一株釀酒酵母的篩選鑒定及其釀酒潛力研究

中圖分類號(hào)：TS261.1；S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006—6500.2025.07.009

Abstract：ToenrchthelocalyeastresourcesinTianjinandscreenoutexcellentlocalyeaststrainssuitableforbrewingShineMuscat wine，thisstudyisolatedstrainsfromthesoilfruitsndleavesofvineyardsintheTanjinrapeproductionarea.Troughpurifcation culture，olonysegolelardntatiotrssstacetsts，loolemetationdoaproductiapacitt，t strainswerescreenedandtheirbrewingpotentialwasstudied.TheresultsshowedthatstrainY26wasSaccharomycescerevisiae. Strain Y26 could grow under stress conditions of 18% alcohol content，pH2， 60% sugar content and 4 C .Comparedwithcommercial yeaststrain F33，strain Y26 started fermentation faster，increased the content of dry extractby 6.6% ，reduced the content of the undesirable methanol by 12.0% ，and the number of aroma components in the wine fermented by strain Y26 was 56，with a total amount of 189.38mg?L^-1 ，which were respectively higher than the control strain F33（ 54，175.46mg?L^-1 ）. In conclusion，Saccharomyces cerevisiaestrainY26sgoodstresrsistanendbrewingpotetialandhaspotentialaplicationvalueinesearhandproduction of characteristic wines.

KeyWords：Saccharomyces cerevisiae;screeningand identification; stress resistance;wine;aroma

釀酒酵母是葡萄酒釀造過程中影響生產(chǎn)管理、產(chǎn)量和葡萄酒品質(zhì)的重要微生物菌種。酒精發(fā)酵環(huán)節(jié)，釀酒酵母的代謝產(chǎn)物決定了香氣質(zhì)量，進(jìn)而影響葡萄酒產(chǎn)品的風(fēng)格和個(gè)性2-3]。為保證葡萄酒釀造的可預(yù)測(cè)性和可重復(fù)性，目前我國(guó)葡萄酒企業(yè)普遍采用進(jìn)口的商業(yè)釀酒酵母4。然而，對(duì)于進(jìn)口酵母的過分依賴不僅提高了釀造成本，還導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)的嚴(yán)重同質(zhì)化，制約了我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，圍繞特色葡萄品種開展本土優(yōu)良釀酒酵母的篩選應(yīng)用，對(duì)于打破對(duì)進(jìn)口酵母的過度依賴，釀造更具風(fēng)土特色的葡萄酒具有重要意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開展本土優(yōu)良釀酒酵母菌株的選育。鞏麗莉等和周桂珍等在寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)開展本土釀酒酵母篩選，分別篩選出4株低產(chǎn) H₂S 酵母和10株優(yōu)良釀酒酵母。Christofi等在圣托里尼島篩選出2株本土釀酒酵母Sa和Sb，其具有良好的釀造高品質(zhì)白葡萄酒的優(yōu)勢(shì)。Gao等篩選的本土釀酒酵母L59菌株具有較強(qiáng)的特定理化條件和微生物環(huán)境適應(yīng)性，可以增強(qiáng)葡萄酒的甜香特征。然而從產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化應(yīng)用來看，我國(guó)釀酒酵母菌株的選育及應(yīng)用仍處于起步階段，國(guó)產(chǎn)的優(yōu)良本土酵母菌株仍十分缺乏[9-10]。我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)逐漸呈現(xiàn)品種多元化發(fā)展態(tài)勢(shì)，陽光玫瑰、妮娜皇后等明星葡萄品種的栽培面積不斷增加，相關(guān)特色葡萄酒產(chǎn)品也不斷涌現(xiàn)。然而，圍繞陽光玫瑰等具有良好釀酒潛力的鮮食葡萄品種開展專用釀酒酵母選育的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究從天津葡萄產(chǎn)區(qū)的土壤、果實(shí)和葉片中分離菌株，通過純化培養(yǎng)、菌落篩選、分子鑒定、耐受性試驗(yàn)、酒精發(fā)酵和產(chǎn)香能力試驗(yàn)等篩選出適宜釀造陽光玫瑰葡萄酒的酵母菌株，可進(jìn)一步豐富天津本土的釀酒酵母資源，為特色陽光玫瑰葡萄酒的生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株來源在天津市農(nóng)科院武清創(chuàng)新基地、天津市武清區(qū)泗村店鎮(zhèn)、天津市寧河區(qū)七里海鎮(zhèn)和天津市濱海新區(qū)茶淀街道的葡萄園中采集土壤、鮮食葡萄和葡萄葉樣本共207份，裝入無菌自封袋中，^4h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2主要試劑與儀器設(shè)備YPD液體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；香氣成分定量分析使用的57個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；商業(yè)釀酒酵母菌株F33（法國(guó)LAFFORT），購(gòu)自天津盛豐天成商貿(mào)有限公司；立式高壓滅菌鍋（LDZH-150KBS），購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械有限公司；BD260標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱，購(gòu)自孚約生物科技（上海）有限公司；熱電ThermoPico17/17R臺(tái)式微量高速離心機(jī)，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司;Olympus正置顯微鏡（CH30），購(gòu)自金瑞爾（天津）生物科技有限公司；氣相色譜儀GC-2010（FID檢測(cè)器），購(gòu)自日本島津公司。氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（5977A-7890B）CTC自動(dòng)進(jìn)樣裝置和色譜柱（HP-5MS， 30m×0.25mm×0.25μm） ，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；萃取頭 （50/30μm DVB/CAR/PDMS型極性），購(gòu)自美國(guó)Supelco公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣本處理取 1g 采集的樣品，在無菌條件下，將其放入 250mL 錐形瓶中；向錐形瓶中加入20mL 無菌水，經(jīng)充分振蕩后，室溫下靜置 20min ；吸取上清液 1mL ，再加人 9mL 無菌水充分混勻備用（下文簡(jiǎn)稱\"樣品液\"）。

