匍匐翦股穎GIGANTEA基因克隆、亞細胞定位及表達分析

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2025）09-2777-09

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2025.09.003

Cloning，Subcellular Localization and Expression Analysis of GIGANTEA gene in Agrostis stolonifera L.

XIA Qing-qing，AI Ye， ZENG Li-ping*，CHAO Yue-hui （School ofGrassland Science，Beijing Forestry University，BeijinglOoo83，China）

Abstract： GIGANTEA（GI） is a plant-specific nuclear protein with important role in drought stress and salt stress. In order to investigate the stress responses of GI gene in Agrostis stolonifera（AsGI，we carried out gene cloning，subcellular localization and its expression analysis.The results showed that the complete coding region of AsGI is 3468 bp in length and it encoded 1156 amino acids. The phylogenetic tree showed that the protein encoded by the GI gene was relatively close to the evolutionary relationship with homologous proteins of Avena satiua，Lolium perenne and other graminoids. The subcellular localization results showed that the protein located in the nucleus，and the AsGI gene was expressed in both aboveground and belowground parts. The expression of the GI gene varied at different developmental stages，as the highest level in young plants and the lowest level in senescent plants.Analysis of the expression pattrn with the treatment ofdiferent hormones and stresses showed that four hormones，IAA，6-BA， GA₃ and ABA could promote the GI gene expression. Salt stress and drought stressalso induced the expression of the GI gene.This study lays the foundation for further research on the function of GI gene.

Key Words： GIGANTEA;Agrostis stolonifera; Expression analysis; Protein localization nucleus;Salt stress; Drought stress

GIGANTEA（GI是一種植物特有的核蛋白，在植物的多種生理過程中發揮作用[1-2]。Park等[3-4]發現， GI 基因對植物響應逆境脅迫有一定的作用，如低溫、氧化、干旱及鹽脅迫等。早期研究中，Kurepa等[5]發現擬南芥中的 GI 突變體會延長開花時間，并且鹽脅迫也會對野生型植株的開花時間產生延遲。值得注意的是， GI 基因的存在能夠增強植株對鹽脅迫的耐受性。另一方面，Akram的研究揭示了棉花（Gossypiumhirsutum）中的 GI 基因具有顯著的耐鹽特性，它通過調節如SOS蛋白和NHXs這類與植物鹽堿抵抗相關的基因表達，進而影響棉花對鹽堿環境的適應能力。Cao等發現GI基因通過非依賴CBF途徑提高擬南芥植株耐寒性，研究還發現，相較于野生型擬南芥，低溫脅迫對gi-3突變體的開花時間影響更為顯著。Kim等[8發現 GI 通過SOS途徑介導了植物響應鹽脅迫。Dong等9發現GI基因調控大豆的開花時間和改變鹽脅迫耐受性。GI基因不僅在鹽脅迫下表現出強大的功能，還在其他逆境脅迫中發揮著關鍵作用。Bader等[10]研究發現通過調節ABA和 GI 相互作用響應干旱環境，揭示了植物對干旱的新應對策略。在這種情況下， GI 可能通過調節植物的水分利用效率和氣孔運動來幫助植物保持水分平衡，進一步減輕干旱脅迫對植物的影響。綜上， GI 基因的功能與作用具有多樣性和復雜性。

近十幾年，我國草坪業得到了長足發展，草坪草遺傳育種技術更是愈發受到人們廣泛關注，采用生物技術對草坪草種進行改良具有廣闊前景和重要的應用價值。植物在生長發育過程中會受到許多非生物因子的脅迫。高低溫、旱澇和高鹽堿等不良環境的非生物因子會對植物造成傷害，這些非生物脅迫因子通過影響植物的生理生化過程進而影響植物正常的生長發育，從而降低了植物的產量和品質。調查顯示，水分和土壤鹽堿化是草坪草生長的主要限制因素，我國目前也面臨著抗旱耐鹽型草坪草種稀缺的問題。通過植物基因工程技術的應用，克隆并轉化抗旱耐鹽基因，使其在草坪草中的高表達能顯著提高抗旱耐鹽草坪草新品種的選育[11]。匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）為禾本科翦股穎屬植物，是一種多年生冷季型草坪草[12]，它具有生長速度快、綠期長、耐寒、耐踐踏、耐低修剪、坪用性高、美觀等特點；其也有一些缺點，如根系較淺、不耐旱、不耐熱、不耐鹽。夏季的高溫天氣使匍匐翦股穎生長緩慢，葉片枯黃萎蔫在北京一些地區常出現“夏枯”現象，影響草坪的使用功能，增加草坪的維護成本費用[13]。本研究通過改良匍匐翦股穎的抗旱與耐鹽堿能力，不僅能優化其生長性能，還對鹽堿地的生態恢復具有關鍵意義。

