄，帶回實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 西洋參根腐病病原菌的分離純化

實(shí)驗(yàn)于2022年在山東省科學(xué)院生態(tài)研究所實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，采用組織分離的方法分離和純化病原菌[20]用流動(dòng)清水將帶有典型病斑的西洋參根部沖洗干凈，在病健交界處切取 2mm×2mm 大小的組織塊，用體積分?jǐn)?shù) 75% 的酒精消毒10s后使用無(wú)菌水連續(xù)清洗3次，用無(wú)菌濾紙吸去多余水分后將其放在PDA平板上，置于 25^°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取具有典型菌落邊緣的菌絲移植到新的PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)3～4次純化后獲得純培養(yǎng)分離物，保存于 4°C 備用[21]。

2.2 柯赫氏法則驗(yàn)證

致病性測(cè)定采用活體參根穿刺接種法[9并進(jìn)行改進(jìn)。將待測(cè)菌株在PDA平板上培養(yǎng)7d后，用無(wú)菌水洗下孢子，并將孢子濃度調(diào)整到 1×10⁶CFU/mL 。取3年生健康西洋參完整參根，用體積分?jǐn)?shù) 5% NaClO進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗3次。用無(wú)菌挑針（ d=0.5mm ）在參根上刺10下，輕微刺傷參根，在傷口處分2次滴加 20μL 孢子懸浮液，以無(wú)菌水為對(duì)照。將處理后的參根置于含有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，于 25°C 恒溫保濕培養(yǎng)。每個(gè)菌株接種3個(gè)參根，每個(gè)參根接種3～4個(gè)部位。定期觀察參根發(fā)病情況，分析發(fā)病癥狀是否與根腐病癥狀一致，若一致則根據(jù)2.1病原菌分離的方法再次從發(fā)病組織上進(jìn)行分離，若再次分離的菌株與接種菌株形態(tài)一致，則可以確定接種菌株為致病菌。

2.3 西洋參根腐病病原菌鑒定

（1）病原菌形態(tài)學(xué)鑒定：將致病菌接種于PDA平板， 25°C 活化培養(yǎng)3～5d，觀察菌落特征。收集分生孢子并在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。根據(jù)菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征及產(chǎn)孢表型，參照傳統(tǒng)真菌分類(lèi)方法對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[22-23]。

（2）病原菌分子學(xué)鑒定：采取快速提取法[24]用于PCR 擴(kuò)增的病原菌基因組DNA 提取。將供試菌株接種到PDA平板上，在 25^°C 條件下培養(yǎng)5d，取 1.5mL 的離心管加人 50mmol/L 的NaOH溶液 50μL ，同時(shí)加入少量菌絲，渦旋打散，沸水浴 10min 。加入 5μL1mol/L 的Tris-HCl（ pH=8.0 緩沖液， 12000r/min 離心10min ，上清液即可作為DNA模板。

選取核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS 和翻譯延伸因子 TEF1- σ?α∝ 序列為靶標(biāo)[25-27]，引物序列及反應(yīng)程序詳見(jiàn)表1。擴(kuò)增反應(yīng)的體系為 25μL ，分別包含DNA 模板 1μL，2× PowerPol PCR Mix with Dye 12.5μL ，上、下游引物各 1μL，ddH₂O9.5μL 。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，交由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將獲得的ITS、TEF1- α_?α∝ 序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并運(yùn)用BLAST進(jìn)行同源序列檢索。將ITS、TEF1- α_?α∝ 基因序列串聯(lián)，利用MEGA5.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining tree）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，循環(huán)1000次，并以自展支持率（bootstrap）校對(duì)檢測(cè)，以確定菌株的分類(lèi)地位。

