砂蘚SMPD基因的克隆及對干旱和高溫脅迫響應分析

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2025）08-1530-13

Abstract： Sphingomyelin phosphodiesterase（SMPD）plays a crucial role in the sphingolipid metabolism process by hydrolyzing sphingomyelin into phosphatidylcholinesandceramides.Toinvestigatethe functionsrelatedto drought toleranceandhigh-temperaturetoleranceofan SMPDgene（RcSMPD）inthestronglydesiccation-tolerant plant Racomitrium canescens，quantitative real-time PCR （qPCR）was employed to detect the expresion of RcSMPD under dehydration stress and high-temperature treatments.The coding sequence of RcSMPD was cloned，and bioinformatics analysiswascarredouttopredicttheprotein encoded byRcSMPD.Furthermore，transgenic Arabidopsis thaliana lines overexpresing RcSMPD were constructed to evaluate thedrought tolerance and high-temperature tolerance of RcSMPD.The results were as folows：（1）RcSMPD was found to respond tothe dehydration stress and high-temperature treatments of Racomitrium canescens to different degres.（2）RcSMPD had a total of 326 aminoacid residues and was a hydrophilic protein.itcould be an acidic or neutral SMPDand waspredicted tobelocated in chloroplastsor vacuoles.（3）Compared with wild-type plants，the morphology of the RcSMPD overexpression transgenic Arabidopsis thaliana showeddiferences，yetthere was no significant diference in stressresistance under simulated drought stress and high-temperature stress treatments among the A .thaliana lines.In conclusion，RcSMPD can participate inthe response of Racomitrium canescens to dehydration and high-temperature stress. Overexpresionof RcSMPD can change the morphologyofArabidopsisthaliana，buthasnosignificant impactonitsdroughttoleranceandhigh-temperature resistance.

Keywords：Racomitriumcanescens，sphingomyelinphosphodiesterasegne，expresionanalysis，droughtstres，ig temperaturestress

鞘磷脂（sphingomyelin，SM）于人類腦部中被發現并命名（Vesperetal.，1999），主要存在含豐富脂類組織的細胞膜和脂蛋白中（Harderamp;Simons，1997），其作為質膜的重要組成部分，以特定的排列方式構成膜中脂質區域的一部分（Adametal.，2002）。郝長春等（2009）研究表明，SM/膽固醇脂質組成的不同雙層結構對細胞間的多種相互作用具有重要影響。SM在血紅蛋白中的積累程度與多種疾病相關，張金李（2012）研究認為，其在血漿中含量的升高是動脈粥樣硬化的信號。

SM代謝在細胞中受到3種途徑的高度精準調控，這3種途徑分別為補救途徑、從頭合成途徑及鞘磷脂磷酸二酯酶（sphingomyelinphosphodiesterase，SMPD）途徑（Airolaamp;Hannun，2013）。SMPD途徑即SM的水解途徑，SMPD能夠水解細胞膜中的SM，產生磷脂酰膽堿（phosphatidylcholines，PC）和神經酰胺（ceramide，Cer）（Bielawska etal.，1992）。SMPD根據其活性的最適pH和分布位置被分為酸性鞘磷脂酶（acidsphingomyelinase，ASM）、中性鞘磷脂酶（neutralsphingomyelinase，NSM）和堿性鞘磷脂酶（alkalinesphingomyelinase，Alk-SM）3 種亞型（Hwang et al.，2015）。一般認為ASM定位于溶酶體，NSM定位于核基質、質膜、高爾基體、內質網及線粒體，AlkSM定位于質膜和高爾基體（王榮悅等，2021）。ASM是最先被鑒定及純化的SMPD，是生成Cer的主力（Thayyullathiletal.，2023），不僅參與多種細胞信號轉導，還在細胞水平上介導溶酶體代謝、細胞衰老凋亡，并在個體水平上參與免疫調節、腫瘤調控等多種過程（Marwanetal.，2017;Parketal.，2020）。ASM的生物學活性占比極高，對生物體內Cer的產生具有關鍵作用（胡松源等，2013）。NSM同樣通過水解神經鞘磷脂來調控胞內第二信使Cer水平，進而調控細胞應激、生長及調亡等過程（Taniamp;Hannun，2007）。Brann等（2002）認為激活NSM-2可誘導細胞凋亡。Charlene等（2018）研究表明，NSM活性在T細胞中發揮關鍵作用。Alk-SM是一種表達于腸道黏膜中的細胞外酶，結構與ASM及NSM不同，屬于核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族（Duan，2018）。

