piR 102382調控心臟纖維化的功能研究

摘要：

為探究心肌梗死與心臟纖維化的關系，利用轉化生長因子β（Transforming growth factorβ，TGFβ）誘導C57乳鼠原代心臟成纖維細胞構建纖維化模型，通過RTqPCR篩選纖維化相關Piwi相互作用RNA（Piwiinteracting RNA，piRNA），檢測纖維化相關蛋白CoL1A1、CoL3A1水平變化，探討piRNA在心臟纖維化中的調控作用。結果顯示，10 ng/mL TGFβ刺激成纖維細胞24 h后，piR102382表達水平上調，同時在心肌梗死小鼠心臟組織中上調；過表達piR102382會促進成纖維細胞增殖，加重心臟纖維化；抑制piR102382的表達會抑制成纖維細胞的增殖，減輕心臟纖維化程度。

關鍵詞：

心臟纖維化；Piwi相互作用RNA；轉化生長因子β

中圖分類號：R542.2

文獻標志碼：A

心臟纖維化（Cardiac fibrosis）是心肌中一種瘢痕形成過程，通常在各種類型的心臟病中發生。包括心肌梗死（Myocardial infarction， MI）、肥厚型心肌病、擴張型心肌病、糖尿病型心肌病和主動脈瓣狹[12]。MI是由于冠狀動脈供血中斷，導致心肌細胞缺血性壞死的一種常見心血管疾病。心梗之后，心臟通常會經歷一系列的修復反應，包括炎癥反應、成纖維細胞的激活和過度的細胞外基質沉積，導致心臟纖維化[3]。心臟纖維化是心肌重構的重要組成部分，會減少心肌的彈性和收縮功能，增加心臟功能不全和心力衰竭的風險[4]。因此，探尋調控心臟纖維化的關鍵分子及其作用機制對于心血管疾病的治療具有重要意義。Piwi相互作用RNA（Piwiinteracting RNA，piRNA）是一類長度為24～31個核苷酸的非編碼小分子RNA，主要通過與Piwi蛋白結合參與基因沉默、轉錄調控等生物學過程[58]。近年來，piRNA在心血管疾病中的研究逐漸增多，已有研究發現部分piRNA與心臟纖維化的進程密切相關[910]，但缺少相關的功能與機制研究。本文通過體外實驗構建心臟纖維化模型，篩選與纖維化相關的piRNA，探討了其在心臟纖維化中的功能及其調控機制。

1 材料與方法

1.1 樣本和主要試劑

原代心臟成纖維細胞樣本源自新生3日內C57乳鼠（青島大任富城畜牧有限公司），使用含5%胎牛血清高糖DMEM（賽維爾生物）培養；青鏈霉素混合液；II型膠原酶、胰液素、RNA過表達模擬物和抑制劑（Gene Pharma）；Lipo8000轉染試劑（Beyotime）；AngⅡ（AbMole BioScience）；TGFβ（AbMole BioScience）；Trizol試劑（Vazyme）；Evo MMLV反轉錄試劑盒Ⅱ（AccurateBiology）；SYBR qPCR Master Mix（Monad）；纖維化相關基因檢測引物（生工生物）；CoL1A1、CoL3A1（ABclonal）；GAPDH（ABclonal）；ECL化學發光試劑（Vazyme）。

1.2 細胞分離培養

全過程在超凈臺內工作，從1～2天齡新生小鼠（C57BL/6）中分離心臟成纖維細胞，用75%酒精清洗新生小鼠，取出心臟置于裝有預冷PBS的培養皿中，用PBS清洗心臟3次，剪碎心臟組織，并轉移至無菌錐形瓶內，加入10 mL消化液（12 mg/mL胰酶和014 mg/mL膠原酶II），在37 ℃的水浴中輕輕搖晃6 min。每次消化完畢，將上清轉移至裝有10%血清的50 mL離心管中，置于冰上保存，再次加入新的消化液，重復該過程直至變為白色絮狀物時，消化完成。將細胞懸液置于離心機中以轉速1 000 r/min，離心10 min，棄上清，用含10%血清的F12/DMEM培養基重懸，再次重復上述離心過程，棄上清，最后加入10 mL10%血清的F12/DMEM培養基重懸。輕柔混勻細胞懸液后，每次吸取1 mL，經過70目無菌篩網過濾后，轉移至10 cm細胞培養皿中，置于37 ℃的5% CO2濕化培養箱中培養15 h，成纖維細胞貼壁，未貼壁細胞為心肌細胞[8]。繼續培養成纖維細胞，待后續實驗使用。

1.3 心臟纖維化模型構建

將心臟成纖維細胞均勻分為兩組，第一組中加入1 μmol/L AngⅡ，第二組中加入10 ng/mL TGFβ。兩組培養基均為含5%胎牛血清高糖DMEM，移入常氧細胞培養箱，37℃處理24 h。

