意大利黑麥草表面微生物對環境脅迫的響應

中圖分類號：S543.6 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2025）09-2873-07

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2025.09.012

Responsesof Microbeson the SurfacesofItalian Ryegrass to Environmental Stress

TANG Guo-jian1， YANG Jin-mei1，MENG Yuan-yan2， SONG Qiong-mei2， SUN Ting2， WANG Yi² ， WU Dan2*， XU Liu-xing2* （1.Liupanshui Normal University，Liupanshui，Guizhou Province 553oO4，China; 2.Zhaotong University，Zhaotong，Yunnan Province 657ooo，China）

Abstract：To investigate the responses of microbes on the surfaces of Italian ryegrass to environmental stress， this studycompared the efects offour drought stresslevels（control，mild，moderate，and severe），three ambient relative humidity（RH） （50%RH ， 70%RH ，and 90%RH） ），two temperatures （ 15^°C and 25^°C ），and three photoperiods （ 12h ， 16h ，and 22h ） on the count of microbes on the surfaces of Italian ryegrass. The results indicated that thecount of lactic acid bacteria on the surfaces of Italian ryegrassshowedafirstly significant decrease and then an increase （Plt;0.05 ，while the count of mold and yeast showed a significant decrease （ Plt; 0.05）with the extension of drought time.In contrast，increasing ambient humidity significantly increased the count of lactic acid bacteria on the surfaces of Italian ryegrass，while also increasing the abundance of other microrganisms（excluding yeast）．Except for lactic acid bacteria，the microbial quantities on the surfaces of Italian ryegrass planted at 15^°C and 25^°C were significantly different （ .Plt;0.05; .The count of lactic acid bacteriaon the surfaces of Italian ryegrass showed a trend offirst significantly increasingand then decreasing with the extension of the photoperiod，but other microbes were not significant change. In summary， 90%RH ，and a 16h photoperiod were the most favorable condition for the survival and reproduction of lactic acid bacteria，and mild drought stress reduced the count of mold and yeast on the surfaces of Italian ryegrass.

Key words：Italian ryegrass;Lactic acid bacteria;Drought stress;Photoperiods;Temperature and humidity

植物表面微生物群落構成了一個高度復雜且動態變化的生態系統1，其構成與分布不僅深受宿主植物種類的影響[，同時也顯著受制于多重環境因素，包括UV-B輻射強度、生境溫度、相對濕度（Relativehumidity，RH）以及土壤養分可利用性等[3-5]。這種復雜的雙重影響在很大程度上決定了不同宿主植物表面微生物群落的獨特生態特征。

乳酸菌作為一種至關重要的微生物類群，對植物生長具有深遠的影響。它們不僅通過調節植物根際微環境，促進土壤養分的有效利用6，還能直接或通過產生次生代謝產物間接影響植物的生長和發育[7。特別是在植物面臨環境脅迫時，乳酸菌的積極作用尤為顯著，它們能夠增強植物的抗逆性[8]，幫助植物抵御干旱、鹽堿、病蟲害等不利條件。植物表面，尤其是葉片表面，是乳酸菌與植物相互作用的重要界面。這些乳酸菌能夠形成一層生物膜9，保護植物免受外界病原體的侵害，同時促進植物對營養物質的吸收和利用。然而，盡管乳酸菌對植物生長的重要性已得到廣泛認可，但關于乳酸菌在植物表面，特別是在環境脅迫條件下的響應機制和功能的研究仍相對有限。因此，深入探究牧草表面乳酸菌群落對環境脅迫的響應，不僅有助于揭示乳酸菌與植物相互作用的復雜機制，還能為牧草的健康生長和抗逆性提升提供新的策略和思路。

鑒于此，本研究選取了意大利黑麥草（Loliummultiflorum）作為試驗對象，通過模擬干旱脅迫、濕度波動、溫度升高和光周期調整4個關鍵環境因子，對其進行相關處理后，隨機取樣并評估植株表面微生物，尤其是乳酸菌的數量，探討不同環境脅迫條件下意大利黑麥草表面微生物的分布規律，以期為了解牧草表面微生物在環境脅迫下的響應機制提供新的科學見解，從而為牧草的健康生長、抗逆性增強以及后續的加工利用奠定堅實的理論基礎和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料信息

