生理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中大鼠腦片尼氏染色的制備及觀察實(shí)驗(yàn)

人體生理學(xué)是一門重要的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)理論課程，致力于探究生命機(jī)體的正常功能及其活動(dòng)規(guī)律。近年來，山東中醫(yī)藥大學(xué)開展了本科生進(jìn)實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)，鼓勵(lì)本科生進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)施本科生實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新項(xiàng)目過程中，篩選適宜的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容成為確保項(xiàng)目順利開展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，在山東中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院的教學(xué)計(jì)劃中，因人體生理學(xué)實(shí)驗(yàn)與人體生理學(xué)理論課相綁定，所以人體生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課是必修課程。從現(xiàn)有課程設(shè)置來看，人體生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)仍以傳統(tǒng)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)為主，這些實(shí)驗(yàn)不僅有助于深化學(xué)生對(duì)生理學(xué)理論知識(shí)的理解，同時(shí)也著重培養(yǎng)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能、團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力以及科研寫作能力等綜合素質(zhì)。隨著腦科學(xué)等領(lǐng)域的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的內(nèi)容已難以適應(yīng)當(dāng)前科研發(fā)展的需求。這種滯后性不僅影響了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的實(shí)用價(jià)值，也削弱了其在培養(yǎng)學(xué)生科研能力方面的作用。具體而言，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)課程既無法為學(xué)生提供進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室所需的實(shí)踐技能，也難以支撐其后續(xù)的深造學(xué)習(xí)。這種狀況直接導(dǎo)致學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的下降，影響實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，最終制約了人才培養(yǎng)質(zhì)量的提升。因此，開展神經(jīng)生物學(xué)中與生理相關(guān)的前沿科學(xué)實(shí)驗(yàn)，不僅能夠提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，還能增強(qiáng)學(xué)生對(duì)科學(xué)前沿知識(shí)的認(rèn)識(shí)程度[1]

德國(guó)病理學(xué)家F.Nissl發(fā)明的組織染色方法一—尼氏染色法，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察、病理學(xué)研究和大腦不同區(qū)域的研究，且廣泛用于觀察神經(jīng)元的數(shù)量、形態(tài)、大小、分布及生存狀況等，有助于了解不同腦區(qū)的神經(jīng)元分布及結(jié)構(gòu)差異和病理變化[2]。因?yàn)樵撊旧猩窠?jīng)元細(xì)胞核和核仁清晰可見，且較易區(qū)分軸樹突，還能標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞。尼氏染色法也經(jīng)常用于復(fù)染后的切片，標(biāo)記腦內(nèi)特定的神經(jīng)元，對(duì)標(biāo)記的特定神經(jīng)元群體進(jìn)行定位。尼氏染色法步驟明確、操作簡(jiǎn)單。尼氏染色載玻片在光線下穩(wěn)定，簡(jiǎn)單保存即可使用數(shù)十年，且載玻片易于查看和拍攝，可供多屆學(xué)生觀察。因此，尼氏染色載玻片的制作和觀察實(shí)驗(yàn)較易于在本科生擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)教學(xué)及實(shí)踐項(xiàng)目中開展。

1實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性SPF級(jí)的Wistar大鼠（ 200±20g 15只，購(gòu)于山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用的5只大鼠飼養(yǎng)于一個(gè)籠子，飼養(yǎng)過程食物和水自由獲取。飼養(yǎng)環(huán)境為特定溫度（ 18～24^°C ） .12h 12h 光照/黑暗周期和 50%～60% 濕度，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。所有關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作均遵守山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理制度與操作規(guī)程，并盡可能減少動(dòng)物的使用數(shù)量并減輕動(dòng)物的痛苦。

2 研究方法

2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

教師在本科生進(jìn)實(shí)驗(yàn)室前或生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課前，準(zhǔn)備每只大鼠灌流生理鹽水 200mL 。每只大鼠需要 200mL 的 4% 多聚甲醛溶液。腦組織糖沉需要30% 的蔗糖溶液。同時(shí)，備好手術(shù)所用鑷子、剪刀、顱骨鉗等手術(shù)器械，灌流所用的滴管、蠕動(dòng)泵、包埋劑等。