1.2.2 菌株分離培養(yǎng) 吸取樣品液 100μL ，將其均勻涂布在YPD固體培養(yǎng)基上，在 28^°C 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d，挑取菌落，重復(fù)在YPD固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2～3次。純化的菌株接種于YPD斜面培養(yǎng)基， 28^°C 培養(yǎng) 24h，4‰ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3WL瓊脂培養(yǎng)基篩選釀酒酵母將分離出的菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，活化 24h 后，接種到WL瓊脂培養(yǎng)基， 27°C 條件下培養(yǎng)5d。釀酒酵母菌株的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：菌落顏色為奶油色或淺黃色至綠色，菌落表面為球形突起，光滑不透明，呈奶油狀[11-12]。

1.2.4分子生物學(xué)鑒定將獲得的目的菌株純化后送至北京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序。擴(kuò)增引物為NL1（ 5^′ -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAG-3和NL4（ 5^′ -GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3^? ，測(cè)定初篩菌株的26SrDNA的D1/D2可變區(qū)序列[2-13]。將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）官網(wǎng)上進(jìn)行Blast序列比對(duì)，使用MEGA11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.5酵母菌抗脅迫能力評(píng)價(jià)試驗(yàn)酒精度、pH值、糖度和溫度的耐受性試驗(yàn)均參考薛軍俠的方法，梯度略有調(diào)整，具體如下：

酒精耐受性：將 10%12%14%16%18%Z 醇分別加入滅菌后的YPD瓊脂培養(yǎng)基（ Δ?pH 值為7.0，含糖量為 2% ），接種新鮮單菌落后， 30^qC 條件下培養(yǎng)1周，以其生長(zhǎng)狀況衡量其對(duì)酒精的耐受性。

低 pH 值耐受性：分別調(diào)整YPD液體培養(yǎng)基（酒精度為 0% 、含糖量 2% ）的 pH 值為 2.0，3.0，4.0， 5.0，接種新鮮單菌落后， 30^cC 條件下培養(yǎng)2d，以其生長(zhǎng)狀況衡量其對(duì)低 pH 值的耐受性。

高糖耐受性：在含有 20%，30%，40%，50%，60% 葡萄糖的YPD斜面培養(yǎng)基中（酒精度為 0% pH 值為7.0進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)， 30^°C 條件下培養(yǎng)2周，以其生長(zhǎng)狀況衡量其對(duì)不同糖度的耐受性。

溫度耐受性：將新鮮單菌落接種至YPD斜面培養(yǎng)基（酒精度為 0% pH7.0 ，含糖量 2% ），分別在4、10，15，20，25，37，42^°C 下培養(yǎng)2周，以其生長(zhǎng)狀況衡量其對(duì)不同溫度的耐受性。