意大利黑麥草（一年生）種子購自湖南岳陽市綠盛草業有限公司，品種為‘杰沃’，產地美國，發芽率 985% 。種子材料經 1% 次氯酸鈉溶液消毒30s后，無菌水沖洗2～3次，然后種植于裝有約 3kg 滅菌園藝土的圓形塑料花盆（口徑 24cm ，高 20cm ）中。每盆留苗8～10株，按照不同試驗目的進行日常管理。

1.2 試驗設計

1.2.1干旱脅迫試驗為了防止干旱條件下意大利黑麥草發生枯死現象，選擇同一批次種植，正處于營養生長期（株高約 70cm 的意大利黑麥草作為干旱脅迫試驗材料。首先澆足水分，并控制每盆的重量大致一致，在人工氣候箱（RXZ-50O，寧波江南儀器廠）（白天： 28^°C ， 50%RH 100% 光照 ^16h ；夜間： 25^°C，70%RH ，黑暗 8h） 中進行如下干旱脅迫處理：輕度干旱（干旱處理1d）中度干旱（連續干旱處理2d）、嚴重干旱（連續干旱處理3d），以正常澆水（每天早晚各一次，每次 200mL 無菌水）作為對照處理，每個處理3個重復。干旱脅迫處理結束，用無菌剪刀剪取植株的地上部分，剪短至 2～3cm ，混勻后裝于無菌的自封袋（ 15cm×30cm， 中，并保存于-20^°C 冰箱中作為植株表面微生物數量測定的樣品，采用稀釋平板法測定不同干旱時間處理后植株表面微生物數量。

1.2.2不同環境濕度試驗控制人工氣候箱的溫度和光照強度（白天： 28^°C ， 100% 光照 16h ；夜間：25^°C ，黑暗 8h） ，設計 50%RH，70%RH 和 90%RH 3 個不同環境相對濕度處理，每個處理6盆。待植株開始進人生殖期（ 20% 左右植株開始抽穗）后，用無菌剪刀剪取植株的地上部分，剪短至 2～3cm ，混勻后裝于無菌的自封袋（ 15cm×30cm 中，并保存于-20^°C 冰箱中作為不同環境濕度植株表面微生物數量測定的樣品。

1.2.3不同環境溫度試驗控制人工氣候箱的濕度和光照強度（白天： 50%RH，100% 光照 16h ；夜間： 70%RH ，黑暗 8h） ，設計 15^°C 和 25^°C 2個不同溫度恒溫處理，每個處理6盆。植株正常管理，待植株開始進入生殖期后，用無菌剪刀剪取植株的地上部分，剪短至 2～3cm ，混勻后裝于無菌的自封袋（ 15cm× 30cm. 中，并保存于 -20^°C 冰箱中作為不同溫度條件下植株表面微生物數量測定的樣品。

1.2.4不同光周期試驗控制人工氣候箱溫濕度條件（白天： 28^°C，50%RH ， 100% 光照 ^16h ；夜間：25^°C，70%RH ，黑暗 8h） ，設計不同光周期 （12h，16h 和 22h 的光照時間）培養植株使其進入生殖期后，用無菌剪刀剪取植株的地上部分，剪短至 2～3cm ，混勻后裝于無菌的自封袋（ 15cm×30cm 中，并保存于一 20^°C 冰箱中作為不同光周期培養植株表面微生物數量測定的樣品，每個光周期處理3個重復。同時，選取植株中部的成熟葉片中段（避開葉片基部和葉尖部分），用無菌水浸潤的無菌棉簽分別刮取同一片葉片的上表面和下表面 2～3 次，作為測定其同一葉片上表面、下表面微生物數量的樣本。每個光周期的葉片重復取4片。剪下棉簽端，并將每個光周期的所有葉片上、下表面的樣本分別低溫保存于不同的 50mL 無菌離心管中，帶回實驗室立即分析葉片上、下表面微生物數量。

