肝素透明質(zhì)酸涂層根管模型的構(gòu)建及其對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖的影響

中圖分類號(hào)：R783.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-4657(2025)04-0025-06

0 引言

不可逆牙髓炎和根尖周病是兩種較常見的口腔疾病，常因嚴(yán)重或長(zhǎng)期的外界刺激(如深齲、外傷露髓或醫(yī)源性原因等)對(duì)牙髓造成不可逆的感染或損傷而引起[1-2]。牙髓是位于牙本質(zhì)壁內(nèi)的高度血管化和神經(jīng)支配的組織，它具有感覺、響應(yīng)外界刺激、提供營(yíng)養(yǎng)以及形成修復(fù)性牙本質(zhì)防御外界傷害等重要功能[3]。根管治療是目前臨床治療不可逆牙髓炎和根尖周病的傳統(tǒng)方法，通過徹底去除病變牙髓控制感染，對(duì)于牙髓和根尖周病的治療成功率很高[4]。但是，根管治療后的牙齒因缺失牙髓而喪失營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、感覺和防御功能，使剩余牙體組織變脆且易折斷[5-6]。

隨著組織工程的長(zhǎng)足發(fā)展，牙髓再生逐漸成為一種極具應(yīng)用前景的替代療法[7]。牙髓再生涉及干細(xì)胞、生物材料和生物活性細(xì)胞因子，旨在生成原有健康牙髓組織結(jié)構(gòu)，最終實(shí)現(xiàn)血管、神經(jīng)重建的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體，從而完全恢復(fù)牙髓營(yíng)養(yǎng)、感覺和免疫防御的生物學(xué)功能。成功的牙髓再生需要通過上述三種成分的合理應(yīng)用來(lái)調(diào)控再生微環(huán)境[8-9]。干細(xì)胞是組織再生的主要來(lái)源[10];生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化[1];生物材料為細(xì)胞提供三維生存空間，調(diào)節(jié)局部微環(huán)境[12]。其中，生物材料的制備與應(yīng)用方式是牙髓再生研究的重要方向。

盡管牙髓再生的相關(guān)研究取得了諸多進(jìn)展，但仍面臨各項(xiàng)挑戰(zhàn)，比如再生牙髓樣組織與根管壁結(jié)合不牢難以實(shí)現(xiàn)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生。干細(xì)胞與根管壁硬組織建立緊密黏附并進(jìn)行正常的增殖分化是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生的前提條件[13]，因此嘗試借助功能型涂層或支架作為載體使干細(xì)胞定植硬組織逐漸成為研究熱點(diǎn)，而載體涂層的制備與有效應(yīng)用也隨之成為牙髓組織工程研究的重要環(huán)節(jié)。

基于上述功能型涂層制備與構(gòu)建的需求，且涂層與根管結(jié)合情況的相關(guān)研究并不多見，本實(shí)驗(yàn)以肝素修飾透明質(zhì)酸制備改性透明質(zhì)酸涂層材料，其中肝素常被用于藥物載體制備緩釋系統(tǒng)，它含有酸性硫酸鹽基團(tuán)，能夠與生長(zhǎng)因子的堿性結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過靜電作用吸附[14];透明質(zhì)酸廣泛分布于結(jié)締組織、上皮組織和神經(jīng)組織[15-17]，也是牙髓的天然組成成分，可以改善細(xì)胞粘附、增殖和分化[18]，且在細(xì)胞遷移和血管生成中發(fā)揮重要作用[19。隨后，采用浸泡、涂布、勻膠三種方法在根管模型表面構(gòu)建涂層，重點(diǎn)觀察比較不同方法構(gòu)建根管涂層的結(jié)合情況及其微觀形態(tài)，并與牙髓干細(xì)胞共培養(yǎng)初步評(píng)價(jià)該涂層對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖的影響，為牙髓再生根管涂層的制備與應(yīng)用提供思路方法。