1.2.6葡萄酒發(fā)酵和產(chǎn)香能力試驗(yàn)葡萄酒發(fā)酵試驗(yàn)。陽光玫瑰葡萄共計(jì) 50kg ，除梗破碎后，葡萄醪共計(jì) 40L_c 加人 60mg?L^-1 二氧化硫（焦亞硫酸鉀，意大利Enartis） 0.025g?L^-1 果膠酶CL（法國(guó)LAFFORT） 、5g?L^-1 酒石酸（法國(guó)LAFFORT），混勻酶解 ^4h 后，壓濾取清汁共計(jì)24L，將其分為處理組和對(duì)照組，每組葡萄汁4L，3個(gè)重復(fù)。按照 1×10⁶ CFU?mL^-1 接種量，將釀酒酵母Y26菌株的種子液接種到葡萄汁中，F(xiàn)33（法國(guó)LAFFORT）商業(yè)酵母為對(duì)照。發(fā)酵前，果汁總酸（以酒石酸計(jì)）含量為7.4g?L^-1 ，總糖含量為 193.6g?L^-1 ，各處理添加白砂糖（廣西駿馬牌）為 115g ，目標(biāo)酒精度為 12% 。發(fā)酵溫度控制在 18^°C 左右，待比重降到0.992～0.996且不再下降時(shí)，視為發(fā)酵結(jié)束，向酒樣中加入 50mg?L^-1S0₂ 終止發(fā)酵。

酒樣理化指標(biāo)按照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定，總酸含量（以酒石酸計(jì)， g?L^-1 ）揮發(fā)酸含量（以醋酸計(jì)， g?L^-1 采用指示劑法測(cè)定，總糖含量（以葡萄糖計(jì)， g?L^-1 采用斐林試劑滴定法測(cè)定，酒精度含量（ % ）和干浸出物含量（g?L^-1） 采用密度瓶法測(cè)定，甲醇含量 （mg?L^-1） 采用氣相色譜法測(cè)定。

葡萄酒樣的GC-MS香氣分析方法與本課題組此前使用的方法一致[。本研究采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線研究初步判定Y26為釀酒酵母。

圖1Y26酵母菌株的菌落形態(tài)

Fig.1ColonymorphologyofY26yeaststrain

序列比對(duì)結(jié)果顯示，菌株Y26與釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）UCDFST：09-448（GenBank：MH595391.1）同源性最高，達(dá)到 100% 。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看（圖3），菌株Y26與釀酒酵母的親緣關(guān)系最近。綜上，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征觀察和分子測(cè)序分析，本研究確定Y26菌株為釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。

2.2酵母菌抗脅迫能力評(píng)價(jià)結(jié)果

不同酵母菌株的耐受性測(cè)定結(jié)果顯示（表1），26株酵母對(duì)酒精度 ?^pH 值、葡萄糖和溫度的抗脅迫能力存在差異，其中釀酒酵母Y26菌株可以在酒精度為 18%.pH 值為2、含糖量為 60% 、溫度為 4^°C 條件下生長(zhǎng)，具有良好的高酒精度、高酸、高糖耐受能法定量，內(nèi)標(biāo)物為2-辛醇，56種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線均由5點(diǎn)繪制，由美國(guó)Agilent公司自帶的定量分析軟件計(jì)算定量結(jié)果。

按照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》4中感官評(píng)價(jià)要求及評(píng)分細(xì)則對(duì)酒樣進(jìn)行感官分析。酒樣隨機(jī)編號(hào)。7個(gè)有豐富葡萄酒品鑒經(jīng)驗(yàn)和良好感官表現(xiàn)的品酒師組成品嘗小組，按照評(píng)分細(xì)則要求逐項(xiàng)打分，品嘗小組的分?jǐn)?shù)平均值為酒樣的感官分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1釀酒酵母的分離與鑒定

本研究從207份樣品中篩選出26株酵母，其中編號(hào)Y26酵母菌株的菌落凸起，呈圓形，表面光滑、不透明，呈奶油色（圖1），并且該菌落有酒香味，在顯微鏡下觀察呈橢圓形單細(xì)胞形態(tài)（圖2）。因此，本力，并且滿足葡萄酒低溫發(fā)酵需求。

圖2Y26酵母菌株的鏡檢形態(tài)

Fig.2Microscopic morphology of Y26 yeast strain

2.3葡萄酒發(fā)酵效果和產(chǎn)香能力評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1發(fā)酵效果評(píng)價(jià)圖4是分別接種Y26和F33酵母菌株后葡萄汁的比重變化情況，比重開始下降越早，表示發(fā)酵啟動(dòng)越早，比重下降至0.995左右且保持不變，表示發(fā)酵結(jié)束。由圖4可以看出，和F33相比，Y26能更快啟動(dòng)發(fā)酵，并提前3d結(jié)束發(fā)酵，具有更強(qiáng)的酒精發(fā)酵能力。