GI作為廣泛存在植物體內控制GI核蛋白合成的基因，對植物生長發育過程中具有十分重要的作用，因此，有關禾本科草坪草—匍匐翦股穎的GI基因方面研究亟待補充。本試驗選取匍匐翦股穎作為研究對象，成功地從該植物中克隆出GI基因。同時，我們進行了生物信息學分析，亞細胞定位和表達水平分析，不僅為后續深入研究匍匐翦股穎 GI 基因的功能提供了寶貴的實驗材料，也有助于研究其他禾本科植物的特性，為相關領域的理論研究奠定了堅實的基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

本試驗選取的植物材料為匍匐翦股穎‘PennA4'品種，來自實驗室；大腸桿菌感受態DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR純化試劑盒購自Omega公司；DNAMarker，反轉錄試劑盒，pMD19-T克隆載體，均購自Takara公司；PCRMix購自康為世紀生物技術有限公司；植物激素ABA、6-BA、GA3和IAA購于Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1引物設計根據已知的基因序列利用PrimerPremier5.O軟件設計下列引物（表1）。設計引物GI-F和GI-R克隆目的基因全長，引物3302Y-GI-F與3302Y-GI-R用于構建亞細胞定位植物表達載體；通用引物3302Y-F和3302Y-R用于亞細胞定位載體構建檢測；引物RT-GI-F和RT-GI-R用于實時熒光定量PCR檢測；引物AsACT-F和AsACT-R用于內參基因Actin熒光定量檢測（表1）。

表1引物名稱與序列

Table1 Sequence of primer

1.2.2基因克隆采用Trizol法對匍匐翦股穎葉片的總RNA進行提取，接著將其反轉錄為cDNA。以該cDNA為模板展開PCR擴增，其反應程序設定為： 95^°C 持續5分鐘； 94^°C 保持30秒， 55^°C 維持30秒，68^°C 歷經2分鐘，進行30個循環； 72^°C 延續5分鐘；12^°C 進行保溫。把所得的PCR產物純化處理后，與載體pMD19-T進行連接，反應條件為 16^°C ，時長30分鐘。隨后將連接產物轉入大腸桿菌感受態中，再把菌液涂布于含有 50mg?L^-1 氨芐青霉素的LB固體培養基上，在 37^°C 的條件下進行過夜培養。選取單菌落進行PCR鑒定，將檢測出正確條帶的大腸桿菌送至北京睿博興科生物公司測序。通過DNAMAN進行序列比對，選取序列正確的菌液，提取質粒用于后續試驗操作。

1.2.3生物信息學分析利用DNAMAN分析該基因編碼的氨基酸序列；通過NCBI網站Blast功能進行同源比對并進行保守結構域分析，通過MEGA5.0軟件，對該蛋白與不同物種同源蛋白之間構建系統發育樹；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）網站分析理化性質；利用ProtScale （http：//ca. expasy. org/tools/protscale.htlm）網站對GI蛋白質的疏水性進行分析；利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網站判斷其跨膜區域;通過SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）網站預測其信號肽；利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page/）網站預測蛋白質的二級結構；利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）網站預測蛋白質的三級結構。

1. 2.4 GI基因的表達分析為了分析 GI 基因的組織特異性表達狀況，選取生長狀況良好的匍匐翦股穎植株，分別選取其地上部分、地下部分，幼嫩、成熟和衰老的葉片，液氮速凍后存于一 80^°C 冰箱中備用。 0.1mol?L^-1NaCl 溶液處理匍匐翦股穎樣品，用于分析 GI 基因鹽脅迫響應； 20% 聚乙二醇溶液處理匍匐翦股穎樣品，用于分析 GI 基因干旱脅迫響應。選取成熟的匍匐翦股穎植株，將 10mol?L^-1 的 IAA，10mol?L^-1 的 6-BA， 50mol?L^-1 的ABA、 50mol?L^-1 的 GA₃ 溶液分別噴施于匍匐翦股穎植株表面，并在 ^{0，0.5，1，2，4，6，8，12} 和 24h，9 個不同的時間點進行取樣[12]。對收集到的樣品進行液氮速凍處理，隨后存放在一 80^°C 冰箱中留作備用。分別提取所有樣品的RNA，并借助反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA。以RT-GI-F和RT-GI-R作為引物，開展下一步的熒光定量PCR檢測。PCR程序設定為： 95^°C 持續10分鐘； 95^°C 保持40秒， 60^°C 維持60秒，進行30個循環。每個樣品進行三次生物學重復，采用 2^-ΔΔCt 法來計算基因相對表達量[14]，運用Excel2010進行數據處理，利用SPSS26.0軟件實施單因素方差分析。