Cer是鞘磷脂代謝的主要產物（Jenkinsetal.，2009），其作為細胞器膜組分，可以改變膜的流動性或剛性，調控膜動力學，并作為信號分子發揮生物學功能（Blitterswijketal.，2003）。Cer作為SM代謝的中心分子，是主要質膜SM生物合成的關鍵中間體，具有重要的生物活性，在生物體內起多種作用（Gomezetal.，2021）。Cer被認為是一種抑制性第二信使，在細胞膜和細胞質之間傳遞信號，改變細胞膜脂質環境并調節細胞內信號通路，目前已被證明影響多種細胞過程，包括細胞分化、增殖、衰老、自噬及凋亡等（Hannunamp;Obeid，1995；Gomezetal.，2021）。在個體水平上，Cer在應對個體缺氧、氧化應激、紫外線照射、炎癥和免疫調節等過程中發揮作用（Imgrundetal.，2009）。在具體疾病類型方面，Cer被發現參與調節慢性阻塞性肺疾病、阿爾茨海默病、類風濕性關節炎、多發性硬化癥、肺癌和結腸癌等病癥（張濤等，2003；Henryetal.，2013；杜悅等，2023）。

目前，關于SMPD的研究大多與人類或動物疾病相關，在植物中的研究微乎其微。本研究前期以強耐脫水性植物砂蘚（Racomitriumcanescens）為材料挖掘抗逆基因資源，發現在干燥砂蘚的快速復水轉錄組數據中一個SMPD編碼基因具有顯著的差異表達，我們將該基因命名為RcSMPD，對其是否真實參與植物脅迫響應并調控植物抗逆能力進行探究。

砂蘚為紫萼蘚科（Grimmiaceae）砂蘚屬（Racomitrium）植物，具有良好的環境脅迫抗性，主要生長在裸露的巖石或沙土之上，在我國有大范圍的種群分布（何強和杜桂森，2004）。砂蘚為典型的耐旱苔蘚植物，具有極強的耐脫水性，干燥多年的砂蘚植物體在復水處理后短時間內就能恢復到正常的生長狀態（沙偉等，2010）。同時，在極強的陽光照射和高溫條件下能夠正常生長，具有較強的耐高溫性，是研究植物抗旱和抗高溫機制的良好材料（沙偉等，2020b）。基于砂蘚抗性能力，目前已克隆出其多個抗旱和抗高溫相關基因，這些基因涉及多種生命活動過程，如植物激素信號轉導、氧化還原調控、轉錄調控、次級代謝產物代謝及光合作用等（王晶晶等，2024）。已克隆獲得的相關基因包括超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）基因RcSOD（沙偉等，2019）、二氨基庚二酸脫羧酶（diaminnopimelate decarboxylase，DAPDC）基因RcDAPDC（沙偉等，2020b）、MYB轉錄因子基因RcMYB（沙偉等，2015）、查爾酮合成酶（chalconesynthase，CHS）基因RcCHS1（馬天意等，2025）、丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase，AOS）基因RcAOS2（沙偉等，2020a）、硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）基因RcTRX1（馬天意等，2024b）、鈣依賴蛋白質激酶（calcium-dependentproteinkinase，CDPK）基因RcCDPK1（馬天意等，2024a）、小G結合蛋白基因RcRab（孫苗龍等，2021）、堿性/亮氨酸拉鏈基序（basicregion/leucinezippermotif，bZIP）轉錄因子基因RcbZIP1（信雨萌等，2018）、生長素受體TIR（transportinhibitorresponse）基因RcTIR1（張春蕾等，2015）和磷脂酶D（phospholipaseD，PLD）基因RcPLD（馬天意等，2021）等，這些基因在砂蘚的脫水及復水、高溫或其他脅迫條件下均具有表達變化響應，其中RcPLD的過表達轉基因擬南芥（Arabidopsisthaliana）抗旱性顯著高于野生型擬南芥（馬天意等，2021）。研究更多砂蘚基因的抗干旱、抗高溫特性和響應機制，并利用這些基因指導抗性植物品種的培育，對增強植物抵抗脅迫能力和品質改良等方面具有重要意義。