1儀器和材料

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM-670OF，JEOL)，冷凍干燥機(jī)(Labconco，F(xiàn)reezone)，勻膠機(jī)(賽德凱斯，北京)，恒溫培養(yǎng)箱(SANYO，日本)，酶標(biāo)儀(Rayto，美國(guó))。透明質(zhì)酸(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)，肝素(上海源葉生物科技有限公司）， 5.25% 次氯酸鈉(朗力生物醫(yī)藥武漢有限公司)，嗎啉乙磺酸(MES)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(上海阿拉丁生物試劑有限公司）， 17% EDTA（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）， 19% 檸檬酸(天津市祥瑞鑫化工科技有限公司)，培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，青霉素、鏈霉素(PAA，美國(guó))，胰酶(Hyclone，美國(guó))，MTT試劑(Amresco，美國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1肝素透明質(zhì)酸涂層的制備

配制 50mLMES 緩沖液并調(diào)節(jié) pH 至4.5，將 250mg 透明質(zhì)酸鈉溶于上述緩沖液，隨后加入237.7mgEDC 和 142.7mgNHS 進(jìn)行交聯(lián)，再加入 75mg 肝素，室溫?cái)嚢柽^夜，然后轉(zhuǎn)移至滲析袋(截留分子量 Σ=Σ 25000Da )在去離子水中純化3d，滲析完成后得到肝素透明質(zhì)酸涂層材料。

2.2根管片段模型的制備

收集因正畸拔除的健康前磨牙，將其浸泡于 3% 次氯酸鈉溶液 10min ，再用磷酸緩沖鹽溶液(Phos-phatebuffersaline，PBS)沖洗，截取牙根部分，去凈牙根表面軟組織并磨除牙骨質(zhì)，徹底去除根髓，根管常規(guī)預(yù)備，將處理干凈的牙根水平截?cái)啵蒙凹埓蚰ス饣⒔y(tǒng)一制成規(guī)格為厚 2mm 外徑 5mm 、內(nèi)徑1mm 的薄片，得到根管片段模型。

為了去除玷污層，開放牙本質(zhì)小管，將該模型用去離子水超聲清洗 20min 17% EDTA溶液浸泡10 min 19% 檸檬酸浸泡 1min，5.25% 次氯酸鈉溶液浸泡 30min ，，最后用無(wú)菌PBS徹底沖洗浸泡，備用。

2.3涂層根管模型的構(gòu)建

將根管模型分為三組，浸泡組：采用 1mL 注射器將上述滲析完成的涂層材料溶液滴人根管，使溶液充滿根管浸泡 5min ;涂布組：采用小毛刷蘸取少量涂層溶液，均勻涂布于根管內(nèi)壁，靜置 5min ;勻膠組：采用旋涂勻膠儀將浸泡于涂層材料的根管模型以 500r/min 轉(zhuǎn)速處理 10s_? 。三組模型構(gòu)建涂層后置于真空冷凍干燥機(jī)凍干48h，待觀測(cè)。

2.4涂層根管模型的微觀觀測(cè)

取出凍干的涂層根管模型，固定在粘有導(dǎo)電膠的銅臺(tái)上，3次噴金處理以提高樣品的導(dǎo)電性能，在10kV 加速電壓下通過場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察模型根管壁處涂層的構(gòu)建效果及微觀形態(tài)。

2.5牙髓干細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

收集完整拔除的新鮮健康第三磨牙，存放于含 10% 雙抗的培養(yǎng)液，隨后移入超凈工作臺(tái)。無(wú)菌條件下取出牙髓組織，用 1% 雙抗培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，剪碎后離心 (1000r/s)3min ，棄上清液。消化分散后靜置培養(yǎng)1周。待細(xì)胞融合約 80% 傳代培養(yǎng)，傳代至第二代細(xì)胞備用。

2.6涂層根管模型對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)