1.3 測定方法

參考黃莉瑩等10描述的微生物計數方法，并略有改動。即稱取 10g 上述樣品于無菌聚乙烯塑料袋中，加入 90mL 的無菌水，置于搖床上 300r?min^-1 震蕩 5min ，用作微生物數量浸提液。而同一葉片上、下表面的樣品，直接將 10mL 的無菌水加入到裝有棉簽樣品的無菌離心管中，置于搖床上 300r?min^-1 震蕩 5min ，用作微生物計數浸提液。采用稀釋平板法進行涂布計數。搖勻后，取適量上述提取液分別涂布在營養瓊脂培養基（Nutrientagar，NA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato dextroseagar，PDA）、MRS（deManRogosaSharpe，MRS）瓊脂培養基上。30^°C 有氧培養 24h 后，統計NA培養基上好氧微生物數量； 30^°C 有氧培養4d后，統計PDA培養基上酵母菌和霉菌數量； 37^°C 厭氧培養 48h 后，統計MRS培養基上乳酸菌數量。結果轉換為 lgcfu?g^-1 FM（cfu為菌落形成單位，FM為鮮物質），可溶性糖含量采用蔥酮比色法[11-13]。總酚類化合物和游離氨基酸含量分別參照Waterman等[14]和王文平[15]推薦的方法。

1. 4 數據處理分析

試驗數據結果采用Excel2016軟件對數據進行數據統計與分析。采用SPSS19.0軟件對不同處理的指標均值進行單因素方差分析，采用Duncan法對均值進行多重比較。采用獨立樣本T檢驗對同一葉片的上、下表面的微生物數量進行均值比較。顯著水平設為0.05。用OriginPro？2020b軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1干旱脅迫對表面微生物的影響

由圖1可知，不同干旱脅迫處理意大利黑麥草后，其表面的乳酸菌數量隨著干旱程度的加劇而顯著下降，之后又顯著上升 （Plt;0.05 ，圖1a）。好氧細菌的數量隨著干旱程度的加深而呈先升高再下降又上升的趨勢（ （Plt;0.05 ，圖1b），且中度干旱脅迫下好氧細菌數量與處理前的差異并不顯著，輕度干旱與重度干旱脅迫二者間差異也不顯著。然而，干旱脅迫處理后，酵母菌和霉菌的數量均隨著干旱程度的加劇而逐漸下降，且連續干旱3d后均下降 25% 以上（圖1c-d）。此外，通過測定意大利黑麥植株主要營養成分對不同干旱脅迫的響應發現，隨著干旱脅迫程度的加深，植株組織內部的可溶性總糖、總酚類化合物和游離總氨基酸含量也越來越高，且不同處理間差異顯著（表 1，Plt;0.05） 。

表1干旱脅迫對意大利黑麥草部分化學組分含量的影響

Table1Effects of drought stress on the chemical composition contents of Italian ryegrass

2.2 環境濕度和溫度對表面微生物的影響

意大利黑麥草表面的乳酸菌數量隨著RH的增加而增加，且 90%RH 的顯著高于 50%RH 的 Plt; 0.05，圖2a），但 70%RH 處理組的乳酸菌數量與90%RH，50%RH 處理組的差異并不顯著。好氧細菌和霉菌的數量也隨著RH的增加而增加，且90%RH 與 50%RH ， 70%RH 差異均顯著 Plt; 0.05），但后二者差異不顯著（圖2b-c）。不同環境濕度條件下酵母菌的數量也隨著RH的增加而增加，但差異并不顯著（圖2d）。

圖1干旱脅迫對意大利黑麥草表面微生物數量的影響

圖2環境濕度對意大利黑麥草表面微生物數量的影響

Fig.2The microbe population on the surfaces of Italian ryegrass underdifferent ambient humidities

如表2所示， 25^°C 條件下意大利黑麥草表面乳酸菌數量略高于 15^°C 的，但二者差異并不顯著（表2）。此外，研究結果也表明 25^°C 條件下種植的意大利黑麥草表面的好氧細菌數量顯著高于 15^°C 的 （Plt; 0.05），酵母菌和霉菌也具有類似的分布規律，這表明環境溫度的變化可能會引起微生物數量的改變。

表2環境溫度對意大利黑麥草表面微生物數量的影響

Table 2The microbe population on the surfaces of Italian ryegrass under different temperatures