2.2 灌流取腦

第一課時(shí)，進(jìn)行大鼠灌流取腦實(shí)驗(yàn)。參考《大鼠腦組織灌注固定方法的改進(jìn)》[3]對(duì)大鼠進(jìn)行心臟灌流：腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（ 8mg/100g 體重），麻醉大鼠后，迅速打開大鼠胸腔暴露心臟，將灌注針于大鼠心尖處插入左心室，并沿左心室一直上行插入主動(dòng)脈。然后剪開右心耳，輸液器開關(guān)調(diào)至最大，快速灌注 0.9% 生理鹽水 200mL ，直至流出液變清，肝臟由深紅色變?yōu)榉奂t色為止。生理鹽水灌注結(jié)束后，用 4% 多聚甲醛溶液灌流進(jìn)行腦組織固定，灌注過程中大鼠全身抽搐，當(dāng)抽搐減弱后開始減慢灌流速度，至大鼠全身僵硬。

大鼠經(jīng) 4% 多聚甲醛灌流后，斷頭取腦，小心剝離出完整的腦組織，放入 4% 多聚甲醛溶液中，并放人 4^°C 冰箱后固定 6h ，之后轉(zhuǎn)人 30% 的蔗糖溶液進(jìn)行脫水，直至腦組織脫水完全沉入瓶底[4]

第二課時(shí)，提前將糖沉后的腦組織取出，利用包埋劑包好放入冰凍切片機(jī)冷凍至 -20^°C ，然后使用冰凍切片機(jī)在 下進(jìn)行腦組織連續(xù)冠狀冰凍切片，切片厚度為 30μm ，利用含PBS的多孔板收集腦片。切片結(jié)束后，將腦片撈出貼于黏附載玻片上，室溫晾干后進(jìn)行尼氏染色。

2.3尼氏染色及觀察

將尼氏染液放入水浴鍋加熱至 60^°C ，然后將貼有腦片的載玻片放于其中繼續(xù)水浴加熱 10min 。加熱結(jié)束后用純凈水洗掉腦片上多余的染液，然后依次放入 75% 乙醇中3s ，95% 乙醇中3s、無水乙醇I中 3s 和無水乙醇 I 中1s進(jìn)行脫水處理，取出放入二甲苯I和二甲苯 I 中各 3min ，進(jìn)行透明處理，最后用中性樹膠封片[5]。待玻片干燥后利用全景熒光掃描儀進(jìn)行全腦片掃描，以待后期觀察。

第三課時(shí)，待玻片干燥后，利用全景熒光掃描儀進(jìn)行全腦片掃描，后期使用CaseViewer軟件放大

2倍觀察腦區(qū)分布形態(tài)，放大40倍觀察腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)，進(jìn)行不同腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)、大小、分布的對(duì)比觀察。

3結(jié)果

大鼠腦組織灌注和腦片尼氏染色制作實(shí)驗(yàn)中，教師先進(jìn)行詳細(xì)示范，然后學(xué)生自行完成大鼠腦組織灌注、取腦、切片及尼氏染色載玻片的制備。載玻片風(fēng)干后，用數(shù)字切片掃描儀掃描腦片，后期離線利用數(shù)字切片瀏覽軟件對(duì)照Paxinos和Watson大鼠腦圖譜（第6版）[6]對(duì)黑質(zhì)（圖1）進(jìn)行定位和觀察，并在40倍高倍鏡下觀察腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元特點(diǎn)。

圖1尼氏染色腦片圖顯示黑質(zhì)網(wǎng)狀部和致密部

黑質(zhì)分為網(wǎng)狀部和致密部。致密部呈條帶狀（圖1a和1b），主要以酪氨酸羥化酶神經(jīng)元為主，神經(jīng)元胞體較大（圖1c），染色較深。黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元分布較疏松（圖1d），在帕金森病中黑質(zhì)的致密部酪氨酸羥化酶神經(jīng)元出現(xiàn)大量壞死，導(dǎo)致黑質(zhì)致密部條帶狀不明顯。在平時(shí)研究帕金森病實(shí)驗(yàn)中保留相關(guān)黑質(zhì)的病理尼氏染色玻片，供學(xué)生觀察和比較。通過對(duì)以上腦區(qū)的觀察，可以對(duì)帕金森病、坐骨神經(jīng)損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有更加深人的認(rèn)識(shí)。

4教學(xué)經(jīng)驗(yàn)

