香菇9608脫除LeV-HKB病毒后對子實體性狀的影響分析

中圖分類號：S646.1 文獻標志碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006—6500.2025.07.004

fectofLeV-HKBRemovalonFruitingBodyTraitsofShiitakeMushroom9608

LI Mengchun1， YUAN Chaozheng'， MA Yu¹ ， YANG Yuhua'， ZHANG Zhifeng2， BAI Mingfeng3 （1.NanyangAcademyofSiences，Nanyang，Henan473O3，Chia;2.yngNoalUniversityaang，Henan473in; 3. Xixia EdibleFungi Research Center，Xixia County，Xixia，Henan 47455o， China）

Abstract：Toinvestigatetheefectof mushroomvirusLev-HKBonthedevelopmentofmushroomfruitingbodies.Inthisstudythe mainvarietyofshitake mushrooms inNanyang，96O8wasusedasthetestmaterial.Ribavirindrugdetoxificationcombined with mycelialtipdetoxificationtechnologywasusedtoobtainshitakemushroomstrainsthatwerefreeofLeVHKBvirus.Bysystematialy comparingandanalyingthemorpholgyyield，andothertraitsofthefruitingbodiesofdetoxifiedstrainsandvirus-fectedcotol strains，andusingmulti-layerperceptronandnearestneighbormethodtoanalyzethemainepigenetictraitsthatafecttraitidicators. Theresultsshowedthatthedetoxifedshitake mushrooms exhibitedsignificantincreasesinallproductiontraits.Theaverageyieldofa single mushroom increased by56.65 % ，thediameterofthefruitingbodycapsignificantlyincreasedby19.89 % ，thelength of the stem increased by 6.94% ，and the morphology became more complete.The length of the fungal stem was significantly correlated with detoxification，wilicatsereglyoelaedittoationouhiteactiveoelaonaalys，iasfoudat detoxificationhadasignificantpositivecorelationwiththeweightofindividualshitakemushroomsandasignfcantpositivecorelationwithyieldinrease.Multilayerperceptronandarestneigbornalysishoedatcapameter，capickness，andelength werthemainepigenetictraitsthatafectedothertraitindicators.Inconclusion，researchhasconfirmedthatthepresenceofLeV HKBcaninhibitthenoraldevelopmentofthefruitingbodyof96O8shitakemushrooms.Removingtheviruscanefectivelyimprove thefruitingbodytraits，providingtheoreticalbasisandtechnicalreferenceforhigh-qualityandhigh-yieldcultivationofhtake mushrooms and virus prevention and control.

Keywords：shiitakemushrooms;LeV-HKB;subentity;trait

香菇9608品種由河南省西峽縣食用菌科研中心于1996年選育而成，在河南省南陽地區主栽近30年，為低溫長菌齡品種，于2008年獲得國家認定。香菇9608作為我國廣泛栽培的重要品種之一，具有諸多優良特性。已有研究表明，在正常生長條件下，該菌株在較強光照環境中，其子實體呈現柄短肉厚的特征，菇質優良且易形成花菇，同時菌絲具備較強抗逆性[l。然而，LeV-HKB病毒的侵染給香菇9608的生長帶來了嚴峻挑戰。目前，已知LeV-HKB病毒屬于雙鏈RNA病毒，廣泛存在于香菇栽培區域，遭受侵染后會干擾香菇的正常生理代謝過程。對于該病毒在香菇9608細胞內的具體侵染途徑、病毒蛋白與香菇自身蛋白的互作機制等方面有待深入開展研究。當前，在真菌病毒脫除技術領域，前人開展了一系列探索。王麗結合dsRNA方法和酶法對來自全國2個不同地區的8個不正常香菇菌株和61株表型正常的香菇菌株進行了檢測，最后發現采自不同地區的8個不正常香菇菌株均含有相同大小的dsRNA條帶。吳小平等采用菌絲尖端挑取法對3株帶毒香菇進行脫毒處理，并對脫毒不徹底菌株、無毒菌株及帶毒菌株進行了相關測定。Sun等4通過利巴韋林法消除LeV-HKB病毒，結果表明，經過黃連素、金銀花處理后能顯著降低香菇HKB病毒的相對表達量。王錦杰等采用RT-PCR檢測技術，系統分析了中國香菇野生種質及栽培種質中兩種主要病毒Lentinula edodes mycovirus HKB （LeV-HKB） 和 L.edodespartitivirus 1（LePV1）的攜帶情況，結果表明，67.8% 供試菌株單獨或復合感染LeV-HKB和LePV1中的1種或2種，其中LeV-HKB病毒攜帶率為 56.7% 。雖然在部分真菌脫毒過程中取得了一定的成效，但關于香菇9608脫除LeV-HKB病毒后對子實體性狀影響的研究還存在諸多空白，因此，有必要在已有研究基礎上，全面且深入地開展研究工作，填補該領域的知識空缺。基于前人研究的不足，本研究圍繞香菇9608脫毒方法優化、脫毒后子實體性狀變化及內在機制等方面，明確了該研究擬解決的關鍵問題，凸顯出本研究的針對性。2020年，南陽市科學院與南陽師范學院以南陽市主栽香菇品種9608為試驗材料，開展了香菇脫毒研究。其相應的等基因脫毒菌株T9608是通過使用利巴韋林藥物脫毒結合菌絲尖端脫毒技術獲得，采用dsRNA和RT-PCR鑒定菌株是否攜帶真菌病毒 LeV-HKB^[7] 02021年，南陽市科學院進行了脫毒菌株出菇試驗，與原始菌株相比增產 7.24% ，并于2022年在西峽縣食用菌科研中心進行了生產試驗。通過精準脫除香菇9608中的 病毒，并系統分析子實體在形態、生理指標等方面的變化，能夠深入探究此病毒與香菇子實體發育的互作機制。探究出香菇9608脫除LeV-HKB病毒后對子實體性狀的影響，為香菇菌種的定向改良工作提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