2.3光周期對表面微生物的影響

由圖3可知， 16h 光周期環境條件下的意大利黑麥草葉表面乳酸菌數量最高，顯著高于 22h 光周期和12h光周期的 （Plt;0.05） ，但12h和 22h 光周期生長的意大利黑麥草表面乳酸菌數量間差異并不顯著（圖3a）。好氧細菌的數量也具有類似的規律，但相互之間差異不顯著（圖3b）。此外，霉菌的數量隨著光周期的延長而略微增加，但差異并不顯著（圖3c）。22h光周期條件下意大利黑麥草表面酵母菌的數量最高， 16h 光周期的最低，但二者間差異不顯著（圖3d）。

圖3光周期對意大利黑麥草表面微生物數量的影響

Fig.3Microbe population on the surfaces of Italian ryegrass under different photoperiods

12h光周期生長的意大利黑麥草成熟葉的上表面和下表面單位面積內乳酸菌數量差異不顯著（表3）。好氧細菌具有類似的規律，但霉菌和酵母菌卻具有相反的規律。 16h 光周期條件下種植的意大利黑麥草，除其成熟葉的上表面單位面積內好氧微生物數量顯著高于下表面的外 （Plt;0.05） ，其他微生物的數量差異不顯著。

表3光周期對意大利黑麥草成熟葉上、下表面微生物數量的影響

單位：lgcfu·g^-1 FM

Table 3Microbe population on the adaxial and abaxial surfaces ofa same mature leaffrom Italian ryegrass under different photoperiods 單位：（lg cfu

3討論

3.1干旱脅迫對意大利黑麥草表面微生物的影響

在干旱脅迫對意大利黑麥草生理生態的影響過程中，本研究觀察到了一系列連鎖反應。具體而言，干旱條件首先觸發植物葉片氣孔的自然關閉機制，這一適應性變化直接削弱了光合作用效率[16]，并促使細胞內溶質積累，尤其是脯氨酸與可溶性蛋白含量的顯著提升，在這些變化共同作用下，植物體逐漸顯現出萎蔫表征[17]，本研究中意大利黑麥草干旱1d就出現萎蔫現象，隨著干旱時間延長，萎蔫現象愈發嚴重，第3d時植株已接近死亡，完全倒伏。若干旱脅迫持續且未得到及時有效的緩解，植物將面臨更為嚴峻的挑戰，即發生不可逆的水分虧損，細胞膜結構受損，導致細胞內部成分外泄，這不僅擾亂了植物正常的代謝活動，還預示著植株向死亡狀態的不可逆演進。一般而言，植物組織內部成分的外滲會增加周圍環境的養分可利用性，理論上應促進微生物群落，尤其是細菌數量的激增[18]。然而，在本研究中，有趣的是隨著干旱強度的加劇，酵母菌和霉菌的數量并未如預期般增長，反而在連續干旱3d后均顯著減少了 25% 以上。對此，本研究推測，在植物遭受嚴重水分脅迫、細胞膜完整性受損、細胞內容物外泄的情況下，好氧細菌及乳酸菌迅速利用了這些外泄的營養物質進行大量繁殖，這一快速增殖過程可能通過競爭資源或產生抑制性物質等方式，有效限制了其他類型微生物，特別是酵母菌和霉菌的種群擴張，從而在一定程度上重塑了干旱脅迫下植物表面的微生物群落結構。

3.2環境濕度和溫度對意大利黑麥草表面微生物的影響

在不同環境濕度對微生物群落的影響中，有研究發現提高環境濕度能夠增加植物表面的水活度，從而優化微生物對水分和營養物質的利用效率，進而促進微生物的快速繁殖[19-20]。然而，在本研究中，不同微生物對環境濕度的響應并非完全一致，這可能是它們對水分需求和滲透壓承受能力的差異所導致的[21]。因此，盡管總體上提高環境濕度有利于增加微生物的數量，但不同微生物種群的增長速度和變化規律卻呈現出顯著的差異。