1.4 小鼠心肌梗死模型的建立

（1）給6～8周齡的C57BL/6J小鼠腹腔注射50 mg/kgbw戊巴比妥鈉，將麻醉后的小鼠置于加熱板上保持體溫恒定，固定小鼠四肢和尾部，對左胸和頸部區域脫毛處理。

（2）利用呼吸機進行機械通氣，通氣參數滿足小鼠的生理需求。小鼠氣管暴露后，緩慢插入呼吸機導管，確保氣管插管與呼吸機輸出氣流匹配，維持小鼠穩定的呼吸頻率。

（3）在小鼠左胸部第三和第四肋骨之間做小切口，使用手術鑷輕柔分開肋骨，利用擴胸器撐開胸腔，暴露心臟，剝除心包膜，為冠狀動脈結扎術做準備。

（4）輕輕移動心臟，定位左心耳，在左心耳下方約2 mm處使用60絲線結扎，成功阻斷左冠狀動脈前降支（LAD）。手術后7天，收集小鼠心臟組織用于后續的piRNA篩選實驗。

1.5 細胞轉染

將心臟成纖維細胞培養在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養基中，培養至70%～80%密度。在3組無菌EP管中加入100 μL無血清高糖DMEM培養基，分別加入1×10-4 μmol的轉染核酸（piR102382過表達模擬物、抑制劑和陰性對照），每管再加入5 μL Lipo8000轉染試劑，用移液槍輕輕吹打混合，避免氣泡的產生。將混合后的溶液在室溫下靜置20 min，讓Lipo8000試劑與轉染核酸充分結合形成穩定的復合物。將復合物均勻加入細胞培養基中，轉染后6 h后更換培養基，繼續培養24～36 h。

1.6 纖維化目的基因表達

從心臟成纖維細胞中提取總RNA后，采用纖維化目的基因的特異性引物和反轉錄試劑盒，將RNA轉錄為cDNA。然后，使用SYBR qPCR Master Mix進行實時定量PCR擴增，檢測目的基因表達水平（表1）。

1.7 細胞增殖率測定

將C57乳鼠原代心臟成纖維細胞接種至96孔板中，空白組僅含高糖DMEM培養基，置于37 ℃常氧條件下培養；對照組與實驗組則在高糖DMEM培養基中加入心臟成纖維細胞，并在相同條件下培養。第一組細胞只用piR102382 mimics轉染24 h；第二組細胞經piR102382 inhibitor轉染24 h后，加入10 ng/mL TGFβ預處理24 h。收集處理后的細胞，按照細胞增殖檢測試劑盒（Cell Counting Kit8，CCK8）說明操作，通過多功能微孔板檢測儀在593 nm波長下測量吸光度，計算細胞存活率。

1.8 纖維化目的蛋白表達

從細胞樣品中提取總蛋白，使用BCA法定量測定蛋白濃度。根據測得的濃度調整樣品，確保上樣量一致。利用SDSPAGE分離不同分子量的蛋白，電泳至目標蛋白條帶適當分開。準備“濾紙—聚偏二氟乙烯膜—蛋白凝膠”三明治結構，在轉膜緩沖液中進行蛋白轉移。蛋白成功轉移到膜上后，將膜浸泡在5%脫脂牛奶溶液中，以封閉非特異性結合位點。接著，選擇合適的初級抗體（如CoL1A1、CoL3A1或GAPDH），在4 ℃下孵育12 h以上，使抗體與目標蛋白結合。抗體結合完成后，用TBST洗滌去除未結合的非特異性蛋白，再加入適當的二抗在室溫下孵育1 h。孵育結束后，再次使用TBST清洗膜，去除未結合的二抗，隨后將膜浸入ECL化學發光試劑中，顯影并分析目標蛋白條帶。

1.9 統計學分析

應用Graphpad Prism軟件分析實驗數據和制作統計圖，采用t檢驗比較兩獨立樣本，多組間比較先利用雙因素方差分析或單因素方差分析，隨后采用Post Hoc檢驗。檢驗結果顯示Plt;005，表示具有統計學差異（*、**、***、****分別表示Plt;005、Plt;001、Plt;0001、Plt;0000 1）。

2 結果

2.1 纖維化相關piRNA篩選

利用高通量RNA測序對AngⅡ、TGFβ誘導的心臟成纖維細胞和MI模型心臟組織進行piRNA表達質譜分析，篩選出在纖維化過程中表達顯著變化的piRNA。通過qPCR技術，檢測AngⅡ、TGFβ誘導的心臟成纖維細胞以及MI組模型心臟中piRNA的表達水平變化。圖1結果表明，piR102382在AngⅡ、TGFβ處理組以及MI心臟組織中的表達顯著升高。組織表達分析說明，piR102382在心臟成纖維細胞中的表達水平顯著高于心肌細胞，而在心臟組織中的表達也高于其他組織（圖2），即piR102382可能在心臟纖維化過程中發揮重要作用，其表達水平與纖維化的發生密切相關。因此，piR102382被篩選為潛在的關鍵piRNA，可能參與調控心臟成纖維細胞的纖維化路徑。