表1PCR擴(kuò)增所用引物和反應(yīng)程序

Table1Primers and reaction procedures for PCR

2.4 西洋參根際土壤病原真菌豐度測(cè)定

采用DNeasyPowerSoil試劑盒從 0.25g 根際土壤中提取總基因組DNA，根據(jù)上述罹患根腐病的西洋參病株病原菌分離情況，運(yùn)用qPCR分別測(cè)定發(fā)病和健康西洋參根際土壤中的3種主要病原菌 F oxysporum、F.solani和A.alternata的豐度。引物序列見(jiàn)表2。 20μL 的 qPCR 擴(kuò)增體系包括 1μL 模板DNA， 10μL SYBR Premix Ex Taq， 和上下游引物各 0.5μL 。擴(kuò)增程序?yàn)? 變性5s， 60^°C 退火 30s ，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)上述建立的方案，使用10倍系列稀釋的插人特定DNA片段質(zhì)粒為模版生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同基因的擴(kuò)增效率在 93.4% 到 108.7% 之間。

表2qPCR擴(kuò)增所用引物

Table 2Primers for qPCR

2.5 生防木霉菌株的篩選及抑菌活性測(cè)定

生防菌抑菌活性的測(cè)定采用平板對(duì)峙法。供試木霉菌株如表3所示，均由山東省科學(xué)院生態(tài)研究所環(huán)境微生物研究室保藏。以上述分離的XYS-1（腐皮鐮孢）、XYS-2（尖孢鐮孢）、XYS-44（交鏈格孢）為指示菌株。在距離PDA培養(yǎng)基平板中心 4cm 的相對(duì)兩點(diǎn)上分別接種木霉菌和病原菌的 5mm 菌餅，以只接種病原菌的PDA平板為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)， 25^°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落半徑，計(jì)算對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率。

表3供試木霉菌株

Table3 Trichoderma strains for test

抑菌率 Σ=Σ [（空白對(duì)照中病原真菌生長(zhǎng)半徑-對(duì)峙培養(yǎng)中病原真菌生長(zhǎng)半徑）/空白對(duì)照中病原真菌生長(zhǎng) 半徑] ×100% 。

2.6 木霉菌對(duì)西洋參生長(zhǎng)的影響

盆栽實(shí)驗(yàn)于2021年11月至2022年6月在山東省科學(xué)院生態(tài)研究所溫室進(jìn)行。所試西洋參種子購(gòu)自威海參農(nóng)，供試木霉分別為 T. atroviride HB20111、T. harzianum KZ23651和 T. longibrachiatum QT20747。共設(shè)置4個(gè)處理，分別為對(duì)照組、T.atroviride HB20111、T.harzianum KZ23651 和 T. longibrachiatum QT20747 處理組，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。盆栽用土取自威海榮成參田，為根腐病害發(fā)生嚴(yán)重的4年連作土，每盆裝土400g 。分別從生長(zhǎng)5～7d的PDA平板上刮取木霉分生孢子，用無(wú)菌生理鹽水充分懸浮，然后用3層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾得孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子懸液濃度為 1.0×10⁷CFU/mL ，每個(gè)盆中分別倒入 40mL 分生孢子懸液，使土壤中木霉菌分生孢子最終濃度達(dá)到 10⁶CFU/g 。將催芽露白的西洋參種子均勻播種在盆中，每盆播15粒種子。待西洋參出芽后，根據(jù)土壤干濕情況，每隔6～7d澆水1次，西洋參生長(zhǎng)6個(gè)月后進(jìn)行植株指標(biāo)的測(cè)定。

（1）生長(zhǎng)指標(biāo)：株高為植株基部到葉叢的高度，使用直尺測(cè)量。將西洋參根部用清水反復(fù)沖洗，用吸水紙吸干后，使用分析天平進(jìn)行稱(chēng)重。（2）生理指標(biāo)：采用丙酮提取法測(cè)定葉綠素含量[31]，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）還原法測(cè)定根系活力[32]。（3）發(fā)病率：依據(jù)Li等[33]的方法進(jìn)行計(jì)算，發(fā)病率 Σ=Σ 病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù) ×100% 。

