花煙草（Nicotianaalata）葉綠素酶基因NalaCLH2的克隆與表達模式分析

中圖分類號： S682.1⁺9：（2785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）08-0015-09

AbstractChlorophylase facilitates the first step of chlorophyll degradation and play key roles in the senescence of leaves，flowering and fruit ripening.To elucidate the function of chlorophyllase2（CLH2）gene in Nicotiana alata，the homologous cloning method was used to clone CLH2 gene from Nicotiana alata and the bioinformatics analysis was conducted.Furthermore，real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the tissue-specific expression of this gene and the expression characteristics of Nicotiana alata seedlings treated with abiotic stresses and different hormones.The results showed that the open reading frame （ORF）of NalaCLH2 was 960bp （GenBank accession number as PP445034） encoding 319 amino acids. The NalaCLH2 protein had the molecular weight as and the theoretical isoelectric point as 6.75，and it was a stable non-transmembrane non-secretory protein mainly located in chloroplasts.NalaCLH2 was a hydrophilic protein containing chlorophyllase2 conservative domain but without signal peptide and transmembrane structure.Tissue-specific expresion analysis showed that NalaCLH2 gene was expressed in the roots （taproots and lateral roots），stems （upper，middle and lower stems），leaves （upper and lower leaves）and flowers （calyces and petals）of Nicotiana alata，but its expression level was the highest in calyx and the lowest in petal.NalaCLH2 gene was upregulated by low temperature，abscisic acid （ABA），gibberellic acid （GA） and methyl jasmonate （MeJA）induction，while NaCl，drought and brassinolide（BR） inhibited its expression.These results of this study could provide a basis for further analysis of the function of NalaCLH2 gene in abiotic stresses and hormone signal transduction pathway of Nicotiana alata.

KeywordsNicotiana alata; Chlorophyllase2; Gene cloning； Expression pattern analysis

花煙草（NicotianaalataLinketOtto）為茄科（Solanaceae）煙草屬（NicotianaL.）有限的多年生草本植物之一，原產阿根廷和巴西[1]，其形態和花型與其他煙草屬植物有較大差異，染色體數目少（ 2n=18 ），是組織培養和體細胞雜交的有用材料[2-4]。花煙草花色絢麗豐富且花期較長[5]，不僅是一種重要的觀賞和園藝植物[6-7]，而且是研究配子體自交不親和性（self-incompatibility，SI）的重要模式生物[7-8]。葉綠素酶（chlorophyllase或chlase，簡稱CLH，EC3.1.1.14）是植物葉綠素降解途徑中具有關鍵性作用的一個酶。葉綠素酶可催化水解葉綠素生成脫植基葉綠素（chloro-phyllide或chlide）和植醇（phytol）9」，而脫植基葉綠素、植醇及其衍生物可用于生物技術和制藥工業[10]。此外，葉綠素酶的催化活性在食品工業、糧油工業和煙草工業也具有廣闊的應用前景。

目前，關于葉綠素酶基因的研究主要集中在擬南芥（Arabidopsisthaliana）上。擬南芥基因組編碼兩個葉綠素酶基因，即AtCLHI和AtCLH2，其中AtCLH1又名擬南芥冠菌素誘導蛋白1（A.thaliana coronatine-induced protein 1）基因 ATH-CORI。Benedetti等[]研究表明，ATHCOR1在擬南芥幼苗、成熟葉、花和長角果中均有表達，但根中未檢測到有表達;此外，該基因表達受茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和傷害的快速誘導。Tsuchiya等[12]研究表明，擬南芥AtCLH1表達受MeJA處理快速誘導，而AtCLH2對MeJA沒有響應；Schenk等[13]研究表明，AtCLH1和AtCLH2對擬南芥衰老相關的葉綠素分解不是必需的；Liao等[14]研究表明，擬南芥AtCLH2為一種典型但可能獨特的葉綠素酶基因。Zhou等[i5]研究表明，抑制AtCLH1的表達導致葉綠素 a/b 值降低，但不影響葉片衰老過程中葉綠素降解的速率。 Hu 等[16]對AtCLH2的亞細胞定位揭示其不參與衰老過程中的葉綠素降解。Tian等[17]的研究表明，AtCLH1通過促進FtsH-介導的D1降解在光系統Ⅱ修復中保護幼葉免受長期光損傷。除擬南芥外，CLH在藜（Chenopodiumalbum）[12]、瓦倫西亞橙（Citrus sinensis cv.Valencia）[18]、小麥（Triticumaestivum）[19]、鮮切西蘭花（Brassica oleracea var.italica）[20]、奇趣發財樹（Pachira macrocarpa）[21]萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）[22]、玉米（Zea mays）[23]、甘薯（Ipomoea batatas）[24]、尖細顫藻（Oscillatoria acuminata PCC 6304）[25]、番茄（Solanum lycopersicum）[26] 茶樹（Camellia sinen-sis）[27]、胡楊（Populus euphratica）[28]等植物中也已被克隆到。