溫度作為影響植物新陳代謝活動的關鍵因素之一，其變化必然會對植物的生長狀況產生深遠影響[22]。相應地，環境溫度的波動也會引起植物表面微生物數量的變化[1。本研究發現 25^°C 條件下意大利黑麥草表面的乳酸菌數量略高于 15^°C 條件下的數量，但這一差異并未達到統計學上的顯著水平。這與Chen等[23的研究結果存在不一致之處，可能是由于所選取材料的生長時期不同，本研究所選材料時接近孕穗期，而Chen等[23的研究材料處于開花期。盡管如此，本研究結果仍表明，環境溫度的變化確實可能對微生物群落結構產生一定影響，如好氧細菌、酵母菌和霉菌。特別是在 25^°C 條件下種植的意大利黑麥草表面，好氧細菌的數量顯著高于 15^°C 條件下的數量（ ?Plt;0.05） ，酵母菌和霉菌也表現出類似的分布規律。這些結果進一步證實了環境溫度在塑造植物表面微生物群落結構方面的重要作用。

3.3光周期對意大利黑麥草表面微生物的影響

在本研究中， 16h 光周期條件下的意大利黑麥草可能需要更長的時間進入生殖生長時期，這為其葉表面微生物的繁殖和生長提供了更長的時間窗口（表4）。此外，這一光周期條件下的意大利黑麥草葉片長度較長，這可能為微生物的繁殖提供更多的空間和營養[24]，從而更有利于乳酸菌的生長。當光周期延長至 22h 時，本研究發現同一成熟葉的上表面單位面積內微生物數量普遍低于下表面，這一差異在除霉菌外的其他微生物中均達到了顯著水平 （Plt;0.05） ，甚至好氧細菌的數量差異達到了極顯著水平 （Plt;0.01） 。這一結果表明長時間的光照顯著地減小了意大利黑麥草葉片面積（表4，可能顯著改變了意大利黑麥草葉片表面的蠟質晶體形態，使得上表面變得更加疏水[25]。這種疏水性的增加可能導致營養物質的滲出變得更加困難，從而使得微生物在高度疏水的葉表面存活面臨著更大的挑戰[26-27]。這發現不僅增進了學者對光周期如何影響植物葉表面微生物群落結構的理解，也為未來的相關研究提供了新的視角和思路。

表4不同光周期條件下的意大利黑麥草植株特性

Table4The plant characteristics of Italian ryegrass under different photoperiods

4結論

干旱脅迫對意大利黑麥草表面乳酸菌數量的影響呈U型趨勢，即隨著干旱脅迫的加劇，意大利黑麥草植株表面乳酸菌數量呈先顯著下降而又顯著上升的趨勢，而其表面霉菌和酵母菌數量隨干旱加劇而下降。增加環境相對濕度顯著增加了意大利黑麥草表面乳酸菌數量，并促進了其他微生物（除酵母菌）的增長。延長意大利黑麥草的光周期，其表面乳酸菌數量呈先增后減的趨勢，而其他微生物數量受光周期的影響不顯著。 12h 和 16h 光周期環境下種植的意大利黑麥草成熟葉上、下表面乳酸菌數量相近，但種植在 22h 光周期下的葉片上表面乳酸菌數量顯著低于下表面的。綜上所述， 90%RH，16h 光周期最適宜意大利黑麥草表面乳酸菌的生存和繁殖，輕度干旱脅迫有助于降低其霉菌和酵母菌的數量。

參考文獻

[1]TRIVEDIP，BATISTABD，BAZANYKE，etal.Plantmicrobiome interactions under a changing world：responses， consequences and perspectives[J].New Phytologist，2O22，234 （6）：1951-1959

[2]TANGGJ，XULX，WANG XY，et al.Effects of leaf morphological and chemical properties on the population sizes of epiphytes[J].Microbial Ecology，2023，85（1）：157-167

[3]VANHAELEWYN L，VAN DER STRAETEN D，DE CONINCK B，et al. Ultraviolet radiation from a plant perspective：The plant-microorganism context[J].Frontiersin Plant Science，2020，11：597642

[4]ZHU YG，XIONG C，WEI Z，et al. Impacts of global change on the phyllosphere microbiome[J].New Phytologist，2022， 234（6）：1977-1986

[5]GRIFFINEA，JOSEPHWRIGHTS，MORINPJ，etal.Per vasive interactions between foliar microbes and soil nutrients mediate leaf productionand herbivoredamageina tropical forest [J].New Phytologist，2017，216（1）：99-112