2.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS25.0和OriginPro2023b對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用SPSS25.0對(duì)不同處理間數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析， Plt;0.05 為差異顯著，利用OriginPro2023b進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 西洋參根腐病癥狀

病害調(diào)查時(shí)間為2021年8月份，此時(shí)威海地區(qū)高溫高濕，恰為西洋參根腐病害高發(fā)季節(jié)。通過(guò)對(duì)種植基地不同年限西洋參調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1年生西洋參罹患根腐病后的表現(xiàn)為翠綠的葉部從尖端開(kāi)始褪色變黃，側(cè)根和須根最先受到危害，根尖部變黃且呈水漬狀，隨著病原菌的入侵，病斑面積逐漸擴(kuò)大，參根開(kāi)始整體腐爛，葉片整體變成棕紅色且極易脫落（圖1a）。2年及以上西洋參患病后，參根病斑呈現(xiàn)深褐色，產(chǎn)生龜裂但不隆起（圖1b），維管束變褐，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)主根由根尖逐漸腐爛到蘆頭，只剩下中空的參皮。

3.2 分離菌株初步鑒定

從患病西洋參病根上共分離純化獲得125株真菌，將測(cè)定的ITS序列在Genbank中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，分離的125株真菌分別屬于鐮孢菌屬Fusarium、鏈格孢菌屬Alternaria等。其中鐮孢菌屬Fusarium分離頻率最高，占分離總菌株數(shù)的 70.91% ，鏈格孢菌屬Alternaria占總分離菌株數(shù)的 7.27% ，其他真菌分離頻率較低（圖2）。

圖1 西洋參根腐病癥狀

圖2從西洋參根腐病根分離的真菌及分離頻率 Fig.2Fungi isolated from the rotten American ginseng and isolation frequency

3.3 分離菌株致病性

根據(jù)ITS 測(cè)序結(jié)果和菌落形態(tài)特征，選擇代表性菌株XYS-1、XYS-2、XYS-33、XYS-44 的分生孢子，針刺接種健康西洋參根，7d后接種部位均呈現(xiàn)褐色斑點(diǎn)并發(fā)生腐爛（圖3），與田間觀察癥狀一致。其中菌株XYS-33的致病能力較弱（圖3d），3個(gè)接種位點(diǎn)上只有2處出現(xiàn)典型根腐癥狀，另一個(gè)接種部位癥狀較輕。隨后，分別從發(fā)病部位重新分離獲得菌株培養(yǎng)后與接種菌株形態(tài)特征一致。

圖3分離菌株在西洋參參根上的致病性檢測(cè)

注：a為空白對(duì)照;b～e分別為XYS-1、XYS-2、XYS-33 和XYS-44在參根上針刺接種7d后的癥狀。

3.4 西洋參根腐病病原菌鑒定

XYS-1在PDA培養(yǎng)基上菌落由氣生菌絲組成，其菌絲呈現(xiàn)白色薄絨狀，中心致密，邊緣較蓬松，菌落背面呈現(xiàn)淺灰色（圖4a1）。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生大小兩種形態(tài)的分生孢子，主要以大孢子為主（圖4a2），大型孢子呈現(xiàn)茄形，兩端較圓鈍，具有3～5個(gè)隔膜。小孢子呈現(xiàn)橢圓形或者腎形，具有1～2個(gè)隔膜。

XYS-2在PDA培養(yǎng)基上菌絲呈現(xiàn)白色絲絨狀，帶有粉紅色的色素。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌絲顏色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉圩仙▓D4b1）。在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)具有鐮刀狀的大孢子和腎形或者橢圓形的小孢子兩種孢子形態(tài)，主要以小孢子為主。小型孢子的隔膜分為無(wú)隔或者1個(gè)隔膜，主要以無(wú)隔為主（圖 4b2）。