就煙草屬植物而言，趙晨穎等[29-30]以普通煙草（Nicotianatabacum）與其祖先種及重要野生種為研究對象，開展了葉綠素酶基因CLH的克隆與生物信息學分析及其應用評價等工作。但至今尚未見有關花煙草葉綠素酶基因CLH的研究報道，因此，本研究利用RT-PCR技術克隆了花煙草葉綠素酶2基因（NalaCLH2），對其進行生物信息學分析，并對其在花煙草不同器官或組織部位及不同非生物脅迫和不同激素處理幼苗后的表達進行分析，以期為今后深入研究該基因在非生物脅迫（特別是低溫脅迫）和不同激素（尤其MeJA）信號傳導途徑中的功能奠定基礎。

材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試花煙草（Nicotianaalata）為白花品種，由輕工業大學煙草生理生化實驗室保存。2023年8月將花煙草種子直播入盆土中，并置于恒溫培養室中培養（培養條件：光照為 16h 光 ^′8h 暗，溫度為 25^°C ，相對濕度 60% ）。

試驗處理及樣品采集： ① 于2023年10月至11月分別對正常生長的花煙草主根、側根、上莖、中莖、下莖、上部葉、下部葉及盛花期的花瓣、花萼進行取樣，檢測NalaCLH2基因在不同器官或組織中的相對表達量。 ② 選取生長 40d 的花煙草苗，去除根部土壤，模擬干旱條件，檢測NalaCLH2基因在干旱脅迫條件下的表達情況；向幼苗期的花煙草葉片噴灑濃度為 200mmol/L 的NaCl溶液，進行高鹽處理;將花煙草幼苗置于 4^°C 培養箱中，進行低溫處理;向幼苗期的花煙草葉片分別噴灑脫落酸（ ABA，50μmol/L ）、赤霉素（ GA，20mg/L? 小茉莉酸甲酯（MeJA， 100μmol/L ）和油菜素內酯（ ），進行不同激素處理。每處理重復3次，取樣時進行3次生物學重復。分別在處理后第 0.3AA，6.12h 采集整株樣品，放人液氮中速凍 1min 后置于 -80^°C 冰箱中保存備用。

第一鏈cDNA合成試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTARMaxPremix高保真聚合酶，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；TaqPCRMasterMix，購自生工生物工程（上海）股份有限公司； 2× SYBR Green qPCR Mix，購自北京密碼子生物科技有限公司；克隆載體pEASY-Blunt-Simple、感受態細胞Trans1-T1，購自北京全式金生物技術股份有限公司。引物合成和測序由河南尚亞生物技術有限公司完成。

1.2 NalaCLH2基因克隆及分析方法

1.2.1 花煙草總RNA提取及cDNA第一鏈的合成取花煙草幼苗約 100mg ，于液氮中快速研磨，使用實驗室自主研發的RNA提取試劑盒從樣品中提取總RNA。按照cDNA合成試劑盒操作說明書，將提取的RNA反轉錄成cDNA