表2和表3分別列出了測(cè)試釀酒酵母Y26菌株和對(duì)照菌株F33發(fā)酵后葡萄酒的理化指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)得分。結(jié)果顯示，采用Y26和F33發(fā)酵的葡萄酒，理化指標(biāo)均符合GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》4國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并且酒精度均達(dá)到目標(biāo)酒精度 12% ，Y26菌株發(fā)酵的葡萄酒中可豐富酒體的干浸出物含量更高，相比F33提高了 6.6% 甲醇的含量更低，相比F33減低了 12% ；釀酒酵母Y26菌株發(fā)酵的葡萄酒果香濃郁、復(fù)雜，風(fēng)格獨(dú)特，典型性強(qiáng)，感官評(píng)價(jià)得分高于F33，質(zhì)量達(dá)到優(yōu)級(jí)品。

圖3釀酒酵母Y26系統(tǒng)發(fā)育樹圖

Fig.3Phylogenetic tree diagram of brewing yeast Y26

表1不同酵母菌株對(duì)酒精度、pH、葡萄糖和溫度的耐受性測(cè)定結(jié)果

Tab.1The stress resistance of diferent yeast strains to alcohol，pH，glucose and temperatul

注： ^?+ ”表明生長(zhǎng)； ^?++^? ”表明明顯生長(zhǎng)； ^?+++ ”表明大量生長(zhǎng)；“-”表明不生長(zhǎng)。

2.3.2產(chǎn)香能力評(píng)價(jià)由表4可知，2種酒樣中共檢測(cè)出香氣成分56個(gè)，主要包括酯類、醇類、萜烯類、酮類和芳香烴，菌株Y26發(fā)酵酒樣中香氣成分?jǐn)?shù)量為56個(gè)，總量達(dá)到 189.38mg?L^-1 ，分別高于對(duì)照菌株F33（54個(gè)） .175.46mg?L^-1 ）。醇類含量最高，其中3-甲基丁醇、2-苯乙醇和異丁醇是主要構(gòu)成化合物；Y26發(fā)酵酒樣中醇類含量達(dá)到 151.27mg?L^-1 ，占香氣總量的 79.88% ，比F33高 7.37% 。酯類含量次之，但數(shù)量最多，其中以乙酸乙酯為主；Y26發(fā)酵酒樣中酯類含量達(dá)到 37.62mg?L^-1 ，比F33高 10.32% 。萜烯類成分的閾值極低，是葡萄酒中花果香氣的重要貢獻(xiàn)成分[5，Y26發(fā)酵酒樣中萜烯類含量達(dá)到468.17μg?L^-1 ，略高于F33。此外，提升香氣復(fù)雜度的醛類成分只在Y26發(fā)酵酒樣中被檢測(cè)到。綜上所述，相比商業(yè)酵母菌株F33，Y26具有更加優(yōu)秀的產(chǎn)香能力，可以給葡萄酒帶來更濃郁復(fù)雜的香氣，進(jìn)一步提高了葡萄酒的品質(zhì)，為特色葡萄酒產(chǎn)品研發(fā)提供了優(yōu)良的本土釀酒酵母。

圖4接種Y26和F33酵母菌株后葡萄汁的比重變化情況

Fig.4Changes in specific gravity of grape juice after inoculation with Y26andF33 yeast strains

表2釀酒酵母Y26菌株和對(duì)照菌株F33發(fā)酵葡萄酒的理化指標(biāo)

Tab.2Physical and chemical indicatorsofwinefermented bystrain Y26and F33

表3釀酒酵母Y26菌株和對(duì)照菌株F33發(fā)酵葡萄酒的感官評(píng)價(jià)