1.2.5亞細胞定位以含有GI基因的克隆質粒為模板，采用3302Y-GI-F/R引物進行PCR擴增。在50^°C 條件下，使用無縫連接酶將純化的PCR產物與經過酶切的質粒片段連接，并導人大腸桿菌感受態細胞中。將轉化后的菌液均勻涂布在含有 50mg?L^-1 卡那霉素的固體LB培養基上，于 37^°C 恒溫培養8小時。挑取單菌落進行PCR擴增。利用 CaCl₂ 凍融法，將構建好的3302Y-GI重組質粒轉入EHA105農桿菌感受態中，經過冰浴、液氮速凍、水浴及再次冰浴的處理后，加入LB溶液，在 28^°C 下振蕩培養4小時。離心去除部分上清，將剩余菌液涂布在同時含有 50mg?L^-1 利福平和卡那霉素的LB培養基上，于 28^°C 暗培養兩天，挑取單菌落，使用3302Y-F/R引物進行PCR檢測，篩選出符合預期大小條帶的產物，并送至測序公司進行測序驗證。測序結果比對正確后，將相應的農桿菌菌液保存于 -80^°C 冰箱中，以備后續使用。

將含有3302Y-GI載體的農桿菌菌液加入含有利福平和卡那霉素（均為 50mg?L^-1） 的LB溶液中，于暗環境中培養至菌液 OD₆₀₀ 值達到0.6。選用生長約1個月的健康煙草植株作為實驗對象，通過注射器將菌液注入煙草葉片的下表皮細胞。隨后，將煙草置于人工氣候箱中黑暗培養48小時。制作煙草葉片的玻片樣本，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號，以確定目標蛋白在細胞內的具體定位。

2 結果與分析

2.1 GI基因克隆

以GI-F和GI-R為引物對葡匐翦股穎cDNA進行PCR擴增，條帶清晰，長度在300Obp左右（圖1），連接T載體后，轉化大腸桿菌，將擴增出目的條帶的菌液送生物技術有限公司測序，測序結果表明所克隆的堿基序列與匍匐翦股穎 GI 基因序列一致，表明 GI 基因克隆成功，且獲得克隆載體pMD-GI。

2.2GI基因生物信息學分析

克隆獲得的 AsGI 基因編碼區長度為 3468bp 編碼1156個氨基酸。該蛋白質的相對分子質量為126.25KD，理論等電點為6.94。其正電荷殘基有111個，負電荷殘基為114個，不穩定系數為48.87，該蛋白的脂溶系數為91.29，總平均親水性值為-0.132 ，表明GI蛋白是一個親水性不穩定蛋白（圖2A）。TMHMM2.0網站預測GI不存在跨膜序列（圖2B），推測其不是分泌性蛋白。利用Signal5.0網站進行GI蛋白信號肽預測，結果顯示，GI蛋白不存在信號肽（圖2C）。二級結構預測顯示，目的蛋白含有四種二級結構， a 螺旋占 48.4% ， β- 轉角 4.24% ，延伸鏈8.05% ，無規則卷曲 39.31% 。通過SWISS-MODEL對GI蛋白質三級結構進行預測分析，結果顯示，GI蛋白主要是由螺旋和無規則卷曲構成（圖2D）。亞細胞定位預測顯示，GI蛋白位于細胞核內。

圖2GI基因結構分析

Fig.2Structural analysis of GI gene

圖1匍匐翦股穎 _GI 基因的克隆

Fig.1Cloning of GI gene from Agrostis stoloniferaL. 注：M，MB5000DNAMarker；1～4，目的基因GI Note：M，MB5000DNAMarker;1～4，Target geneGI

通過NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/last.gi）分析GI蛋白的氨基酸序列，與數據庫中GIGANTEA同源序列進行比對，構建蛋白系統進化樹，結果表明20個蛋白分成兩個亞家族，且來自同一科的GI具有較近的進化關系，如圖3所示，匍匐翦股穎GI蛋白與燕麥（AvenasatiuaL。）的同源蛋白親緣關系最近，其次是草甸羊茅（FestucapratensisHuds.）和多年生黑麥草（LoliumperenneL.），這些都屬于禾本科植物，符合植物進化的關系。同源性比對表明，匍匐翦股穎與燕麥、草甸羊茅和多年生黑麥草等物種的GI蛋白序列均具有較高的保守性（圖4）。