將以不同方法構(gòu)建涂層的三組根管模型與無(wú)涂層的根管模型進(jìn)行紫外消毒，隨后分別轉(zhuǎn)移至96孔板并浸泡于培養(yǎng)液中孵育 30min ，再將P2代牙髓干細(xì)胞接種至根管模型( 3×103 個(gè)/組)，其中對(duì)照組為空白孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別為無(wú)涂層根管模型和上述三種已構(gòu)建涂層的根管模型。最后，按照MTT法處理后檢測(cè)各孔在波長(zhǎng) 490nm 處的吸光度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次，數(shù)據(jù)表示為平均值 標(biāo)準(zhǔn)差。通過SPSS軟件單因素方差分析確定組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1根管模型的微觀形態(tài)觀察

經(jīng)脫礦預(yù)處理的根管模型，肉眼觀測(cè)如圖1所示。通過掃描電鏡觀察如圖2所示。

圖1根管模型肉眼觀察圖

圖2根管模型微觀形態(tài)觀察圖

由圖1可知，經(jīng)脫礦預(yù)處理的根管模型為圓柱狀形態(tài)，水平截面呈同心圓環(huán)狀，根管壁光滑連續(xù)。由圖2可知，根管壁處牙本質(zhì)小管開放，且斷端伸出呈刺突狀，根管片段水平面較光滑平整。

3.2涂層根管模型的微觀形態(tài)觀察

不同分組涂層根管模型的微觀形態(tài)觀察如圖3所示。

注：(A，D)浸泡組;(B.E)涂布組；(C.F)勻膠組

圖3不同分組涂層根管模型的微觀形態(tài)觀察圖

浸泡組經(jīng)掃描電鏡觀察如圖3(A，D)，發(fā)現(xiàn)根管模型水平截面的牙本質(zhì)表面凹凸不平，被涂層不均勻覆蓋，根管壁可見材料大面積堆積粘附。涂布組經(jīng)掃描電鏡觀察如圖3(B，E)，發(fā)現(xiàn)根管壁均勻粘附一層材料，厚度均一且材料界面平滑整齊。勻膠組經(jīng)掃描電鏡觀察如圖3(C.F)，根管水平截面所粘附的材料呈條形放射狀分布，表面平整均一，根管壁見牙本質(zhì)小管開口成束排列，內(nèi)壁未見明顯材料粘附。

3.3涂層根管模型對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖的影響

與根管模型共培養(yǎng)1d、7d后牙髓干細(xì)胞增殖情況如圖4所示。

圖4不同分組涂層根管模型與細(xì)胞共培養(yǎng)1天(A)、7天(B)的增殖情況圖

由圖4發(fā)現(xiàn)無(wú)涂層根管組在共培養(yǎng)1d后對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用 (P<0.05) ，培養(yǎng)至7d抑制作用顯著( P<0.01 ;浸泡組、涂布組對(duì)細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組無(wú)明顯差異，但相比于無(wú)涂層根管組對(duì)細(xì)胞增殖均有明顯促進(jìn)作用( (P<0.01) ，且浸泡組相比于勻膠組在 1.7d 均有明顯的促進(jìn)作用 (P<0.05) ；勻膠組與對(duì)照組在培養(yǎng)1d后無(wú)明顯差異，在7d表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用( P<0.05 。

4討論

牙髓是一種結(jié)構(gòu)有序的結(jié)締組織，從外到內(nèi)分別為成牙本質(zhì)細(xì)胞區(qū)、乏細(xì)胞區(qū)、多細(xì)胞區(qū)和中心區(qū)。成牙本質(zhì)細(xì)胞區(qū)作為牙髓的最外層，其細(xì)胞突起延伸至牙本質(zhì)小管中，能夠感知外部刺激并通過形成修復(fù)性牙本質(zhì)做出保護(hù)性反應(yīng)，這離不開牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的特殊結(jié)構(gòu)，因此理想的牙髓再生不僅要實(shí)現(xiàn)富含神經(jīng)、血管的牙髓軟組織再生，還要重建軟組織與根管壁密不可分的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，從而真正意義上地恢復(fù)牙髓生理功能。本研究以干細(xì)胞如何定植根管表面并正常增殖為切入點(diǎn)，設(shè)計(jì)三種方式構(gòu)建涂層并觀察其與根管牙本質(zhì)粘附的微觀形態(tài)，結(jié)合涂層根管與牙髓干細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)果評(píng)價(jià)不同分組對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖的影響，從而初步評(píng)價(jià)涂層構(gòu)建方式的優(yōu)缺性。