目前，SMPD在疾病方面的研究比較廣泛，但在植物中的研究較為缺乏。本研究以砂蘚耐脫水和抗高溫脅迫過程中RcSMPD的表達變化響應為出發點，采用實時熒光定量PCR（quantitativereal-timePCR， qPCR ）、生物信息學軟件預測、植物分子生物學技術等方法，對不同脅迫處理下砂蘚中RcSMPD的表達進行檢測，對RcSMPD及其編碼蛋白質特性進行預測，構建RcSMPD過表達擬南芥植株并進行干旱和高溫脅迫處理，擬探討以下問題：（1）在砂蘚的脫水脅迫和高溫脅迫處理中RcSMPD具體的表達響應模式如何；（2）RcSMPD真實的編碼序列（codingsequence，CDS）及其編碼的蛋白質具有怎樣的性質；（3）過表達RcSMPD是否會使擬南芥的生長狀態和抗逆特性發生改變。以期初步明確RcSMPD的性質和抗逆功能特性，并為其他植物SMPD的研究提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

實驗材料砂蘚采自黑龍江省五大連池風景區，砂蘚材料的采集、保存、復水處理及取材方法同Peng等（2023）。取復水后正常生長的砂蘚放入變色干燥硅膠中進行快速脫水，分別處理0、3、6、12、24h ，取砂蘚材料莖尖部分液氮速凍后保存于 -80^°C 冰箱備用；砂蘚的高溫處理及取材同沙偉等（2020b）。實驗用擬南芥為本實驗室保存的Col-O。大腸桿菌（Escherichiacoli） DH5α 及根癌農桿菌（Agrobacertium tumefaciens）EHA105 菌株為本實驗保存。克隆載體 pMD19-T 及表達載體pRI101-AN質粒購于TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR（qPCR）使用TaKaRa公司生產的TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit試劑盒，按照說明書提取砂蘚總RNA。使用TaKaRa公司生產的PrimerScriptTMIV1ststrandcDNASynthesisMix試劑盒進行反轉錄合成砂蘚cDNA第一鏈，按照說明書配制反應體系。選用AtActin2（AT2G37620）作為擬南芥內參基因（馬天意等，2021），選用RcTUB1作為砂蘚內參基因（Pengetal.，2023），實時熒光定量PCR實驗于ThermoFisherScientific公司生產的QuantStudio1系統上進行，所用反應試劑為TBGreenpremixExTaqII（TilRnaseHPlus），購自TaKaRa公司。通過PrimerPremier5軟件設計基因引物（表1），引物由黑龍江箭速基因科技有限公司合成。反應體系、程序及結果分析方法同Peng等（2023）。

表1實時熒光定量PCR引物序列 Table1Primer sequences for qPCR

1.2.2RcSMPD基因CDS的克隆使用PrimerPremier5軟件在RcSMPD編碼序列的兩端設計引物RcSMPD-F（ 5^′ -ATGGCAAAGGATACCACGCAG-3^′ ）和RcSMPD-R（ 5^′ -TTACGCCAATGCTATAGAAGCCAAG- 3^′ ），引物由黑龍江箭速基因科技有限公司合成。以反轉錄合成的砂蘚cDNA為模板，對RcSMPD基因的CDS進行PCR擴增，反應體系及程序同沙偉等（2020b）。獲得PCR產物后使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產的FastPure？GelDNAExtractionMiniKit試劑盒進行回收純化并保存于 -20^°C 冰箱。

