基于多模態(tài)化學(xué)發(fā)光探針的硫化氫檢測(cè)綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與教學(xué)實(shí)踐

分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)在培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力和科研素養(yǎng)方面發(fā)揮著不可替代的作用。然而，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容普遍存在科研前沿性不足、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)單一以及與實(shí)際應(yīng)用脫節(jié)等問題。化學(xué)發(fā)光技術(shù)作為近年來生物分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，因其高靈敏度、低背景干擾和實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。多模態(tài)檢測(cè)策略在復(fù)雜生物體系分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，為解決選擇性和靈敏度問題提供了新思路。

本研究基于團(tuán)隊(duì)開發(fā)的CL-NBD多模態(tài)化學(xué)發(fā)光探針[]，設(shè)計(jì)了針對(duì)硫化氫（ H₂S ）檢測(cè)的綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容。該探針通過化學(xué)發(fā)光、吸收和熒光3種信號(hào)模式實(shí)現(xiàn)了對(duì) H₂S 的高選擇性檢測(cè)，并能成功區(qū)分其他生物硫醇。 H₂S 作為重要的氣體信號(hào)分子，其檢測(cè)方法的開發(fā)具有重要價(jià)值[2-4]。本文通過將這一前沿科研成果轉(zhuǎn)化為適合本科教學(xué)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，不僅豐富了分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)的前沿性和創(chuàng)新性，也為學(xué)生構(gòu)建跨學(xué)科知識(shí)體系和培養(yǎng)科研思維能力提供了有效途徑。

1實(shí)驗(yàn)背景

隨著分析檢測(cè)技術(shù)向多模態(tài)、智能化方向快速發(fā)展，傳統(tǒng)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容與學(xué)科前沿的差距日益擴(kuò)大。傳統(tǒng)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)主要側(cè)重基礎(chǔ)操作的重復(fù)性訓(xùn)練，缺乏系統(tǒng)性科研思維的引導(dǎo)和復(fù)雜問題解決能力的培養(yǎng)[5-7]。現(xiàn)代分析化學(xué)教學(xué)應(yīng)當(dāng)注重跨學(xué)科整合和真實(shí)科研問題的引入，以便提升學(xué)生的綜合分析能力[8-9]。化學(xué)發(fā)光技術(shù)因其無需外部光源激發(fā)、背景信號(hào)低等特點(diǎn)，在生物分子檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[10]。多模態(tài)生物傳感平臺(tái)通過整合化學(xué)發(fā)光、熒光和比色法，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜生物樣本中多種分析物的同時(shí)檢測(cè)。

2實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

2.1 教學(xué)目標(biāo)

掌握化學(xué)發(fā)光探針檢測(cè)生物硫醇的基本原理，理解多模態(tài)信號(hào)在分析化學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值。熟練操作紫外-可見分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)。培養(yǎng)分析思維和科研邏輯，提升實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和問題解決能力。

2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.2.1儀器與試劑

主要儀器設(shè)備：紫外-可見分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)。

主要試劑：CL-NBD探針儲(chǔ)備液（ 1mmol/L ，以DMSO為溶劑）、硫氫化鈉（NaHS，分析純）、L-半胱氨酸（Cys）、L-同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）、Tris-HCl緩沖液（ 10mmol/L，pH7.4 。

2.2.2實(shí)驗(yàn)操作流程

（1）硫化氫激活的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)表征

化學(xué)發(fā)光光譜測(cè)試：將CL-NBD儲(chǔ)備液加入Tris-HCl緩沖液中稀釋為 10μmol/L ，隨后加入NaHS（終物質(zhì)的量濃度為 100μmol/L ）。混合均勻后，利用熒光分光光度計(jì)的化學(xué)發(fā)光模式測(cè)定化學(xué)發(fā)光光譜與最大發(fā)射波長(zhǎng)。

化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)測(cè)試：將CL-NBD儲(chǔ)備液加人Tris-HCI緩沖液中稀釋為 10μmol/L ，隨后分別加入NaHS、Cys ?Acy 和GSH（終物質(zhì)的量濃度均為 100μmolL ，立刻用熒光分光光度計(jì)的化學(xué)發(fā)光模式記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的情況，得到響應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。

（2）化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

在Tris-HCl緩沖液中配制NaHS標(biāo)準(zhǔn)系列溶液1 0～16μmol/L ），隨后分別加人CL-NBD探針（ 10μmol/L ）與系列濃度NaHS溶液混合均勻。利用化學(xué)發(fā)光模式測(cè)定各樣品在 515nm 處的發(fā)光強(qiáng)度，繪制化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與NaHS濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算檢測(cè)限（LOD）。

（3）生物硫醇區(qū)分實(shí)驗(yàn)

分別配制Cys、Hcy和GSH溶液（各 10μmol/L ），記錄CL-NBD探針與各生物硫醇反應(yīng)后的化學(xué)發(fā)光信號(hào)變化，測(cè)定各反應(yīng)體系的吸收光譜。測(cè)定反應(yīng)后的熒光信號(hào)變化。綜合分析3種模態(tài)信號(hào)，評(píng)估探針對(duì)不同硫醇的選擇性。所有樣品溶液均拍照記錄。

2.3 預(yù)期結(jié)果與分析

2.3.1硫化氫激活的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)表征對(duì)CL-NBD探針檢測(cè) H₂S 的能力進(jìn)行評(píng)估。在