試驗于2024年2—4月在河南省南陽師范學院食品工程中心進行。

供試材料：200個原始9608菌株新鮮子實體和163個脫毒菌株T9608新鮮子實體（由河南省南陽市菌類食品工程中心提供）。病毒唑PDA培養基：加人 25mg 利巴韋林藥片配制成濃度為 100μg?mL^-1 的PDA培養基。

1.2方法

1.2.1脫毒方法采用藥物脫毒結合菌絲尖端脫毒技術：配制濃度為 100μg?mL^-1 利巴韋林PDA培養基，將試驗菌株接種置于 25^°C 溫度條件下培養 12d 再次接入利巴韋林PDA培養基，重復7次。

1.2.2子實體形態指標測定按照《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南香菇》（NY/T2560-2014）8要求準確統計采集子實體數量，使用電子天平稱量單個子實體鮮質量，計算總產量。通過對比脫毒組與帶毒組的農藝性狀數據，分析脫毒處理對香菇9608生產性能的影響。香菇數據采集指標包括：菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄直徑、菌蓋質量、菌柄質量、單菇質量，形成原始數據。

1.2.3RT-PCR檢測將待檢香菇菌株放置在PDA培養基中 25^°C 溫度條件下暗培養15d，用刮鏟收集菌絲體，使用E.Z.N.ARNA提取試劑盒提取香菇菌絲體總RNA。設計引物： 5^′. -CTCCGTAGTCGTCAGATTGTCC ^-3′，5′ -GTGACGCTACTACCGATTTAGCC-3^′ ，對香菇病毒Lev-HKB的特異性區域進行擴增長度為 589dp 。根據Reverse TranscriptionKit（withgDNase）反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，反應條件： ：25%10min，55%15min，85%5min_? 。

將反轉錄的樣品通過RT-PCR檢測病毒，反應總體系 22μL ，包括 0.9μL cDNA，正反引物各 1μL 11μL enzyme Mix， 8.1μL DEPC處理水。香菇病毒定性分析的反應條件 95^°C5min，94^°C30s，58^°C 30s，72^°C30s ，共30個循環。RT-PCR反應產物經1.2% 瓊脂凝膠電泳，于凝膠成像系統檢測RT-PCR結果9]。

1.3數據分析試驗數據采用 Excel2010 軟件計算各處理組數據的平均值、標準差，運用SPSS統計軟件進行單因素方差分析（ANOVA），使用Origin2021軟件繪制圖表。