1.2.3克隆載體的構建及測序按照TaKaRa公司生產的pMDTM19-TVectorCloningKit將回收產物與克隆載體進行載體連接，連接成功后使用熱激法轉化大腸桿菌 DH5α 感受態細胞，轉化及菌株鑒定方法同馬天意等（2021）。使用購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產的FastPure？PlasmidMiniKit試劑盒對已成功構建克隆菌株的菌液進行質粒提取，并將提取獲得的質粒置于-20^°C 冰箱保存。克隆載體質粒經PCR驗證后送至睿博興科生物技術有限公司（哈爾濱）進行測序，使用BioEdit軟件對測序結果與轉錄組預測序列進行比對分析。

1.2.4生物信息學分析使用ProtParam軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）預測蛋白質理化性質；使用ProtScale軟件（https：//web.expasy.org/protscale/）預測蛋白質親疏水性；使用TMHMM-2.0 軟 件（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測蛋白質跨膜結構域；使用SignalP-5.O軟件（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.O/）預測蛋白質信號肽；使用WoLFPSORT軟件（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html？src Σ=Σ leftbar）預測蛋白質亞細胞定位;使用SOPMA軟件（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page Σ=Σ npsa_sopma.html）預測蛋白質二級結構；使用SWISS-MODEL 軟 件（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測蛋白質三級結構。

1.2.5植物表達載體的構建根據南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產的ClonExpress？Ⅱ OneStepCloningKit試劑盒說明書要求，設計用于RcSMPD表達載體構建的引物IF-RcSMPD-F（ 5^′ ATGCCCGTCGACCCCATGGCAAAGGATACC- ?3^′ ）和IF-RcSMPD-R（ 5^′ -GGATCCGGTACCCCCTTACGCCAATGCTAT- 3^′ ），以構建成功的克隆載體質粒為模板進行PCR，反應體系及程序同1.2.1。將PCR產物進行純化和回收。使用限制性核酸內切酶QuickCutSmaI（TaKaRa公司）根據說明書方法對pRI101-AN空載體質粒進行單酶切，回收線性化載體后，根據南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產的 ClonExpress@ II One Step Cloning Kit 說明書將目的基因DNA片段與pRI101-AN線性化載體進行重組。將重組產物使用熱激法轉化大腸桿菌 DH5α 感受態細胞，利用含 50ug?mL^-1 卡那霉素的LB固體培養基篩選含有成功構建植物表達載體質粒的菌株，擴繁菌液后進行菌液PCR鑒定，菌液培養及鑒定方法同馬天意等（2021），對已成功構建植物表達載體菌株的菌液進行質粒提取，并將提取獲得的質粒保存于 -20°C 冰箱備用。

1.2.6RcSMPD過表達轉基因植株的構建將構建成功的植物表達載體轉化根癌農桿菌EHA105株系感受態細胞，參照馬天意等（2021）的方法，在4C 條件下，將春化3d的野生型擬南芥種子點播在裝有已高壓滅菌的混合營養土（腐殖土與蛭石的比例為 1：2 ）的小花盆（ 7cm×7cm×8cm 中。

在 光照 /16h 黑暗條件下，培養擬南芥長至蓮座葉壯碩，之后轉移至 ^16h 光照 /8h 黑暗條件下培養至擬南芥植株抽墓。使用浸花法侵染野生型擬南芥，浸染方法及轉基因植株的篩選、鑒定和過表達株系中RcSMPD基因的表達量檢測方法同馬天意等（2021）。

1.2.7擬南芥的模擬干旱處理選取生長21d且長勢一致的野生型擬南芥株系與過表達轉基因擬南芥株系，使用 20% PEG-6000澆灌處理，花盆底部用保鮮膜密封，處理時間為 36h ，培養條件為22C ， 16h 光照 ^′8h 黑暗， n=3 。

1.2.8擬南芥的高溫處理選取生長 12d 且長勢一致的野生型擬南芥株系與過表達轉基因擬南芥株系置于層照培養箱（BXG-1600，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）中進行高溫處理，處理時間為 24h ，培養條件為 45°C ， ^16h 光照 /8h 黑暗，n=3 。