Tris-HCl緩沖液中測(cè)量 H₂S 存在下CL-NBD 的化學(xué)發(fā)光光譜。加入 10μmol/L NaHS后，在 515nm 發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)到強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光信號(hào)（圖1a）。相比之下，不含NaHS的CL-NBD溶液僅顯示出微弱信號(hào)。這些結(jié)果表明CL-NBD能夠有效感應(yīng) H₂S 此外，在NaHS濃度為 0～16μmol/L 范圍內(nèi)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（圖1b）。CL-NBD探針對(duì)NaHS的檢測(cè)限被確定為 24.6nmol/L 。

化學(xué)發(fā)光指探針與底物相互作用那一刻起持續(xù)發(fā)光的現(xiàn)象，通常遵循先上升后衰減的模式。為確定CL-NBD在加入NaHS后發(fā)出峰值光強(qiáng)所需的時(shí)間，對(duì)其化學(xué)發(fā)光進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析。加入NaHS（ 100μmol/L ）后，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在大約 15min 后開始上升，隨后開始下降（圖1c）。研究結(jié)果表明，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在 15min 左右達(dá)到頂峰。為了未來準(zhǔn)確檢測(cè) H₂S ，進(jìn)一步研究了該探針暴露于其他生物硫醇分析物時(shí)的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)動(dòng)力學(xué)。正如預(yù)期，探針CL-NBD對(duì)其余3種硫醇（Cys、GSH和Hcy）的響應(yīng)顯示出各自不同的行為（圖1c）。與探針CL-NBD對(duì) H₂S 的快速響應(yīng)相比，對(duì)Cys、GSH和Hcy的響應(yīng)較慢，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度分別在 50min 、92min 和 60min 達(dá)到最大值。此外，在黑暗中可以直接用肉眼觀察到 H₂S 加入CL-NBD后產(chǎn)生的綠色化學(xué)發(fā)光，而其他硫醇則不明顯，這樣就可以快速檢測(cè)和區(qū)分 H₂S （圖1d）。

圖1（a）CL-NBD在無 H₂S 和有 H₂S 條件下的化學(xué)發(fā)光光譜（b）CL-NBD的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與不同濃度 NaHS（ 0～16μmol/L ）之間的關(guān)系（c）CL-NBD（ 10μmolL 在有 H₂S（10μmol/L），Cys（10μmol/L）. 7Hcy（10μmol/L） 和GS ）條件下的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線（d）化學(xué)發(fā)光照片

2.3.2多模態(tài)信號(hào)驗(yàn)證

紫外-可見吸收光譜顯示（圖2a）， CL-NBD 與NaHS反應(yīng)后吸收峰明顯紅移（ Δλ=145nm，386nm～ 531nm ），溶液顏色從無色變?yōu)樽霞t色。而與Cys和Hcy反應(yīng)僅導(dǎo)致 87～90nm 的紅移，溶液呈橙色；與GSH反應(yīng)后吸收變化不明顯，溶液為淡黃色。熒光測(cè)試顯示，以 405nm 為激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，所有生物硫醇均能引起熒光增強(qiáng)（ 515nm? （圖2b）。在 365nm 紫外燈照射下，可以發(fā)現(xiàn) ΔH₂S 與CL-NBD反應(yīng)后的溶液熒光呈黃色，而其他硫醇為綠色。因此，結(jié)合之前的化學(xué)發(fā)光狀態(tài)、溶液顏色和熒光情況，完全可以通過肉眼分辨出 H₂S ，甚至將 H₂S 、Cys/Hcy 和GSH三者區(qū)分開來。

圖2（a）CL-NBD在Tris-HCl緩沖液中，有無生物硫醇（ 10μmolL ）存在時(shí)的吸收光譜和（b）熒光光譜

3教學(xué)效果評(píng)估

通過對(duì)參與該實(shí)驗(yàn)教學(xué)的127名學(xué)生進(jìn)行問卷調(diào)查和課堂觀察， 86% 的學(xué)生表示對(duì)這類結(jié)合前沿科研的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容“非常感興趣”或“比較感興趣”；課堂互動(dòng)和提問頻率比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)提高了 45% ；實(shí)驗(yàn)報(bào)告中主動(dòng)探討擴(kuò)展應(yīng)用的學(xué)生比例從 12% 上升至37% 。化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)掌握率達(dá)到 92% ，高于傳統(tǒng)方法教學(xué)（ 78% ）； 73% 的學(xué)生能夠提出合理的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建議； 31% 的學(xué)生表達(dá)了繼續(xù)深入相關(guān)研究的意愿，較傳統(tǒng)課程 （8% ）有顯著提高。

4結(jié)語

以化學(xué)發(fā)光探針CL-NBD為核心，成功將前沿科研成果轉(zhuǎn)化為適合本科教學(xué)的綜合性實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，為分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革提供了有效范例。通過多模態(tài)信號(hào)檢測(cè) H₂S 這一教學(xué)設(shè)計(jì)，學(xué)生不僅接觸到化學(xué)發(fā)光等現(xiàn)代分析技術(shù)，還培養(yǎng)了系統(tǒng)分析問題和解決復(fù)雜科學(xué)問題的能力。教學(xué)實(shí)踐結(jié)果表明，這種科研反哺教學(xué)的模式顯著提升了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、實(shí)驗(yàn)技能和科研思維，為培養(yǎng)創(chuàng)新型科技人才提供了有效途徑。

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