基于多模態化學發光探針的硫化氫檢測綜合實驗設計與教學實踐

分析化學實驗教學在培養學生實踐能力和科研素養方面發揮著不可替代的作用。然而，傳統實驗教學內容普遍存在科研前沿性不足、實驗設計單一以及與實際應用脫節等問題。化學發光技術作為近年來生物分析領域的研究熱點，因其高靈敏度、低背景干擾和實時檢測等優勢，在生物醫學、環境監測和食品安全等領域得到廣泛應用。多模態檢測策略在復雜生物體系分析中具有獨特優勢，為解決選擇性和靈敏度問題提供了新思路。

本研究基于團隊開發的CL-NBD多模態化學發光探針[]，設計了針對硫化氫（ H₂S ）檢測的綜合性實驗教學內容。該探針通過化學發光、吸收和熒光3種信號模式實現了對 H₂S 的高選擇性檢測，并能成功區分其他生物硫醇。 H₂S 作為重要的氣體信號分子，其檢測方法的開發具有重要價值[2-4]。本文通過將這一前沿科研成果轉化為適合本科教學的實驗內容，不僅豐富了分析化學實驗的前沿性和創新性，也為學生構建跨學科知識體系和培養科研思維能力提供了有效途徑。

1實驗背景

隨著分析檢測技術向多模態、智能化方向快速發展，傳統分析化學實驗教學內容與學科前沿的差距日益擴大。傳統分析化學實驗主要側重基礎操作的重復性訓練，缺乏系統性科研思維的引導和復雜問題解決能力的培養[5-7]。現代分析化學教學應當注重跨學科整合和真實科研問題的引入，以便提升學生的綜合分析能力[8-9]。化學發光技術因其無需外部光源激發、背景信號低等特點，在生物分子檢測中具有獨特優勢[10]。多模態生物傳感平臺通過整合化學發光、熒光和比色法，實現了復雜生物樣本中多種分析物的同時檢測。

2實驗教學設計

2.1 教學目標

掌握化學發光探針檢測生物硫醇的基本原理，理解多模態信號在分析化學中的應用價值。熟練操作紫外-可見分光光度計和熒光分光光度計。培養分析思維和科研邏輯，提升實驗設計和問題解決能力。

2.2 實驗內容

2.2.1儀器與試劑

主要儀器設備：紫外-可見分光光度計、熒光分光光度計。

主要試劑：CL-NBD探針儲備液（ 1mmol/L ，以DMSO為溶劑）、硫氫化鈉（NaHS，分析純）、L-半胱氨酸（Cys）、L-同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）、Tris-HCl緩沖液（ 10mmol/L，pH7.4 。

2.2.2實驗操作流程

（1）硫化氫激活的化學發光響應表征

化學發光光譜測試：將CL-NBD儲備液加入Tris-HCl緩沖液中稀釋為 10μmol/L ，隨后加入NaHS（終物質的量濃度為 100μmol/L ）。混合均勻后，利用熒光分光光度計的化學發光模式測定化學發光光譜與最大發射波長。

化學發光動力學測試：將CL-NBD儲備液加人Tris-HCI緩沖液中稀釋為 10μmol/L ，隨后分別加入NaHS、Cys ?Acy 和GSH（終物質的量濃度均為 100μmolL ，立刻用熒光分光光度計的化學發光模式記錄化學發光強度隨時間變化的情況，得到響應動力學曲線。

（2）化學發光標準曲線測定

在Tris-HCl緩沖液中配制NaHS標準系列溶液1 0～16μmol/L ），隨后分別加人CL-NBD探針（ 10μmol/L ）與系列濃度NaHS溶液混合均勻。利用化學發光模式測定各樣品在 515nm 處的發光強度，繪制化學發光強度與NaHS濃度的標準曲線，計算檢測限（LOD）。

（3）生物硫醇區分實驗

分別配制Cys、Hcy和GSH溶液（各 10μmol/L ），記錄CL-NBD探針與各生物硫醇反應后的化學發光信號變化，測定各反應體系的吸收光譜。測定反應后的熒光信號變化。綜合分析3種模態信號，評估探針對不同硫醇的選擇性。所有樣品溶液均拍照記錄。