1.2.9統計學分析所有需要計算的數據均表示為算術平均數 ± 標準偏差， n?3 ，使用IBMSPSSStatistics22.0軟件進行數據處理并用Duncan法進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1砂蘚脫水脅迫和高溫處理過程中RcSMPD的表達變化

分別對正常砂蘚脫水、干燥砂蘚復水及 45°C 高溫處理過程中RcSMPD的表達量進行qPCR檢測，發現RcSMPD在3個處理過程中都有不同程度的差異表達（圖1）。在砂蘚脫水處理 ^3h 時， RcSMPD 的表達量達到最高，是對照組的3.6倍，隨后迅速下降，并在處理 6h 時降至最低，在處理 12～24h 時緩慢恢復至處理前的水平（圖1：A）。在干燥砂蘚復水過程中，RcSMPD的表達量在前 ¹h 內整體無顯著變化，之后呈下降趨勢，并在復水 24h 時表達量降至最低（圖1：B）。在砂蘚 45^°C 高溫脅迫處理 6h 內，RcSMPD的表達量呈上升趨勢，在處理 ^9h 時下調表達至最低，隨后在處理 ^12h 時表達量上調至最高，是對照組的18倍（圖1：C）。

2.2RcSMPD基因CDS序列的克隆

根據qPCR結果，選取高溫處理 6h 的砂蘚cDNA為模板擴增RcSMPD的CDS序列，成功獲得一條符合目的片段長度的條帶（圖2：A），將該條

帶進行回收純化后構建克隆載體，以RcSMPD克隆載體質粒為模板進行驗證（圖2：B），將驗證成功的克隆載體質粒進行測序，測序結果與轉錄組測序數據一致，說明RcSMPD基因的CDS被成功克隆，RcSMPD基因的CDS及其編碼的氨基酸序列如圖3所示。

2.3RcSMPD蛋白質的生物信息學預測

通過生物信息學工具預測分析，顯示RcSMPD總氨基酸殘基數為326，相對分子質量為36.35312kDa ，理論等電點為6.42，分子式為C₁₆₃₂H₂₅₃₂N₄₃₀O₄₉₅S₈ ，脂肪系數為79.85，總平均親水系數-0.348，穩定系數為41.03，是一種不穩定蛋白質。進一步分析顯示RcSMPD為親水性蛋白質（圖4：A），不具有跨膜結構域（圖4：B）和信號肽（圖4：C）。亞細胞定位預測得分結果顯示RcSMPD定位在葉綠體的可能性最高，其次為液泡，也有可能定位在細胞核及線粒體。對RcSMPD蛋白質的二級結構進行預測，結果顯示RcSMPD蛋白質由 27.61% （204 ∝ 螺旋、 ，3.99% （204 β 折疊 .21.47% 延伸鏈和 46.93% 無規卷曲組成（圖4：D）。對RcSMPD蛋白質的三級結構進行預測，結果如圖（4：E）所示。

2.4RcSMPD過表達轉基因擬南芥的構建

以成功構建的克隆載體質粒為模板進行PCR后回收目的條帶，與植物表達載體pRI101-AN進行重組，將重組產物轉化到大腸桿菌中，對篩選出具有抗卡那霉素的陽性菌株進行菌液擴繁后提取質粒作為模板進行PCR驗證，結果顯示在相應位置有清晰明亮的條帶，表明RcSMPD植物表達載體構建成功（圖5：A）。將RcSMPD的植物表達載體轉化到根癌農桿菌中為構建轉基因擬南芥植株作準備，以篩選出具有卡那霉素抗性的根癌農桿菌陽性菌株的菌液為模板進行PCR驗證，結果顯示農桿菌菌液泳道有與陽性對照泳道中條帶位置相近的單一條帶，表明植物表達載體已成功轉入到根癌農桿菌中（圖5：B）。