Tab.3Sensoryevaluation ofwine fermented by strain Y26 and F33

3討論與結(jié)論

3.1 討論

葡萄酒釀造過程中，釀酒酵母、非釀酒酵母和乳酸菌等菌群參與酒精發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵，菌群的多樣性有助于豐富葡萄酒的化學(xué)成分和提升感官品質(zhì)，其中釀酒酵母主導(dǎo)酒精發(fā)酵過程，其生長(zhǎng)狀況和代謝特性會(huì)最終影響葡萄酒質(zhì)量[16-17]。因此，優(yōu)良的釀酒酵母應(yīng)具備發(fā)酵速度快、抗脅迫能力強(qiáng)的特點(diǎn)，并且發(fā)酵出的葡萄酒酒體醇厚協(xié)調(diào)、典型性強(qiáng)[8-9]。吳啟鳳等2篩選的2株優(yōu)良釀酒酵母的乙醇、糖度和 pH 值耐受度分別為 12%.50% 和 2.0 Garofalo 等[21]篩選的16株低產(chǎn) H₂S 釀酒酵母的乙醇耐受度為12% 。耿海波2篩選出的釀酒酵母菌株SC-62的乙醇、糖度和 pH 值耐受度分別為 14%.50% 和 4.0 程仕偉等23篩選出的3株釀酒酵母的乙醇和糖度耐受度分別為 16% 和 30% 。對(duì)比以上研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)釀酒酵母的乙醇、糖度和 pH 值耐受范圍分別為 12%～ 16%.30%～50% 和2.0～4.0，而本研究篩選的Y26菌株的乙醇、糖度和 pH 值耐受度分別 18% 、 60% 和2.0，抗脅迫能力更強(qiáng)，同時(shí)Y26可以在 4～15% 低溫范圍生長(zhǎng)，具備低溫發(fā)酵潛力。此外，與F33相比，Y26啟動(dòng)發(fā)酵更快，發(fā)酵周期短，說明該菌株的綜合耐受性能和發(fā)酵能力較強(qiáng)。

表4菌株Y26和F33發(fā)酵葡萄酒的香氣成分含量

續(xù)表4 Tab.4 Continues

酯類物質(zhì)是葡萄酒香氣中愉悅果香和花香的重要貢獻(xiàn)者，主要在微生物酶催化作用和葡萄酒陳釀過程中產(chǎn)生。趙海霞等研究表明，Y7和Y28菌株發(fā)酵的酒樣中酯類含量分別是 18.83，17.91mg?L^-1 本試驗(yàn)中，Y26菌株發(fā)酵的酒樣中酯類含量達(dá)到37.62mg?L^-1 ，并且高于商業(yè)菌株 F33（34.10mg?L^-1） ！說明Y26菌株具有良好的產(chǎn)酯性能。酯類中乙酸乙酯含量最高，此外乳酸乙酯、辛酸乙酯等含量也較高，這與趙海霞等、閆興敏等[24和李婷[25研究結(jié)果類似。醇類物質(zhì)在香氣成分中的貢獻(xiàn)僅次于酯類，是酵母細(xì)胞氨基酸代謝的副產(chǎn)物。高級(jí)醇對(duì)葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)具有不確定性。高級(jí)醇含量較低時(shí)（低于300mg?L^-1. ，可增加香氣的復(fù)雜性；高級(jí)醇含量過高時(shí)（高于 400mg?L^-1 ），會(huì)帶來不良?xì)馕?。Y26菌株發(fā)酵的酒樣中醇類物質(zhì)含量為 151.27mg?L^-1 ，高于F33 （140.88mg^?L^-1） ，萜烯類含量也略高于 F33，2 個(gè)醛類成分只在Y26發(fā)酵酒樣中被檢測(cè)到，說明相比商業(yè)酵母菌株F33，Y26產(chǎn)香能力更強(qiáng)，可以給葡萄酒帶來更濃郁復(fù)雜的香氣，具有良好的應(yīng)用潛力。

3.2 結(jié)論

本研究從天津產(chǎn)區(qū)葡萄園的土壤、葡萄表皮和葡萄葉片中分離得到26株酵母菌，鑒定出一株釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y26，該菌株可以在酒精度為 18%.pH 值為2、含糖量為 60% 、溫度為 4^°C 條件下生長(zhǎng)，具有良好的高酒精度、高酸、高糖耐受能力，可以滿足葡萄酒低溫發(fā)酵需求。與商業(yè)釀酒酵母菌株F33相比，Y26菌株發(fā)酵的葡萄酒中可豐富酒體的干浸出物含量更高，甲醇含量更低，香氣成分含量也更高，具有釀造特色陽光玫瑰葡萄酒的良好潛力，豐富了天津產(chǎn)區(qū)本土釀酒酵母資源，同時(shí)為后續(xù)天津產(chǎn)區(qū)優(yōu)良本土釀酒酵母的篩選及應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

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