1.2.2 NalaCLH2基因的克隆 借助PrimerPremier5軟件設計特異性引物（表1）進行高保真PCR反應。反應體系為：模板cDNA 1μL ，Prime-STAR Max Premix （2×）12.5μL ，正、反向引物各1μL ，加入 ddH₂O 使總體積達 25μL 。反應程序為： 98^°C 預變性 5min;98^°C 變性 10s，55‰ 退火15 s， 72^°C 延伸 1min ，35個循環； 72^°C 延伸10min 。取 5μL 高保真PCR產物，用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將條帶正確的高保真PCR產物與pEASY-Blunt-Simple克隆載體連接，轉化Trans1-T1感受態細胞，次日挑陽性克隆進行菌液PCR鑒定。將含有目的片段的克隆菌液交由北京六合華大基因科技有限公司測序，測序引物為通用引物 M13F。

表1本研究所用引物序列

1.2.3NalaCLH2基因的生物信息學分析 利用DNAMAN軟件進行多序列比對分析；利用Prot-Param分析蛋白的理化特性；利用ProtScale對蛋白的親/疏水性進行分析;利用TMHMM對蛋白跨膜結構進行預測；利用SignalP5.0Server進行信號肽預測；利用SMART對功能域進行預測；利用WoLFPSORT和Plant-mPLoc進行蛋白質亞細胞定位分析；利用SOPMA和SWISSMODE分別預測和分析蛋白的二級結構和三級結構；利用NetPhos對蛋白質磷酸化位點進行分析;利用E-CRISP預測NalaCLH2的基因編輯位點；借助MEGA7軟件，采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統進化樹。各分析軟件網站見表2。

表2生物信息學分析所用網站

1.2.4NalaCLH2 基因的表達模式分析根據NalaCLH2基因序列設計實時熒光定量PCR引物，引物序列見表1，以花煙草的18SrRNA作為內參基因進行基因表達分析。反應體系為：模板cDNA 2.5μL ，正、反引物各 1μL ，2× SYBR GreenqPCR Mix 7.5μL，ddH₂O8μL ，共計 20μL 。反應程序為 ：95%3min;95%10s，60%30s ，循環45次 95^°C15s，60^°C60s，95^°C15s ，生成熔解曲線。設置3次重復，根據相對定量法 （2^-ΔΔCt） ）計算NalaCLH2基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 花煙草總RNA的質量檢測

將提取的花煙草幼苗總RNA經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖1，表明提取的RNA純度較高，28S和18S條帶清晰可見，無拖尾和明顯降解，能滿足實驗要求。

2.2 NalaCLH2基因克隆

以反轉錄合成的cDNA第一鏈作為模板，進行高保真PCR擴增，得到預期條帶（圖2A）。將高保真PCR產物連接到pEASY-Blunt-Simple克隆載體上，連接產物轉化Trans1-T1感受態細胞，挑陽性克隆進行菌液PCR驗證，結果顯示目標條帶大約 960bp ，表明準確克隆到目的基因（圖2B）。

M為Trans2KDNA分子量標準；泳道1為花煙草總RNA電泳條帶。

圖1花煙草總RNA電泳圖譜

圖2花煙草NalaCLH2基因克隆

M為Trans2KDNA分子量標準;A圖中1為高保真PCR擴增產物的電泳結果；B圖中1～4為抗性平板上所挑選的4個陽性克隆的PCR鑒定結果。

2.3 NalaCLH2基因的生物信息學分析

2.3.1NalaCLH2蛋白的理化性質利用Prot-Param在線工具對NalaCLH2蛋白進行理化特性分析，結果（表3）顯示，該蛋白的分子量約為34.59kDa ，氨基酸數為319個，理論等電點為6.75，不穩定系數為39.24，是一個穩定蛋白；親水性平均值為-0.002，結合ProtScale在線軟件分析結果（圖3），推測其屬于親水性蛋白。