本研究構(gòu)建的三組涂層，從微觀形態(tài)比較，毛刷涂布法構(gòu)建的涂層主要集中在根管內(nèi)壁，且材料分布均勻，厚度均一，這一結(jié)果符合我們?yōu)楦杉?xì)胞提供定植根管壁載體的設(shè)想，是牙髓再生微環(huán)境所需的涂層-根管壁結(jié)合界面。從細(xì)胞相容性結(jié)果來(lái)看，相比于正常培養(yǎng)細(xì)胞的對(duì)照組，無(wú)涂層根管抑制了牙髓干細(xì)胞的增殖，這可能與根管限制了細(xì)胞生存空間有關(guān)。浸泡組和涂布組相比于無(wú)涂層組，均有顯著的促進(jìn)作用( P<0.01 )，說(shuō)明肝素透明質(zhì)酸涂層的應(yīng)用彌補(bǔ)了根管培養(yǎng)細(xì)胞的局限性，且能與對(duì)照組保持基本一致的增殖效果。但是勻膠組并未有此表現(xiàn)，且在7d表現(xiàn)出抑制作用( T<0.05 ），這可能因?yàn)樾縿蚰z法使粘附的材料總量相對(duì)較少。

綜上，結(jié)合各組涂層粘附的微觀形態(tài)與細(xì)胞增殖結(jié)果，涂布法構(gòu)建肝素透明質(zhì)酸涂層更符合干細(xì)胞定植根管壁的需求，可以考慮以此方法進(jìn)行后續(xù)牙髓再生相關(guān)研究。

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Construction of a Root Canal Model Coated with Heparin-hyaluronic Acid and its Effect on the Proliferation of Dental Pulp Stem Cells

QIU Ying，WU Kaipeng，HUANG Tianyi (Medical Department，Jingchu University of Technology，Jingmen 448OoO， China)

Abstract:Objective:To observe the microscopic morphologyof heparin-hyaluronicacid coating onrotcanal modelconstructedbydiferentmethods，andtoevaluatethefectofthismodelontheproliferationofdentalpulpstemcells.Methods:The coating materialwaspreparedbyheparinmodifiedwithhyaluronicacid，andthecoating wasconstructedonthesurfaceoftheroot canal modelbythre methods: soaking，brush coating and spincoating.Those models wereco-cultured withdental pulpstemcels respectively，ndthefectsofach grouponcellprlferation wereobservedResults:Bysanngelectronmicrosopy，ecoating materialsaccumulatedonthesurfaceoftherotcanalmodelinthesoaking groupwerethickandunevenlydistributed.Thematerials inthecoatinggroupwere mainlyoncentratedontherotcanalwall，andtheticknesswasuniform，andthematerialiterface wassmoothandneat.Thematerialsinthehomogenizedgelgroupweremainlydistributedinthehorizontalsectionoftheotcanal model，andthesurfacewassmoothanduniform，ndnoobvious materialadesionasfoundontherotcanalwall.Thersultsof cellproliferationexperimentsowedtattheuncoatedrootcanalgroupihbitedcellproliferationcomparedwiththecontrolgroup. There was no significant diferencebetweenthesoaking groupandthecoating group，butcompared withtheuncoated group，the soakinggroupandthecoatinggrouphadobvious promotingeffectoncellproliferation.There wasnosignificant diferencebeween thehomogenizedgelgroupandthecontrol groupafter1dayofculture，butitsowedinhibitoryeffctoncellproliferationat7days. Conclusion Combinedwith the microscopic morphologyofcoating adhesion andcellproliferationresults ineach group，theconstructionofheparin-hyaluronicacidcoatingbycoatingmethodismoreilnewiththeneedsofstemcelltansplantationndthis method can be considered for subsequent research related to pulp regeneration.

Key words:coating;hyaluronic acid;root canal wall; dental pulp stem cell:

[責(zé)任編輯：許立群]