注射用頭孢味辛鈉中的聚合物雜質分析

頭孢呋辛鈉為GlaxoSmithKline研發的第二代半合成頭孢菌素類抗生素，而聚合物研究是 β -內酰胺類抗生素和頭孢菌素類抗生素藥品雜質譜研究的重要內容，聚合物雜質對照品的獲得以及聚合物的定量研究和結構分析是聚合物研究的難點。目前，已有相關文獻報道的聚合物結構品種有美羅培南、頭孢他啶、頭孢噻肟鈉[1]、頭孢拉定[2]、頭孢唑林[3]、頭孢唑肟鈉[4]等，其中頭孢噻二聚體結構、美羅培南二聚體結構已被《美國藥典》收載，并采用有關物質方法按特定雜質進行限度控制，頭孢唑肟二聚體已被《中國藥典》2020年版收載，同樣采用有關物質方法按特定雜質進行限度控制。因此，本文采用分子排阻色譜法（固定相為TSKgel，簡稱TSK）和高效液相色譜法（C18）探索頭孢呋辛鈉中的聚合物雜質分布及檢出情況，選擇專屬性更強的聚合物雜質檢查方法。

1試驗用材料與方法

1.1 試驗用儀器

e2695高效液相色譜儀（Waters公司）；AgilentInfinity1290IILC/6530Q-TOFMS 液質聯用儀（Agilent公司）。

1.2 試驗用藥品及試劑

注射用頭孢呋辛鈉（廠家1：海口市制藥廠有限公司；廠家2：GSK）、乙睛（默克公司）、甲酸（阿拉丁公司）、醋酸鈉、冰醋酸、無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、氨水（廣州化學試劑廠）。

1.3物質方法（HPLC方法）

色譜柱為月旭的UltimateXB-C8（ 250mm×

4.6mm，5μm ）；其他條件同《中國藥典》頭孢呋辛鈉項下。流動相A：醋酸鹽緩沖液（取醋酸鈉 1.36g 和冰醋酸 10ml ，加水稀釋成 2000ml ，用冰醋酸調節pH 至3.4）。流動相B：乙腈;流速為 1.5mVmin ；柱溫為 30% ；進樣量為 20μl ;檢測波長 273nm 。梯度洗脫程序：在0、40、50、51和 55min 時，流動相A的比例分別是 95% ） 80% 60% 95% 和 95% 。

1.4聚合物方法（TSK方法）

色譜柱為TOSOH的TSKgelG2000SWxl（型號為7.8mmI D×300mm，5μm， ，流動相為體積比 =95：5 的磷酸鹽緩沖液（ pH7.0 ，取 0.005mol/L 磷酸氫二鈉溶液 610mL 和 0.005mol/L 磷酸二氫鈉溶液 390mL ，混勻）和乙腈的混合溶液，檢測波長 254nm ，流速約為0.6mL/min ，控制柱溫為 30‰ ，進樣量為 20μL 。

1.5柱切換法（2D-LC-MS方法）

一維色譜條件：同1.4項下TSK方法。

二維色譜條件：流動相A為 0.1% 甲酸溶液（用稀氨水調節 pH 至3.4），流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：在 0.40，50，65，70 和 85min 時，流動相A的比例分別是 95% ） 80% 、 60% 、 10% ） 95% 和 95% 。其余條件同1.3項下。

將TSK方法中的各色譜峰通過十通切換閥切入二維色譜系統。

質譜參數：正離子模式；離子源：ESI；霧化氣溫度： 320‰ ；干燥氣流速： 9L/min ；霧化氣壓力：35psi ;鞘氣溫度： 350^qC ;鞘氣流速： 12L/min ；毛細管末端電壓： 120V 。掃描范圍： MS：50～1500m/z MS² 0

1.6 LC-MS/MS方法

液相條件：同1.5項下二維色譜條件。

質譜參數：同1.5項下質譜參數。

1.7 溶液配制

供試品溶液：取本品適量，用水稀釋制成每毫升含頭孢呋辛 2mg 的溶液。

2 結果與討論

2.1 TSK方法的專屬性

目前僅《中國藥典》2020年版采用G－10方法對頭孢呋辛鈉中的聚合物進行質控，有文獻提及采用TSK方法進行研究，兩者均利用分子篩機制對主峰前雜質峰按聚合物進行控制。為考察TSK方法的專屬性，對兩個廠家樣品在TSK方法中檢出的1～7號峰（見圖1）采用柱切換法測定各色譜峰的分子量（見表1），其中一維采用TSK方法的色譜條件，二維采用Q-TOF-MS。結果顯示：

（1）在峰2中可檢測到1個聚合物雜質，分子量介于主成分與二聚物之間，且同時在峰2中檢測到多組小分子雜質的準分子離子峰。

（2）其余峰（峰1、峰3～7）未檢測到二聚體及以上的多聚體，均為小分子雜質。綜上，說明TSK方法中仍有部分小分子雜質在主峰前出峰，雜質并未完全按分子排阻色譜法原理出峰，提示TSK方法專屬性較差。

表12D-LC-MS供試品中分子量 （M/Z） 測定結果

圖1TSK方法供試品溶液典型色譜圖

2.2LC-MS/MS中的聚合物研究

采用LC-Q-TOF等聯用技術，根據質譜法LC-MS檢測結果，通過質譜法和有關物質法兩個方法檢出雜質對應情況，對有關物質方法檢出雜質進行分子量歸屬，結果顯示本品存在1個聚合物雜質。同時，對各雜質（含聚合物雜質）在有關物質方法和TSK方法的分布和檢出情況進行對比，結果顯示TSK方法檢出的各色譜峰也能夠在HPLC方法中檢測到，且HPLC方法中聚合物1與相鄰雜質峰的分離度良好，明確HPLC法（藥典方法）對聚合物的檢出能力良好。

同時，根據質譜全掃描圖譜、分子量及裂解途徑，確認其 [M+H]⁺ 離子為 m/z744.1221 。二級碎片中信號響應較高的 m/z364.0466，m/z336.0361， □可能的 MS² 裂解圖和裂解途徑見圖2，其他色譜峰均不是聚合物。

圖2聚合物1[ M+H] +推測的結構及 MS² 裂解途徑

3結論

采用LC-Q-TOF等聯用技術可快速對聚合物雜質進行定位和定性，同時采用液相色譜比較了TSK方法和HPLC方法。結果表明，TSK方法中檢出的各色譜峰也能夠在藥典方法中有關物質HPLC方法中檢測到，且HPLC方法能夠分離聚合物雜質與相鄰小分子雜質，說明HPLC方法對聚合物雜質的檢測專屬性與分離效果要優于TSK方法。可以考慮選擇有關物質方法（HPLC方法），以聚合物1為指標聚合物，對頭孢呋辛聚合物雜質進行質控。

參考文獻：

[1］李進，姚尚辰，尹利輝，等.頭孢噻肟鈉原料的聚合物雜質分析[J].中國抗生素雜志，2020，45（9）：883-892.

［2]李進，張培培，姚尚辰，等.頭孢拉定原料及制劑的聚合物雜質分析[J].中國抗生素雜志，2019，44（4）：362-369.

[3］李進，張培培，姚尚辰，等.注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉的聚合物雜質分析[J].藥物分析雜志，2019，39（7）：1279-1294.

［4］張夏，李進，王晨，等.頭孢唑林鈉原料及制劑的聚合物雜質研究[J].藥學學報，2021，56（6）：1677-1682.