2.3 熒光定量表達分析

2.3.1GI基因不同部位及發育時期表達分析收集匍匐翦股穎地上和地下部分樣本，通過RT-qPCR檢測結果顯示，GI基因在地上和地下部分中均有表達（圖5）。

收集不同發育時期的匍匐翦股穎葉片，對GI基因進行RT-qPCR檢測表明， GI 基因在不同葉片發育時期存在顯著差異，幼嫩的葉片中表達量最高，成熟葉片次之，衰老葉片最低，幼嫩時期 GI 基因的表達量約是衰老時期的1.84倍（圖6）。

圖5 _GI 基因不同組織表達分析

圖6GI基因葉片不同發育階段表達分析

Fig.6Expression analysis of GI gene in different develop mental stages 注：小寫字母表示差異顯著 ?lt;0.05 ） Note：Lowercase letters indicate significant differences （ .^-0.05 ）

2.3.2GI基因對于脅迫處理及外施激素的響應對植物噴施不同的激素，分別在不同時間點取樣，進行RT-qPCR檢測。結果表明， AsGI 基因分別受到4種激素的誘導（圖7）。噴施ABA激素后， GI 基因表達水平在4h達到峰值，隨后緩慢下降，但經過24h 處理后， GI 表達水平仍呈現較高水平的增加，24h 基因表達水平約為0h的3.83倍。噴施IAA激素后， GI 基因表達水平先緩慢上升，在8h達到峰值，隨后 GI 基因表達量逐漸降低，但總體高于 ^0h 組。這些數據表明，IAA可以促進 GI 基因的表達。噴施6-BA激素后， GI 基因表達水平在6h前穩定上升， 6h 后緩慢下降，在 24h 達到峰值，約是0h的11.12倍。噴施 GA₃ 激素后， GI 基因表達水平呈現略有上升的趨勢，但整體表達水平變化不大，在 6h 的時候達到峰值，僅為 ^0h 的2.34倍，而在 24h 表達水平下降，僅為 ^0h 的1.60倍。

對于干旱和鹽脅迫處理，RT-qPCR結果表明：經過PEG處理后， GI 表達水平整體呈現先降低后升高的趨勢，在8h到達頂峰， 24h 表達水平最低，僅為 ^0h 組的 24% ，說明 AsGI 基因能夠參與鹽脅迫響應；對于NaCl處理樣品，進行RT-qPCR結果顯示：經過NaCl處理后， GI 表達水平呈現出先下降后升高再下降的趨勢，在 24h 的時候達到最低值，僅為0h的 27% ，說明AsGI基因參與響應NaC1脅迫（圖7）。

圖7不同處理下 _GI 基因的表達模式

Fig.7TheRT-qPCRof GI gene expression under different treatments

2.4 亞細胞定位

將已構建的3302Y-GI載體轉入煙草中，并在暗處培養48小時。采用激光聚焦顯微鏡觀察轉化后的煙草，記錄并分析激光信號。通過激光共聚焦顯微鏡檢測顯示：使用3302Y-GI轉化的煙草細胞，能夠在細胞核中觀察到強烈的熒光信號，而作為對照的3302Y，能夠在整個細胞中觀察到熒光信號（圖8），表明葡匐翦股穎GI蛋白定位于細胞核中。

圖8GI蛋白亞細胞定位

Fig.8Subcellular localization ofGI protein

3討論

目前植物 GI 基因在擬南芥中研究最多， GI 基因在響應逆境脅迫方面具有重要作用。近年來，從火龍果（Hylocereusundulatus）{15]，大豆（Glycinemax）[16]，小麥（Triticumaestiuum）[17]等植物中相繼克隆出同源基因，但在匍匐翦股穎植株中的研究還未見報道。本試驗克隆了GI基因，其編碼區全長3468bp ，編碼一條含有1156個氨基酸的多肽鏈。其理化性質分析表明，GI為親水性不穩定的蛋白，不含有跨膜結構，也沒有信號肽，證明GI蛋白不是分泌蛋白。通過同源比對發現匍匐翦股穎與禾本科植物燕麥關系最近，其次是黑麥草，草甸羊茅。通過亞細胞定位顯示，GI基因定位在細胞核中，這與大豆[16]，甘藍型油菜（Brassicanapus）[18]，菊花（Den-dranthema morifolium）[19]，甘 薯（Ipomoea bata-tas）[20]，番荔枝（Annona squamosa ）[21]，核桃（Juglansregia）[22]，擬南芥[23]等相關研究的結果相同，說明 GI 亞細胞定位在不同物種之間具有保守性，匍匐翦股穎 GI 基因進化關系趨于穩定，推測其具有匍匐翦股穎GI基因相似的功能。