利用轉入RcSMPD植物表達載體的農桿菌侵染野生型擬南芥，收取 T₀ 代種子，在含卡那霉素的MS培養基上篩選出能夠正常生長的RcSMPD過表達轉基因擬南芥 T_?1 代植株（圖6：A）。以RcSMPD過表達轉基因擬南芥 T₁ 代植株葉片基因組DNA為模板，使用RcSMPD的qPCR引物進行鑒定，結果顯示在 T₁ 代植株DNA泳道出現一條單一明亮的條帶，并且與陽性對照條帶位置一致，表明成功獲得RcSMPD過表達轉基因擬南芥 T_?1 代植株（圖6：B）。以篩選獲得的 T₂ 代RcSMPD過表達轉基因擬南芥植株葉片RNA為模板合成cDNA，以此cDNA為模板進行qPCR以鑒定植株中RcSMPD的表達量，結果顯示在過表達轉基因擬南芥 T₂ 代植株中檢測到的熒光量遠高于野生型擬南芥，表明RcSMPD已成功在轉基因植株中超量表達（圖6：C）。

2.5干旱脅迫處理下RcSMPD過表達轉基因擬南芥的表型

以 20% PEG-6000模擬干旱脅迫，對野生型和RcSMPD過表達擬南芥株系進行處理，發現處理6h后野生型擬南芥葉片豎立向上，而RcSMPD過表達轉基因植株葉片幾乎貼于營養土表面，并且與野生型擬南芥相比，轉基因植株的葉柄更短、葉片更寬，因此我們認為RcSMPD影響了擬南芥植株葉片的生長形態，但在 20% PEG-6000模擬干旱脅迫處理下轉基因植株存活情況和其他相關表型與野生型相比無顯著性差異（圖7）。

2.645^°C 高溫處理下RcSMPD過表達轉基因擬南芥的表型

在 45‰ 高溫條件下，對野生型擬南芥和RcSMPD過表達轉基因擬南芥植株進行脅迫處理，發現二者表型在處理前 6h 并無明顯變化，處理9～24h 期間野生型擬南芥和轉基因植株幾乎全部萎蔫干枯，二者表型無明顯差異（圖8）。

3討論

3.1RcSMPD能夠參與砂蘚的耐脫水和抗高溫脅 迫應答

鞘磷脂是生物中唯一一種非甘油磷脂的脂類物質，廣泛存在細胞膜和血脂蛋白中，參與多種生理、病理過程，SMPD為其主要調控因子（羅鑫等，2020）。目前，SMPD在人類疾病方面研究十分廣泛，但在植物中的研究幾乎沒有。因此，選取典型耐旱苔蘚植物砂蘚的SMPD基因對其進行抗逆研究，這對拓展SMPD基因在植物中的研究具有重要意義。

本研究對砂蘚脫水脅迫和高溫脅迫處理下RcSMPD確切的表達響應模式進行探究，發現RcSMPD在3種處理過程中均有不同程度的差異表達，并且在脫水及高溫過程中響應程度更為顯著，這說明RcSMPD可能在抗逆方面發揮作用。植物的耐脫水性又叫作耐干燥性，屬于耐旱性的一種，與普遍意義的耐旱性不同，具有耐脫水性的植物在干旱環境下并不一定能夠長期維持自身含水量不下降，但可以在自身含水量極低（如相對含水量低于 10% ）的情況下保持存活，在環境中再次出現可吸收的水分后能快速復水并恢復至正常生長狀態，因此耐脫水性植物在脫水和快速復水2個

過程中具有獨特的調控機制（Pengetal.，2023）。在砂蘚的脫水處理中，RcSMPD的表達在脫水初期大幅度上調隨后回落，說明砂蘚在響應脫水處理初期就需要改變膜脂含量或通過Cer調控各種信號通路進行響應。在干燥砂蘚的復水過程中，RcSMPD在復水前期能夠保持一定的表達水平，在復水數小時后表達量下降，前期研究中認為雖然砂蘚在復水過程中形態恢復僅需要數分鐘，但在復水6h內的生理及分子調控變化較為劇烈且復雜（Pengetal.，2023），RcSMPD的表達情況說明其在砂蘚復水過程前期發揮一定功能，但植物體對其功能的需求不隨其他生理活動變化，因此在植物恢復正常時并不需要過多RcSMPD。相比砂蘚的脫水脅迫過程，高溫處理下砂蘚中RcSMPD表達變化十分劇烈，在高溫處理 6h 內持續上調表達，并且最高表達量超過處理前的15倍，這種變化趨勢及劇烈程度與砂蘚在高溫處理下過氧化物酶和過氧化氫酶活性的變化較為相似（李雯煜，2019）。鑒于Cer能夠在生物體氧化應激過程中發揮調控作用（Imgrundetal.，2009），我們推測RcSMPD在砂蘚高溫脅迫應答中可能通過提高Cer含量以響應脅迫帶來的氧化損傷。