2.3 預期結果與分析

2.3.1硫化氫激活的化學發光響應表征對CL-NBD探針檢測 H₂S 的能力進行評估。在

Tris-HCl緩沖液中測量 H₂S 存在下CL-NBD 的化學發光光譜。加入 10μmol/L NaHS后，在 515nm 發射波長處檢測到強烈的化學發光信號（圖1a）。相比之下，不含NaHS的CL-NBD溶液僅顯示出微弱信號。這些結果表明CL-NBD能夠有效感應 H₂S 此外，在NaHS濃度為 0～16μmol/L 范圍內，化學發光強度與濃度之間呈現良好的線性相關（圖1b）。CL-NBD探針對NaHS的檢測限被確定為 24.6nmol/L 。

化學發光指探針與底物相互作用那一刻起持續發光的現象，通常遵循先上升后衰減的模式。為確定CL-NBD在加入NaHS后發出峰值光強所需的時間，對其化學發光進行了動力學分析。加入NaHS（ 100μmol/L ）后，化學發光強度在大約 15min 后開始上升，隨后開始下降（圖1c）。研究結果表明，化學發光強度在 15min 左右達到頂峰。為了未來準確檢測 H₂S ，進一步研究了該探針暴露于其他生物硫醇分析物時的化學發光響應動力學。正如預期，探針CL-NBD對其余3種硫醇（Cys、GSH和Hcy）的響應顯示出各自不同的行為（圖1c）。與探針CL-NBD對 H₂S 的快速響應相比，對Cys、GSH和Hcy的響應較慢，化學發光強度分別在 50min 、92min 和 60min 達到最大值。此外，在黑暗中可以直接用肉眼觀察到 H₂S 加入CL-NBD后產生的綠色化學發光，而其他硫醇則不明顯，這樣就可以快速檢測和區分 H₂S （圖1d）。

圖1（a）CL-NBD在無 H₂S 和有 H₂S 條件下的化學發光光譜（b）CL-NBD的化學發光強度與不同濃度 NaHS（ 0～16μmol/L ）之間的關系（c）CL-NBD（ 10μmolL 在有 H₂S（10μmol/L），Cys（10μmol/L）. 7Hcy（10μmol/L） 和GS ）條件下的化學發光動力學曲線（d）化學發光照片

2.3.2多模態信號驗證

紫外-可見吸收光譜顯示（圖2a）， CL-NBD 與NaHS反應后吸收峰明顯紅移（ Δλ=145nm，386nm～ 531nm ），溶液顏色從無色變為紫紅色。而與Cys和Hcy反應僅導致 87～90nm 的紅移，溶液呈橙色；與GSH反應后吸收變化不明顯，溶液為淡黃色。熒光測試顯示，以 405nm 為激發波長時，所有生物硫醇均能引起熒光增強（ 515nm? （圖2b）。在 365nm 紫外燈照射下，可以發現 ΔH₂S 與CL-NBD反應后的溶液熒光呈黃色，而其他硫醇為綠色。因此，結合之前的化學發光狀態、溶液顏色和熒光情況，完全可以通過肉眼分辨出 H₂S ，甚至將 H₂S 、Cys/Hcy 和GSH三者區分開來。

圖2（a）CL-NBD在Tris-HCl緩沖液中，有無生物硫醇（ 10μmolL ）存在時的吸收光譜和（b）熒光光譜

3教學效果評估

通過對參與該實驗教學的127名學生進行問卷調查和課堂觀察， 86% 的學生表示對這類結合前沿科研的實驗內容“非常感興趣”或“比較感興趣”；課堂互動和提問頻率比傳統實驗提高了 45% ；實驗報告中主動探討擴展應用的學生比例從 12% 上升至37% 。化學發光測定技術掌握率達到 92% ，高于傳統方法教學（ 78% ）； 73% 的學生能夠提出合理的實驗優化建議； 31% 的學生表達了繼續深入相關研究的意愿，較傳統課程 （8% ）有顯著提高。

4結語

以化學發光探針CL-NBD為核心，成功將前沿科研成果轉化為適合本科教學的綜合性實驗內容，為分析化學實驗教學改革提供了有效范例。通過多模態信號檢測 H₂S 這一教學設計，學生不僅接觸到化學發光等現代分析技術，還培養了系統分析問題和解決復雜科學問題的能力。教學實踐結果表明，這種科研反哺教學的模式顯著提升了學生的學習興趣、實驗技能和科研思維，為培養創新型科技人才提供了有效途徑。

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