[6]YANGX，YANGL，SHIY，etal.Analysis of exogenous lactic acid bacteria on growth and developmentof different herbaceous peony varieties and rhizosphere soil nutrients[J].Chemical and Biological Technologies in Agriculture，2023，10（1） ：144

[7]JAFFAR N S，JAWANR，CHONGKP.The potential of lacticacid bacteria in mediatingthe control of plant diseasesand plant growth stimulation in crop production-A mini review[J]. Frontiers inPlantScience，2023，13：1047945

[8]LAMONTJR，WILKINSO，BYWATER-EKEGARDM，et al.From yogurt to yield：Potential applicationsof lacticacid bacteria in plant production[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2017，111：1-9

[9]MGOMIFC，YANGY，CHENGG，etal.Lactic acid bacteria biofilms and their antimicrobial potential against pathogenic microorganisms[J].Biofilm，2023，5：100118 [10］黃莉瑩，崔衛東，田靜，等．大豆秸和稻草對甜玉米秸稈和濕 啤酒糟混合青貯的影響[J].草地學報，2024，32（3）：945-951

[11] DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON JK，et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356 [12］周雨歆，楊丹，楊偉濤，等．黃梁木葉精油對柱花草和水稻秸稈發酵 品質及細菌群落的影響[J].草地學報，2024，32（10）：3326-3334

[13]高誠澤，趙璐潔，陳瑋瑋，等．不同添加量葡萄渣對苜蓿青貯 發酵品質及CNCPS蛋白組分的影響[J]．草地學報，2024，32 （6）：1986-1994

[14]WATERMAN P，MOLE S.Analysis ofphenolic plant metabolites[M].Oxford：Blackwell Scientific Publication，

1994：66-103 [15］王文平．植物樣品中游離氨基酸總量測定方法的改進[J].北 京農學院學報，1998，13（3）：9-13

[16]CHEN Z C，LI S，WAN XC，et al. Strategies of tree species to adapttodroughtfromleaf stomatalregulationand stem embolismresistance to root properties[J].Frontiers in Plant Science，2022，13：926535

[17]GAO P，MA Y H.Response mechanism of plants to drought stress[J]. Plant Diseases and Pests，2023，14（5）：30

[18]HUANG SL，ZHA XJ，FU G. Affecting factors of plant phyllosphere microbial community and their responses to climatic warming—AReview[J].Plants，2023，12（16）：2891

[19]AUNG K，JIANGYJ，HE SY.The role of water in plant microbe interactions[J]. The Plant Journal，2Ol8，93（4）：771-780 [20]LAXS，CARDONAC，ZHAOD，etal.Microbial and metabolic succession on common building materials under high humidity conditions[J]. Nature Communications，2Ol9，10（1）：1767 [21] BRANGARi A C，MANZONI S， ROUSK J. The mechanisms underpinning microbial resilience to drying and rewetting-A model analysis[J].SoilBiologyand Biochemistry，2021，162：108400 [22]LIYQ，KONGDX，FUY，et al.The effect of developmental andenvironmental factorsonsecondarymetabolitesinmedicinal plants[J].Plant Physiology and Biochemistry，202O，148：80-89 [23] CHEN X，DONG Z，ZHANG J. Spraying sugars， growth temperatures and N application levels change epiphytic lactic acid bacteria composition on Italian ryegrass[J]. Grassand Science，2022，68（2）：145-154 [24]KEMBEL SW，O'CONNOR TK，ARNOLDHK，et al. Relationships betweenphyllosphere bacterial communities and plant functional traits in a neotropical forest[J]. Proceedings of theNational Academy of Sciences of theUnited Statesof America，2014，111（38）：13715-13720 [25]KOCHK，ENSIKAT HJ. The hydrophobic coatings of plant surfaces：epicuticular wax crystalsand their morphologies，crystallinity and molecular self-assembly[J].Micron，2008，39（7）：759-772 [26]BHAT K U，BHAT PANEMANGALORE D. Microbes - surfaces interactions[J].Application of Microbes in Environmental andMicrobial Biotechnology，2O22：473-499 [27]TANG G J，XU L X，YIN X，et al. Microbial colonization on the leaf surfaces of different genotypes of napier grass[J]. Archives ofMicrobiology，2021，203（1）：335-346

（責任編輯付宸）