尼氏染色作為一種經(jīng)典的神經(jīng)組織學(xué)技術(shù)，主要用于觀察腦區(qū)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元形態(tài)特征。該方法利用堿性染料焦油紫對(duì)神經(jīng)元胞質(zhì)中的尼氏體進(jìn)行特異性染色，這些嗜堿性顆粒在正常生理狀態(tài)下呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)特征。通過焦油紫染色，可清晰顯示尼氏小體的分布與結(jié)構(gòu)，從而有效評(píng)估神經(jīng)元的生理狀態(tài)或病理?yè)p傷程度。因其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，該方法已成為神經(jīng)科學(xué)研究中的重要實(shí)驗(yàn)手段。尼氏染色法實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易學(xué)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠易于觀察，但實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括灌流取腦、后固定、糖沉和鼠腦的冰凍切片等步驟，因此需要3個(gè)課時(shí)。因?yàn)樽鰧?shí)驗(yàn)的學(xué)生較多，要提前對(duì)學(xué)生進(jìn)行分組。灌流取腦用到的生理鹽水、多聚甲醛、手術(shù)器械等較多，因此教師課前要提前一天做好充分準(zhǔn)備，將試劑器械擺放條理整齊，配好相應(yīng)的試劑。實(shí)驗(yàn)前合理分組及安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，才能保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

在尼氏染色實(shí)驗(yàn)中，容易出現(xiàn)腦灌注不完全、取腦時(shí)大鼠腦部較軟[7等問題。因此，實(shí)驗(yàn)過程中需要實(shí)驗(yàn)者對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程要有全局的掌握和充分的準(zhǔn)備，同時(shí)對(duì)熟練度有一定的要求。教師在課前要將詳細(xì)步驟講解清楚，在示教過程中詳細(xì)介紹操作步驟和實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)，強(qiáng)調(diào)學(xué)生要對(duì)實(shí)驗(yàn)全程做到心中有數(shù)，同組學(xué)生做好配合，切忌慌忙上手，做一步思考一步。

結(jié)合自己日常科研工作，遴選合適的實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)課中開展教學(xué)實(shí)踐。

目前，生理學(xué)尤其是神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)展日新月異，生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與最新科研工作的差距越來越大，對(duì)日常理論教學(xué)也造成了一定的困擾。為提高生理學(xué)理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量及學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，必須進(jìn)行改革，以在本科生理學(xué)教學(xué)中發(fā)揮前沿指導(dǎo)作用。同時(shí)，教研室應(yīng)該結(jié)合本科生的不同專業(yè)方向，在滿足專業(yè)方向?qū)θ梭w生理學(xué)實(shí)驗(yàn)需求的基礎(chǔ)上，為學(xué)生提供多元的擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)選擇。例如，中醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生應(yīng)該保持相當(dāng)數(shù)量的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)內(nèi)容；藥學(xué)專業(yè)的學(xué)生可以多一些生理活動(dòng)的藥物調(diào)控實(shí)驗(yàn)；眼視光學(xué)的學(xué)生可以多一些操作性的實(shí)驗(yàn)等。尼氏染色實(shí)驗(yàn)及不同模型尼氏染色載玻片觀察實(shí)驗(yàn)的開展，取得了非常好的效果，因此后續(xù)教研室會(huì)在實(shí)驗(yàn)課程開展中增加參加實(shí)驗(yàn)的學(xué)生人數(shù)，并結(jié)合教師科研工作擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

5實(shí)驗(yàn)內(nèi)容擴(kuò)展及后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

腦片載玻片的染色是神經(jīng)生物學(xué)的基本技術(shù)，學(xué)生在掌握尼氏染色的基礎(chǔ)上可以開展多種實(shí)驗(yàn)，如免疫化學(xué)染色、免疫熒光染色、HE染色等；也可先對(duì)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理，如不可預(yù)測(cè)應(yīng)激制備抑郁模型、腦內(nèi)注射6-羥基多巴進(jìn)行帕金森病模型[5]，然后通過尼氏染色觀察黑質(zhì)和紋狀體等腦區(qū)的神經(jīng)元變化。雖然尼氏染色和免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)可以觀察不同模型之間的神經(jīng)元變化，但是不同疾病模型的制備需要專業(yè)知識(shí)和一定的時(shí)間，難以在本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開展。但是，如果相關(guān)教師開展相應(yīng)的科學(xué)研究，其制作的尼氏染色載玻片可以掃描后在教學(xué)過程中通過離線軟件供本科生觀察。

6結(jié)語(yǔ)

生理學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門必修課程，在日常的教學(xué)工作中除了開展經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)提高學(xué)生對(duì)課本理論知識(shí)的理解外，教師還應(yīng)該與時(shí)俱進(jìn)，根據(jù)科學(xué)前沿

參考文獻(xiàn)：

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