通過RT-qPCR技術，可以定量分析 GI 基因在匍匐翦股穎不同部位和發育階段的表達水平。葉片不同發育階段的表達分析揭示了 GI 基因在不同生長階段的動態變化，這些信息對理解其在植物生長發育中的功能具有重要意義。結果顯示， GI 基因在地上部分和地下部分中均有表達，說明其廣泛存在于 GI 基因各個部位中，但不同的組織中表達量具有差異性[23]。已有研究表明，在小麥[17]、甘藍型油菜[18]、菊花[19]、甘薯[20]和棉花（Gossypium hirsutum）[24]中 GI 基因均有表達，與本研究結果一致。GI 基因在幼嫩前期的高表達可能與其促進植物生長反月有大。住祖物生長及月過性中祖物倣系扮演著十分重要的角色，不同激素對基因的響應也存在差異。通過對匍匐翦股穎植株噴施IAA，6-BA，GA₃ ，ABA，4種植物激素，探究 GI 基因對植物生長發育可能存在的影響。Bader等人[10]研究發現通過調節ABA和 GI 相互作用響應干旱環境。通過AsGI表達分析結果可知，該基因受ABA激素處理后表達量上升，說明該基因表達在受到ABA誘導后上調， GI 可能會對逆境脅迫產生響應。除了ABA激素， GI 基因與其他激素也存在相互作用[25]。結果表明IAA，6-BA， GA₃ 均能促進GI基因表達。在復雜生境下生存的植物，人們對植物如何抵御干旱，鹽堿，寒冷，氧化等非生物脅迫的分子機制開展了大量研究[26-27]，同時也獲得了大量耐逆境的基因和轉基因植株。 GI 基因在脅迫條件下的表達變化反映了其在植物適應環境脅迫中的重要功能。通過qPCR技術檢測 GI 基因在脅迫條件下的表達變化，結果顯示， GI 基因在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達顯著變化，表明它在脅迫條件下發揮重要作用。GI 基因能響應ABA激活 SOCl 和 FT/TSF 基因使植物提前開花， GI 基因是光周期信號對干旱脅迫反應的關鍵因子[28]。Checker等[29]發現 GI 基因在干旱下以GI-mRNAl72E途徑抑制WRKY44轉錄因子的表達來調控植物的耐旱特性，說明 GI 基因使植物能提高植物的非生物脅迫，參與植物的逆境反應途徑。本試驗結果與棉花[24]、柑橘（Citrusreticu-lata）[30-31]、大豆[16]、月季（Rosachinensis）[32]等研究結果相一致。 GI 基因的上調可能與提高抗氧化酶活性，減少活性氧積累有關，從而增強植物的抗逆性；而下調可能與減少能量消耗，維持細胞穩態有關[3-35]。已有研究表明，表達擬南芥的GI基因[36]，可以提高草坪草的抗旱耐鹽性。類似的，本研究通過調控匍匐翦股穎的GI基因表達，可以開發出更耐鹽更抗旱的草坪草品種，適用于鹽堿地的綠化。GI基因在環境脅迫響應中的作用使其成為抗逆性草坪草育種的潛在目標。通過分子育種或基因編輯技術，可以提高草坪草的抗旱，耐鹽等抗逆性，這對于在惡劣環境條件下維持草坪草的健康生長具有重要意義。

4結論

本研究成功克隆了匍匐翦股穎 GI 基因，并對其進行了生物信息學分析，結果表明， GI 編碼區全長為 3468bp ，編碼1156個氨基酸，無信號肽，不存在跨膜結構。亞細胞定位顯示該蛋白位于細胞核內。表達分析表明，匍匐翦股穎 GI 基因在地上和地下部分均有表達，說明其在地上和地下部分均發揮作用。其表達受IAA，6-BA， GA₃ ，ABA調節。AsGI基因同時參與NaC1脅迫和鹽脅迫響應。本研究不僅為匍匐翦股穎 GI 基因參與逆境脅迫的后續探索開啟了新視角，也從分子層面上為其他禾本科植物的基因功能筑牢了理論根基。

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（責任編輯彭露茜）