XYS-33在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期菌絲呈現(xiàn)白色絮狀，背面也呈現(xiàn)白色。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，逐漸轉(zhuǎn)為粉紅色（圖4c1）。在顯微鏡下觀察孢子有大孢子和小孢子兩種類(lèi)型，大孢子主要呈鐮刀狀且具有隔膜，小孢子呈現(xiàn)卵型或者橢圓形，通常不具有隔膜或者有的包含1個(gè)隔膜（圖4c2）。

XYS-44接種于PDA平板上在 25^°C 下進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)初期菌絲為白色，較綿密。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，菌絲逐漸由白色轉(zhuǎn)為灰色或者灰綠色，且背面產(chǎn)生黑棕色色素（圖4d1）。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其分生孢子呈現(xiàn)倒棒狀、梨形或者紡錘形，呈現(xiàn)淺棕色，具有1～7個(gè)橫隔，0～3個(gè)縱隔膜，且具有喙或者偽喙（圖 4d2）。

圖4分離病原菌的形態(tài)特征

Fig.4Morphological characteristics of pathogens

注： a1，b1，c1，d1 分別為菌落在PDA上的形態(tài)（左為菌落正面，右為反面）; a2，b2，c2，d2 分別為分生孢子形態(tài)。

3.5 西洋參根腐病病原菌多基因序列分析

分別以ITS1/ITS4和EF-1H/EF-2T為引物對(duì)病原菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到527bp 和 700bp 的序列片段（圖5），提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，ITS1/ITS4引物擴(kuò)增序列獲得的登錄號(hào)分別為PQ222401（XYS-1）、PQ222402（XYS-2）、PQ222404（XYS-33）、PQ222403（XYS-44）;EF-1H/EF-2T引物擴(kuò)增序列獲得的登錄號(hào)分別為 PQ240640（XYS-1）、PQ240641（XYS-2）、PQ240643（XYS-33）、PQ240642（XYS-44）。將獲得的序列進(jìn)行串聯(lián)，利用MEGA5.0軟件采用鄰接法（neighbor-joiningtree）進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明：XYS-1與GenBank中的F.solani的遺傳距離最近，位于發(fā)育樹(shù)的同一支，菌株形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)一步證明了XYS-1為腐皮鐮孢 F ：solani（見(jiàn)OSID開(kāi)放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1）。同理，XYS-2和XYS-33分別與F. oxysporum ?^F ：proliferatum的遺傳距離最近，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征確定兩株菌株分別是尖孢鐮孢 F . oxysporum和層出鐮孢 F ：proliferatum。菌株XYS-44與GenBank 中的A.alternata的遺傳距離較近，結(jié)合分子形態(tài)特征，將其鑒定為交鏈格孢A.alternata。

圖5基于ITS/TEF1 σ?α?α 序列擴(kuò)增的電泳圖

3.6 發(fā)病與健康西洋參根際土壤病原菌豐度差異

根據(jù)上述研究結(jié)果，由于層出鐮孢 F ：proliferatum分離頻率較低且致病能力弱，故僅選取腐皮鐮孢F.solani、尖孢鐮孢 F_? ，oxysporum、交鏈格孢A.alternata3株病原真菌測(cè)定其豐度。結(jié)果如圖6所示，每克健康西洋參根際土中腐皮鐮孢、尖孢鐮孢、交鏈格孢的拷貝數(shù)分別處于 10²～10⁴ 之間，而罹患根腐病的土壤中3種病原菌的拷貝數(shù)分別處于 10³～10⁵ 之間，患病根際土中3種病原菌的豐度均顯著高于健康植株（ Plt;0.05） 。無(wú)論是患病還是健康西洋參根際土，尖孢鐮孢的豐度在3種病原菌中最高，其次是腐皮鐮孢和交鏈格孢。與健康植株相比，患病西洋參根際土壤中的腐皮鐮孢、尖孢鐮孢和交鏈格孢的豐度分別增加 42.35% ） 13.80% 和（204號(hào) 33.44% 。