2.2 過表達piR102382促進心臟成纖維細胞的纖維化

由圖3可知，piR102382 mimics組中piR102382的表達顯著上調，心臟成纖維細胞的增殖能力明顯增強，纖維化標志物CoL1A1和CoL3A1的表達水平顯著升高，表明纖維化過程加劇。piR102382的過表達能夠促進心臟成纖維細胞的活化，加劇心臟組織的纖維化進程，包括細胞增殖和膠原沉積的增加。

2.3 抑制piR102382表達減輕心臟成纖維細胞的纖維化

由圖4可知，piR102382 inhibitor組中心臟成纖維細胞內piR102382的表達被有效抑制，且顯著降低了纖維化相關標志物CoL1A1和CoL3A1的表達，說明纖維化程度得到有效減輕。TGFβ+piR102382 inhibitor組中，細胞增殖明顯抑制，再一次驗證了抑制piR102382對心臟成纖維細胞增殖的抑制作用，說明其有助于減輕TGFβ誘導的纖

維化反應。綜上所述，抑制piR102382能夠有效減輕心臟成纖維細胞的纖維化反應，并可能在心臟纖維化治療中具有潛在的保護作用。

3 討論

細胞外基質的不斷更新能夠維持心臟組織的正常功能和內環境穩態[11]。然而，心臟成纖維細胞在病理條件下的過度增殖和活化會引發心臟纖維化，這與心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病密切相關[12]。在生理狀態下，成纖維細胞維持細胞外基質的平衡，異常的信號通路如TGFβ的激活則導致成纖維細胞的增殖、分化并分泌大量的膠原蛋白，引發心臟纖維化[13]。TGFβ是心臟纖維化中的核心調控因子之一，已被證明在心臟病理過程中發揮重要作用，通過與其受體TGFβR1和TGFβR2結合，激活下游的SMAD信號通路（尤其是SMAD2/3），促進心臟成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，導致過度的膠原沉積和ECM重塑。TGFβ還通過非SMAD通路（如PI3K/Akt、MAPK等）增強細胞的增殖、遷移及纖維化反應[14]。心臟纖維化是心肌梗死后修復反應中的一個重要病理過程，過度的纖維化會降低心臟的彈性和收縮功能，最終導致心功能衰竭[15]。研究發現piRNA在包括心臟在內的多種組織中參與調控細胞增殖、凋亡和功能維持的過程[5，1618]，與心肌細胞類似，成纖維細胞的異常增殖和功能紊亂也可能受到特定piRNA的調控[1920]。在心臟纖維化過程中，piRNA通過調節成纖維細胞的活性，影響其增殖和膠原分泌，在纖維化的發生和進展中發揮重要作用[910，21]。piRNA通過調節TGFβ/Smad通路調控CoL1A1和CoL3A1的轉錄，piRNA可能通過調控纖維化相關的信號通路，影響CoL1A1和CoL3A1的表達。TGFβ/Smad通路是心臟纖維化過程中最為關鍵的信號通路之一，TGFβ通過激活Smad2/3信號通路直接促進CoL1A1和CoL3A1的轉錄[22]。piRNA可能通過調控TGFβ的表達或其受體的活性，間接增強CoL1A1和CoL3A1的合成。本研究充實了piRNA在心血管疾病的調控作用，發現piR102382是心臟成纖維細胞特異piRNA且參與TGFβ誘導心臟成纖維細胞纖維化，piR102382可調節纖維化通路關鍵因子CoL1A1和CoL3A1，具有預防和治療心臟纖維化的潛力。

4 結論

本文通過轉錄組測序篩選并結合qPCR驗證了基因表達水平，發現piR102382為心臟成纖維細胞特異性piRNA，并參與調控心臟成纖維細胞纖維化通路。piR102382的過表達會加速心臟成纖維細胞的增殖并促使纖維化發生，而抑制piR102382的表達則可通過降低纖維化通路相關蛋白CoL1A1和CoL3A1的表達，抑制成纖維細胞的膠原蛋白分泌，進而起到抗心臟纖維化的作用。因此，抑制piR102382具有治療心臟纖維化的潛力。

參考文獻

[1]WEBER K T， SUN Y， BHATTACHARYA S K， et al. Myofibroblastmediated mechanisms of pathological remodelling of the heart[J]. Nature Reviews Cardiology， 2013， 10（1）： 1526.