2結果與分析

2.1脫毒前后子實體菌蓋對比

如圖1所示，將子實體切面進行對比，經測量未脫毒前菌蓋（國人主要取食部位）長度平均為38.7469mm ，脫毒后菌蓋長度平均為 46.4556mm 增加了 19.89% ；菌蓋厚度方面，脫毒前菌蓋厚度平均為 16.2136mm ，脫毒后菌蓋厚度平均為18.8997mm ，增加了 16.56% ，有顯著的增產性。由此可見，在相同的產量下，可食性比率顯著增多。

圖1脫毒菌株與未脫毒菌株子實體切面對比

Fig.1Comparison of fruiting body sections between detoxified and non detoxified strains

2.2 LEV-HKB檢驗結果

試驗對所采樣品進行了病毒檢測，其中MTO為脫毒后菌株，MT3為未脫毒菌株，分別對LEV-HKB、DFV2、MV1這3種病毒進行了檢測。由圖2可知，脫毒后菌株（MTO）未檢測到LEV-HKB，DFV2和MV1這3種病毒的含量減少，且該脫毒技術對3種病毒的脫毒效果也存在差異，效果排序為LEV-HKBgt;DFV 2gt; MV1。DFV2和MV1病毒含量減少可能與采用菌絲尖端脫毒有關，這與孫藝嘉等研究結果相同。

圖2病毒檢測結果Fig.2Virusdetectionresults

2.3檢驗結果分析

2.3.1T檢驗分析由表1數據可知，香菇9608脫除LeV-HKB病毒后，子實體的多項形態性狀指標較脫毒前均有明顯提升。以菌蓋直徑為例，脫毒處理前長度為 38.7469mm ，脫毒處理后長度升至46.4556mm ，增長了 19.89% ;菌蓋厚度脫毒處理前為 16.2136mm ，脫毒處理后達到 18.8997mm ，增長了 16.57% ，表明脫毒處理有助于子實體在形態上更為飽滿、厚實。菌柄相關指標同樣如此，菌柄直徑經脫毒處理后從 9.6618mm 增長至 15.3401mm ，增幅顯著，說明脫毒處理對菌柄的生長發育也有積極影響。

從標準偏差和標準錯誤平均值來看，大部分指標在脫毒后的標準偏差有所減小，說明脫毒處理后后子實體性狀的穩定性有所提高，個體間差異變小。但脫毒后的菌蓋質量標準偏差大幅增加，原因可能是脫毒處理后子實體生長受多種因素影響，導致個體間質量差異增大。

如圖3所示，將香菇9608脫除LeV-HKB病毒前后子實體的7項主要性狀進行對比，可以清晰看出，脫毒后子實體在菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄直徑、菌蓋質量、菌柄質量和單菇質量等指標上，數值均高于脫毒前，直觀反映出脫毒處理對子實體生長的促進作用。結合成對樣本相關性數據（表2），其中菌蓋厚度脫毒前后相關性顯著 （Plt;0.05 ），結果表明脫毒處理對菌蓋厚度的影響在統計學上具有意義；而其他性狀數值雖然有提升，但相關性未達顯著水平（ Pgt;0.05 ），表示這些性狀的變化可能受多種因素綜合影響，有待進一步深入研究。

表1成對樣本統計數據

表2成對樣本相關性

Tab.2Paired sample correlation

從成對樣本差值T檢驗結果來看（表3），香菇9608脫除LeV-HKB病毒后，子實體的各項形態、質量相關性狀均發生了顯著變化，脫毒后的數值明顯優于脫毒前。這有力地證明了脫毒處理對改善香菇

9608子實體性狀具有積極且顯著的效果，與之前成對樣本統計數據中脫毒后性狀平均值升高相呼應。由表3數據可以看出，脫毒前后各性狀的差值均呈負數，說明脫毒后性狀數值大于脫毒前，其中菌蓋直徑的平均數增長幅度最為明顯，為 7.70867mm 。菌蓋質量標準偏差為 ，數值較大，說明不同樣本間菌蓋質量脫毒前后的差值波動較為明顯，個體差異較大；而菌柄質量標準偏差為 3.03578g ，相對較小，表明其差值相對穩定。同時，從顯著性（雙尾）的數據可知，香菇9608脫毒前后除了子實體的菌柄長度與脫毒為顯著相關外，菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄直徑、菌蓋質量、菌柄質量以及單菇質量等所有性狀均呈極顯著差異。

2.3.2相關關聯系分析 由圖4可知，脫毒后的單菇質量與未脫毒的香菇單菇質量在樣本上，采用原始數據進行交互相關性分析結果表明，脫毒處理對香菇單菇質量的影響呈十分顯著正相關，對增產也有顯著的正相關影響。