圖6健康和患病西洋參根際土中3種病原真菌的豐度

Fig.6Abundance of three pathogens in the rhizosphere soil of healthy and diseased gensing root

3.7 生防木霉菌的抑菌效果

選用實(shí)驗(yàn)室前期篩選的8株拮抗效果較好的木霉菌株，對(duì) F. ， solani XYS-1 ?^F . oxysporum XYS-2、A. alternata

XYS-44病原菌進(jìn)行對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。8株木霉菌對(duì)3種病原菌的抑菌率均在 50%～80% ，且對(duì)尖孢鐮孢的抑制效果最好，除LK20397外其余7株的抑制率均在 70% 以上。 T. ，atroviride HB20111 對(duì) F solaniXYS-1的抑制效果最好，抑制率為 66.94% T. atroviride HB20111、T. longibrachiatum QT20747 和 T. harzianumKZ23651對(duì)F.oxysporumXYS-2的抑制效果較好，抑制率分別為 75.33%.75.33% 和 76.00% ，三者之間抑制效果差異不顯著;T.longibrachiatum QT20747 對(duì)A.alternata XYS-44 的抑制率最高，為 62.50% 。LK20397對(duì)3株病原菌的抑制效果均較差。

圖7木霉對(duì)根腐病病原菌對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果（6d）

Fig.7 Results（for 6 days） of confrontation culture between Trichoderma and pathogens of root rot

3.8木霉對(duì)西洋參生長(zhǎng)和根腐病發(fā)病率的影響

盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組中4年連作土嚴(yán)重影響了西洋參根系形態(tài)，使側(cè)根數(shù)顯著減少，參根縱向伸長(zhǎng)受到抑制，部分呈現(xiàn)球狀等畸形;接種T.atroviride HB20111和T.longibrachiatum QT20747的西洋參主根粗壯，須根較多;T.harzianum KZ23651處理組西洋參部分須根變褐。對(duì)照組中西洋參根腐病的發(fā)病率為 77.78% ，接種木霉能顯著降低西洋參根腐病發(fā)病率， T. atroviride HB20111、T. harzianum KZ23651 和 T. longibrachiatumQT20747處理組中西洋參發(fā)病率分別為 27.79% （204 ，38.89% 和 33.33% （見(jiàn)OSID開(kāi)放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2）。

接種 T. atroviride HB20111、T. harzianum KZ23651 和 T. longibrachiatum QT20747均顯著提高了西洋參植株的高度，與對(duì)照組相比，株高分別增加了 29.25% 、 5.66% 和 19.78% （圖8a）。 T. atroviride HB20111和T.harzianum KZ23651處理組對(duì)西洋參根鮮重的促進(jìn)效果最顯著，其根鮮重分別為 0.26g.0.28g ，比對(duì)照分別增加 34.18% 和 41.03% （圖8b）。3株木霉均可顯著提高西洋參根系活力，其中 T. atroviride HB20111處理組根系活力增加最多，與對(duì)照相比增加了 85.83% （圖8c）。 T_δ ，atroviride HB20111 和 T longibrachiatumQT20747處理組顯著增加了葉片葉綠素含量，其單位面積葉綠素含量分別比對(duì)照組增加了 22.51% 和 22.75% （圖8d）。

圖8木霉對(duì)西洋參生長(zhǎng)發(fā)育的影響

Fig.8Effects of Trichoderma on the growth of American ginseng

4 討論與結(jié)論

根腐病是西洋參栽培過(guò)程中的一類(lèi)重大土傳病害，主要發(fā)生在西洋參根部，危害嚴(yán)重，導(dǎo)致西洋參的產(chǎn)量和質(zhì)量受到威脅[34」。該研究采用組織分離法，從山東威海西洋參種植基地取樣，通過(guò)分離、純化從感病植株中分離了125株真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)甄別和分子生物學(xué)鑒定大部分屬于鐮孢菌屬Fusarium（占總分離菌株的70.91% ），其中包含尖孢鐮孢 F ，oxysporum（占總分離菌株的 38.18% ），腐皮鐮孢 F ，solani（占總分離菌株的29.09% ）和層出鐮孢 F ：proliferatum（占總分離菌株的 1.81% ），同時(shí)還分離到鏈格孢屬Alternaria的交鏈格孢A.alternata（占總分離菌株的 7.27% ）。