3.2RcSMPD蛋白質特性與已發現SMPD具有差異

為探究RcSMPD真實的CDS及其編碼的蛋白質的性質，我們克隆并獲得了RcSMPD編碼序列，根據測序結果對RcSMPD進行生物信息學分析發現其理論等電點為6.42，故推測其可能為ASM或NSM，亞細胞定位預測顯示RcSMPD最有可能定

AM.DL20DNA Marker;-.水對照；+.RcSMPD克隆載體質粒；1、2.含有RcSMPD 植物表達載體質粒的大腸桿菌菌液。B M.DL200ODNAMarker；-.水對照; mid RcSMPD克隆載體質粒；1-3.含RcSMPD植物表達載體質粒農桿菌菌液。 A M.DL 2 OOO DNA Marker;-. Water control; +. RcSMPD cloning vector plasmid;1，2. Escherichia coli suspension containing RcSMPD plant expresionvectorplasmids.BM.DL2OOoDNAMarker；Watercontrol;+.RSMPDcloningvectorplasmid;1-3.Agrobacterium tumefaciens suspension containing RcSMPD plant expresson vector plasmids.

圖5RcSMPD植物表達載體質粒的驗證（A）及含表達載體農桿菌菌液的PCR驗證（B） Fig.5Validation of RcSMPD plant expression vector plasmids（A）and PCR identification ofAgrobacterium tumefaciens suspension containing expression vectors（B）

位在葉綠體或液泡上，也有較小的可能定位于細胞核與線粒體中，此分析結果更傾向于RcSMPD屬于NSM（王榮悅等，2023）。在使用NCBI的CDD工 具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd）對RcSMPD進行保守結構域預測時，發現其具有完整的NSM結構域，然而展開觀察后發現，數據顯示該保守結構域與RcSMPD的一致性僅有約 30% ，雖然一致的序列中包含SMPD關鍵的催化位點，但更多的序列差異表明RcSMPD與其他植物中SMPD已發現的蛋白質功能有所不同。在進行生物信息學分析時，我們本想尋找一些與RcSMPD親緣關系較近的植物與SMPD進行系統進化分析和序列相似度分析，然而意外的是，在現有的數據庫中并未發現較多植物SMPD序列記錄，并且在目前已有的序列中，RcSMPD相似度最高的序列也僅有約 51% 的相似度，序列一致性為 32% ，這說明類似RcSMPD這類的植物蛋白質研究十分稀少，相關蛋白質的特性需要更廣泛的后續研究。由于之前SMPD的亞細胞定位研究基本不來自植物，因此植物細胞葉綠體和液泡中主要有哪類SMPD發揮功能有待進一步研究，SMPD的水解酶本質特性符合液泡的生物學功能，推測RcSMPD在一般情況下儲存于液泡中的可能性較大，而其是否能夠進入葉綠體，是否確實在植物中通過水解SM產生Cer調控各種信號代謝通路以響應環境變化和發育信號也需要后續深入探索。