[2]SEGURA A M， FRAZIER O H， BUJA L M. Fibrosis and heart failure[J]. Heart Failure Reviews， 2014， 19（2）： 173185.

[3]LIU M R， LOPEZ DE JUAN ABAD B， CHENG K. Cardiac fibrosis： Myofibroblastmediated pathological regulation and drug delivery strategies[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2021， 173： 504519.

[4]TSCHPE C， LAM C S P. Diastolic heart failure： What we still don′t know looking for new concepts， diagnostic approaches， and the role of comorbidities[J]. Herz， 2012， 37（8）： 875879.

[5]WANG X， RAMAT A， SIMONELIG M， et al. Emerging roles and functional mechanisms of PIWIinteracting RNAs[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2023， 24（2）： 123141.

[6]BAI X F， NIU R Z， LIU J， et al. Roles of noncoding RNAs in the initiation and progression of myocardial ischemiareperfusion injury[J]. Epigenomics， 2021， 13（9）： 715743.

[7]GAO X Q， ZHANG Y H， LIU F， et al. The piRNA CHAPIR regulates cardiac hypertrophy by controlling METTL3dependent N（6）methyladenosine methylation of Parp10 mRNA[J]. Nature Cell Biology， 2020， 22（11）： 13191331.

[8]王瑞荃，陳鑫哲，王濤，等. piRNA DQ725559通過抑制心肌細胞鐵死亡通路抗心肌缺血再灌注損傷的作用[J]. 青島大學學報（自然科學版）， 2024， 37（1）： 17.

[9]L L， YUAN K Y， LI J H， et al. PiRNA CFAPIR inhibits cardiac fibrosis by regulating the muscleblindlike protein MBNL2[J]. Biochimica ET Biophysica ActaMolecular Basis of Disease， 2024， 1870（8）： 167456.

[10] CHEN B， SHI B Z， ZHOU Z J， et al. Targeting a cardiac abundant and fibroblastsspecific piRNA （CFRPi） to attenuate and reverse cardiac fibrosis in pressureoverloaded heart failure[J]. Translational Research， 2024， 267： 1024.

[11] HAN M Y， LIU Z X， LIU L， et al. Dual genetic tracing reveals a unique fibroblast subpopulation modulating cardiac fibrosis[J]. Nature Genetics， 2023， 55（4）： 665678.

[12] MARUYAMA K， IMANAKAYOSHIDA K. The pathogenesis of cardiac fibrosis： A review of recent progress[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（5）： 2617.

[13] PLIKUS M V， WANG X， SINHA S， et al. Fibroblasts： Origins， definitions， and functions in health and disease[J]. Cell， 2021， 184（15）： 38523872.

[14] SAADAT S， NOUREDDINI M， MAHJOUBINTEHRAN M， et al. Pivotal role of TGFβ/smad signaling in cardiac fibrosis： Noncoding RNAs as effectual players[J]. Frontiers in Cardiovascular Medicine， 2020， 7： 588347.

[15] TALMAN V， RUSKOAHO H. Cardiac fibrosis in myocardial infarctionfrom repair and remodeling to regeneration[J]. Cell and Tissue Research， 2016， 365（3）： 563581.

[16] ZHANG K Y， LI Y F， HUANG Y， et al. PiRNA in cardiovascular disease： Focus on cardiac remodeling and cardiac protection[J]. Journal of Cardiovascular Translational Research， 2023， 16（4）： 768777.

[17] WU X， PAN Y T， FANG Y， et al. The biogenesis and functions of piRNAs in human diseases[J]. Molecular Therapy Nucleic Acids， 2020， 21： 108120.

[18] ZHANG Q， ZHU Y Z， CAO X Y， et al. The epigenetic regulatory mechanism of PIWI/piRNAs in human cancers[J]. Molecular Cancer， 2023， 22（1）： 45.

[19] ZHANG S H， LI Y， HUANG X Z， et al. Seamless genetic recording of transiently activated mesenchymal gene expression in endothelial cells during cardiac fibrosis[J]. Circulation， 2021， 144（25）： 20042020.

[20] MCANULTY R J. Fibroblasts and myofibroblasts： Their source， function and role in disease[J]. International Journal of Biochemistry and Cell Biology， 2007， 39（4）： 666671.

[21] JIAO A D， LIU H X， WANG H H， et al. piR112710 attenuates diabetic cardiomyopathy through inhibiting Txnip/NLRP3mediated pyroptosis in db/db mice[J]. Cellular Signalling， 2024， 122： 111333.

[22] TIAN J J， ZHANG M J， SUO M Y， et al. Dapagliflozin alleviates cardiac fibrosis through suppressing EndMT and fibroblast activation via AMPKα/TGFβ/Smad signalling in type 2 diabetic rats[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2021， 25（16）： 76427659.