依據(jù)柯赫氏法則，將分離得到的菌株進(jìn)行回接做致病性測(cè)定，其中尖孢鐮孢 F ：oxysporum、腐皮鐮孢F.solani、交鏈格孢A.alternata均獲得與田間相似的發(fā)病癥狀，層出鐮孢 F ：proliferatum分離頻率低，致病能力較弱，因此確認(rèn)尖孢鐮孢 F. ：oxysporum、腐皮鐮孢 F_? ：solani、交鏈格孢A.alternata為引起威海地區(qū)西洋參根腐病的主要病原菌。

根據(jù)研究報(bào)道，引起西洋參等人參屬植株根腐病的病原菌主要集中在尖孢鐮孢F.oxysporum、腐皮鐮孢F_? ，solani 等鐮孢菌屬[35-37]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于鏈格孢菌屬 Alternaria 侵染西洋參的研究較少，主要集中于三七[38-39]、太子參[40]等其他植株上。本文首次在罹患根腐病的西洋參病根上分離出交鏈格孢A.altermata，并驗(yàn)證其為該地區(qū)西洋參根腐病病原菌之一。通過(guò)qPCR 的方法分別檢測(cè)健康和發(fā)病西洋參根際土壤中的腐皮鐮孢F.solani 尖孢鐮孢 F. .oxysporum和交鏈格孢A.alternata的豐度，發(fā)病西洋參根際土壤中的3種病原菌的豐度比健康根際土壤分別高 42.35% ） 13.80% 和 33.44% 。

篩選拮抗菌是生物防治的基礎(chǔ)性工作之一，木霉作為一種拮抗真菌，可以通過(guò)寄生、分泌抗生素、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生存空間以及提高植物的抗逆能力來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制作用，目前木霉菌在生物防治方面有著廣泛的應(yīng)用[41-42]。該研究中平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木霉菌對(duì)3株西洋參根腐病病原菌的抑菌率均在50% 以上，且對(duì)尖孢鐮孢的抑菌效果最好。盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T.atroviride HB20111、T.longibrachiatumQT20747和 T.harzianum KZ23651 均能顯著促進(jìn)西洋參的株高和根系活力，T.atrouiride HB20111 和T.longibrachiatum QT20747顯著增加了西洋參的根鮮重，T.atroviride HB20111 和T. harzianum KZ23651 處理組中西洋參葉片葉綠素的含量增加，且木霉處理西洋參根腐病的發(fā)病率與對(duì)照相比均顯著降低。以上研究結(jié)果表明，木霉菌對(duì)3株病原菌具有較好的抑制效果，且可以促進(jìn)西洋參的生長(zhǎng)發(fā)育，減少根腐病的發(fā)生。

本文采用形態(tài)學(xué)鑒定和現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)山東威海西洋參根腐病的病原菌進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定和分析，結(jié)果表明：山東省威海地區(qū)罹患根腐病西洋參參根上分離出的病原微生物主要是腐皮鐮孢F.solani、尖孢鐮孢 F. ，oxysporum和交鏈格孢A.alternata，同時(shí)證明了木霉菌對(duì)3株病原菌具有較好的抑制作用，為根腐病的生物防治提供了優(yōu)良的生防菌株。威海地區(qū)西洋參生長(zhǎng)環(huán)境復(fù)雜，隨種植年限增加，罹患根腐病的幾率增加。所以，闡明西洋參根腐病病原菌的組成，篩選出高效生防菌株，通過(guò)綠色防控降低根際病原菌豐度，對(duì)減少根腐病造成的經(jīng)濟(jì)損失，保障西洋參產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

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