表3NalaCLH2蛋白的特征參數

2.3.2NalaCLH2 蛋白的二級和三級結構利用SOPMA在線分析軟件對NalaCLH2的二級結構進行預測，結果（表4、圖4A）表明，其二級結構組成與其他煙草屬物種中的直系同源蛋白類似，均以無規則卷曲和 ∝ -螺旋為主，少量延伸鏈和 β- 轉角則散布于整個多肽鏈中；就花煙草NalaCLH2蛋白而言， α- 螺旋占 22.57% ，延伸鏈占 20.06% ，β -轉角占 5.33% ，無規則卷曲占 52.04% 。

利用SWISS-MODEL對NalaCLH2蛋白進行3D結構模擬，結果表明NalaCLH2結構與模板序列相似性為 95.91% ，GMQE得分為0.93，其三級結構含有豐富的無規則卷曲和 α- 螺旋（圖4B），這與二級結構預測的結果一致。

圖3NalaCLH2蛋白親/疏水性預測

表4煙草屬不同物種CLH2蛋白二級結構組成

2.3.3NalaCLH2蛋白的信號肽及跨膜區通過SignalP5.0Server在線軟件分析發現NalaCLH2蛋白沒有信號肽，表明該蛋白是一種非分泌蛋白；利用TMHMM在線軟件預測其蛋白跨膜結構域，結果顯示其不含有跨膜結構，是非跨膜蛋白類型。

2.3.4 多序列比對和進化分析從NCBI（ht-tps：//www.ncbi.nlm.nih. gov/） 和 SGN（https：//solgenomics.net/）下載獲得與NalaCLH2直系同源的植物CLH2序列，包括普通煙草K326（Nicotianatabacum cv.K326）NtabCLH2、林煙草（Nicotianasylvestris）NsylCLH2、絨毛狀煙草（（Nicotiana tomen-tosiformis）NtomCLH2、漸狹葉煙草（Nicotiana at-tenuata）NattCLH2、馬鈴薯（Solanum tuberosum）StCLH2、番茄（Solanum lycopersicum） SlCLH2 和棘椒（Capsicum annuum） CaCLH2。利用 DNAMAN軟件將它們與NalaCLH2蛋白進行多序列對比，結果（圖5）發現，NalaCLH2與K326的NtabCLH2一致性最高，為 96.87% ;與同屬的林煙草NsylCLH2和絨毛狀煙草NtomCLH2一致性分別為 96.24% 和 95.92% ，而與漸狹葉煙草NattCLH2一致性為95.61% 。此外，NalaCLH2與茄科植物馬鈴薯StCLH2、番茄SICLH2和辣椒CaCLH2一致性分別為 86.88%.83.44% 和 79.81% 。

圖4NalaCLH2的二級與三級結構預測

紅框為chlorophyllase2結構域;花煙草NalaCLH2具有chlorophyllase2典型結構域。

利用MEGA7軟件采用NJ法構建系統發育樹，結果（圖6）表明，NalaCLH2與K326Ntab-CLH2親緣關系最近，與同屬的林煙草NsylCLH2、漸狹葉煙草NattCLH2、絨毛狀煙草NtomCLH2和本氏煙草NbenCLH2處于同一個進化分支上。

2.3.5NalaCLH2的亞細胞定位及磷酸化位點由亞細胞定位分析結果可知NalaCLH2蛋白主要定位于葉綠體中。磷酸化位點預測發現該蛋白中存在20個潛在磷酸化位點，其中絲氨酸11個、蘇氨酸8個、酪氨酸1個（圖7），表明在花煙草體內，NalaCLH2極有可能被絲氨酸蛋白激酶、蘇氨酸蛋白激酶和絡氨酸蛋白激酶通過磷酸化修飾激活，從而調控二級響應基因的表達，

2.3.6 NalaCLH2基因編輯位點分析運用E-CRISP在線網站進行靶標設計，以NGG為原間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列設計該基因的CRISPR/Cas9基因編輯靶位點從設計結果中選擇了GC含量適中、脫靶率較低的位點，見表5。