3.3RcSMPD單獨的過量表達不足以引起擬南芥 抗逆特性的改變

砂蘚在抗逆過程中的部分差異表達基因應具有提高植物抗逆性的功能，這些抗逆功能的具體機制與這些基因編碼蛋白質的本質生化或分子生物學功能相關。前人研究發現，AOS可能與植物對干旱脅迫的信號轉導途徑有關，將快速脫水過程中砂蘚的一個差異表達的AOS編碼基因RcAOS1在擬南芥中過表達提高了轉基因擬南芥的抗旱性（秦瑞峰等，2018）；一些MYB轉錄因子在植物的生長發育及應對各種環境脅迫中發揮著關鍵作用，將同樣在砂蘚脫水處理下差異表達的RcMYB轉人到煙草（Nicotianatabacum）中并超量表達后發現，在干旱脅迫條件下轉基因煙草具有比野生型植株更強的穩定性和恢復能力（孫靜等，2017）。RcSMPD同樣是砂蘚在脫水脅迫和高溫脅迫中的差異表達基因，為進一步探究過表達RcSMPD是否會使擬南芥的生長狀態和抗逆特性發生改變，本研究構建了RcSMPD過表達轉基因擬南芥植株，對其進行 20%PEG-6000 模擬的干旱脅迫處理和 45°C 高溫脅迫處理，并與野生型擬南芥植株進行對比以驗證其功能。研究結果表明，在PEG-6000和 45°C 高溫脅迫下轉基因植株與野生型植株相比抗逆性未產生顯著性

A.T，代RcSMPD-OE植株的抗生素篩選，紅圈內為成功篩選出的RcSMPD過表達轉基因擬南芥 T₁ 代植株。BM.DL2000DNA Marker；-.水對照；1.野生型擬南芥DNA；2.RcSMPD植物表達載體質粒陽性對照；3-5. T₁ 代轉基因植株 DNA_c C.RcSMPD過 表達轉基因擬南芥 T₂ 代植株中RcSMPD的表達量分析。

圖6RcSMPD過表達轉基因擬南芥植株的篩選及鑒定Fig. 6Screening and identification of transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing RcSMPD

A.Antibiotic screening of T₁ generation RcSMPD-OE Arabidopsis thaliana plants，the red circle indicates the successully screened RcSMPD overexpression transgenic A. thaliana T₁ plants. B M. DL 2 OOO DNA Marker; Water control; 1. DNA of wild type A. thaliana;2. Positive control of RcSMPD expression vector plasmid; 3-5. DNA of T₁ generation transgenic plants. C. Analysis of RcSMPD expression in T2 transgenic A. thaliana.

差異，但成熟的轉基因植株的形態明顯與野生型植株不同，其蓮座葉的葉片幾乎貼于營養土表面生長，并且葉柄更短、葉片更寬。以上研究結果表明，RcSMPD可能在應對干旱脅迫中發揮了一定作用，對干旱和高溫脅迫有所響應，但其單獨的表達量變化不足以改變植物體的抗旱或抗高溫能力。其原因可能為以下兩個方面：一方面，RcSMPD在砂蘚和擬南芥中的作用對象有所不同，擬南芥和砂蘚細胞中的鞘磷脂組成類型可能存在一定差異；另一方面，RcSMPD水解產生的Cer在2種植物中的下游調控因子可能有所差異，從而導致砂蘚中由其調控的信號通路無法在擬南芥中實現，這些猜想將在后續更深人的研究中進行探索分析。

4結論

本研究發現RcSMPD在砂蘚脫水、復水及高溫3個處理過程中均有不同程度的響應，RcSMPD編碼的蛋白質為親水性不穩定蛋白，可能屬于ASM或NSM，因此預測其定位在葉綠體或液泡上。RcSMPD過表達轉基因擬南芥植株與野生型擬南芥相比，葉片的形態及生長狀態發生改變，但在模擬干旱和高溫脅迫下其抗逆性未產生顯著性差異。因此，我們認為雖然表達變化響應為RcSMPD參與砂蘚耐脫水和抗高溫過程提供了證據，但是單純地增強RcSMPD表達量不足以改變植物的耐旱性和抗高溫性。

5cm

圖7 20% PEG-6000處理下RcSMPD過表達轉基因擬南芥的表型 Fig.7Phenotypes of transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing RcSMPD under 20% PEG-6000 treatment

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圖845℃高溫處理下RcSMPD過表達轉基因擬南芥的表型

Fig.8Phenotypes of transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing RcSMPD under 45 C high-temperature treatmen