表3成對樣本差值T檢驗Tab.3Paired sample difference T-test

圖4脫毒處理與未脫毒處理單菇質量交互相關性分析

Fig.4 Correlation analysis of qualityinteraction between virus-free and nonvirus-free single mushrooms

2.3.3多層感知器分析如圖5所示，通過神經網絡分析，結果表明，脫毒影響的主要因子是菌蓋厚度、單菇質量和菌蓋直徑，與脫毒的影響性狀缺少菌柄長度這一指標。所以，通過脫毒處理可以極顯著影響3個指標的表觀。同時，在量化指標上有增大的趨勢。

圖5多層感知器分析Fig.5Analysis of multilayer perceptron

隱藏的階層啟動函數：雙曲線正切值；輸出階層啟動函數：單位。

2.3.4最近鄰法分析如圖6所示，由散點在各坐標軸方向上的分布趨勢分析可知，菌蓋直徑、菌蓋厚度和菌柄長度成為影響其他性狀指標的主要表觀性狀。所以，這3個指標可作為脫毒香菇檢測性狀的指示性特征。

選取作為焦點記錄的點；此圖為預測變數空間的低維度投射，其中共包含14個預測變數。

圖6預測變數空間低緯度投射圖

Fig.6Low latitude projection of predicted variable space

3討論與結論

3.1 討論

3.1.1脫毒技術有效性本研究采用利巴韋林藥物脫毒結合菌絲尖端脫毒技術，可有效脫除香菇LeV-HKB病毒，顯著改善子實體形態性狀，證實該技術在香菇脫毒中的可行性與有效性。后續可探索優化脫毒技術，提高對其他病毒的脫除效果，降低對菌絲生長的潛在負面影響[10-12]。

3.1.2性狀變化原因探討 （1）基因表達調控。脫除LeV-HKB病毒后，香菇9608相關基因表達可能改變，影響子實體生長發育相關代謝途徑，進而導致形態、生理生化和農藝性狀變化。未來可借助轉錄組學、蛋白質組學技術深入探究基因表達譜和蛋白質調控網絡變化[13-15]

（2）營養競爭與利用。病毒侵染可能與香菇細胞爭奪營養物質，干擾營養代謝途徑。脫毒后的香菇細胞營養獲取和利用更高效，促進子實體生長，提升產量和品質。后續可研究脫毒前后營養物質吸收、轉運及代謝關鍵酶活性變化。

3.2 結論

試驗通過dsRNA和RT-PCR鑒定，成功獲得脫除LeV-HKB病毒的9608菌株（T9608）。未檢測到LeV-HKB病毒核酸，且部分其他病毒（如DFV2、MV1）含量也有減少，脫毒技術針對不同病毒脫毒效果存在差異，表現差異排序為HKBgt;DFV2gt;MV1。脫毒處理后子實體多項形態性狀指標顯著提升。多數形態指標脫毒后的標準偏差減小，性狀穩定性提高，但菌蓋質量標準偏差大幅增加。成對樣本差值T檢驗表明，脫毒前后，菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄直徑、菌蓋質量、菌柄質量和單菇質量等性狀均存在極顯著差異（僅菌柄長度為顯著差異）。交叉相關分析結果表明，脫毒處理對香菇總質量的影響呈十分顯著的正相關，對增產也有顯著的正相關影響。通過神經網絡分析結果表明，脫毒影響的主要因子為菌蓋厚度、總質量和菌蓋直徑。多層感知器和最近鄰法分析結果表明，菌蓋直徑、菌蓋厚度和菌柄長度，成為影響其他性狀指標的主要表觀性狀。

本研究僅分析了脫毒后子實體一次性狀表現，未跟蹤生長發育全過程，后續可開展長期動態監測，明確性狀變化關鍵時間節點和動態趨勢。另外，本研究主要對LeV-HKB病毒的脫除技術進行了關注，未考慮其他潛在病毒或微生物群落影響，因此未來可綜合研究多種病毒及微生物群落與香菇互作關注7。同時，該研究局限于實驗室和小規模生產試驗，下一步需擴大田間試驗規模，驗證脫毒菌株在不同生態環境和栽培條件下的穩定性和適應性，為大規模推廣應用提供更充分依據。

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