圖7NalaCLH2磷酸化位點預測結果

表5NalaCLH2基因編輯靶位點

2.4NalaCLH2基因的表達模式分析

2.4.1NalaCLH2在花煙草不同組織中的表達分析實時熒光定量PCR分析結果（圖8）顯示，不同組織中的NalaCLH2表達量表現為花萼gt;下部葉gt;主根gt;上莖 gt; 中莖gt;上部葉gt;側根gt;下莖gt;花瓣，在花萼中的表達量分別是花瓣中表達量的21.27倍、下莖中表達量的13.59倍、側根中表達量的13.04倍、上部葉中表達量的5.24倍、中莖中表達量的4.55倍、上莖中表達量的4.11倍、主根中表達量的3.36倍、下部葉中表達量的1.38倍。

圖8NalaCLH2在花煙草不同組織中的相對表達量

2.4.2NalaCLH2在非生物脅迫下的表達分析運用實時熒光定量PCR技術分析了NalaCLH2在NaCl（200mmol/L）干旱和低溫（ 4% ）處理下的表達量，結果（圖9）顯示，在NaCl處理下，Nala-CLH2的相對表達量隨處理時間的延長變化不顯著，總體下降，在處理 ³h 時降至最低，僅為對照（24號 （0h） 的 51% ;在干旱處理下，NalaCLH2的相對表達量一直處于下降趨勢，在處理 ^12h 時降至最低，約為對照的 9% ；在 4^°C 低溫處理 ³h 時，Na-laCLH2的表達量達到最高，為對照的9.61倍。

圖9NalaCLH2在非生物脅迫下的相對表達量

*、**、***分別表示各非生物脅迫處理不同時間的相對表達量與對照 （0h） 間差異達到 0.05，0.01，0.001 顯著水平。

2.4.3NalaCLH2在不同激素處理下的表達分析運用實時熒光定量PCR技術對NalaCLH2在ABA （ 50μmol/L ）、GA（ 20mg/L ）、MeJA（100μmol/L 和BR（ 1μmol/L ）處理下的表達量進行分析，結果（圖10）顯示， NalaCLH2 的表達量均在ABA、 .GA，MeJA 處理 3h 時達到峰值，分別為對照（0h） 的2.58、3.84倍和3.33倍；而在BR處理 ^3h 時，NalaCLH2的表達量最低，約為對照的 45% 。

圖10NalaCLH2在不同激素處理條件下的相對表達量

*、**、***表示各激素處理不同處理時間的相對表達量與對照 （0h） 間差異達到 0.05，0.01，0.001 顯著水平。

3討論

CLH 是最早發現于植物和綠藻中的酶之一，長期以來它被認為是第一個參與葉綠素降解的酶[31]，因而備受關注。大量研究表明，在外源刺激如溫度[32]、高鹽[28]、傷害[11，33]以及病蟲害[23]等條件下，植物CLH基因的表達和CLH的活性會發生明顯變化。

Chaumpluk等[32]的研究結果顯示，鮮切西蘭花的CHL基因在 27^°C 貯藏3d后表達量最高，而在 4°C 貯藏 3d 后表達量最低。本研究發現，在4°C 低溫脅迫下，NalaCLH2的相對表達量先急劇上升后顯著下降，表明其轉錄水平的表達可能受低溫脅迫的調控。在不同激素處理條件下，ABA、GA和MeJA處理 ³h 內，NalaCLH2的相對表達量快速上升，之后又快速下降；而在BR處理下， 3h 時其表達量最低， 6h 時最高。這表明NalaCLH2可能以不同的方式參與ABA、GA、MeJA和BR激素的信號傳導。然而，Tsuchiya等[12]研究則發現AtCLH2對MeJA并無響應。上述結果暗示不同物種中CLH2基因在植物生長和發育過程中的表達模式和功能可能存在差異。

截至目前，與CLH相關的其他重要問題仍然存在。對CLH的研究大多集中在葉片衰老、果實成熟和葉綠素降解方面，如何通過遺傳工程調控CLH活性來改善農作物的抗逆性、營養價值或產量仍有待進一步探索。此外，對CLH在不同植物物種中進化歷程和功能的差異以及CLH表達與CLH活性如何受植物內部信號（如激素信號）和外部環境因素（光周期、溫度變化等）的精確調控的研究仍較為有限。而這些研究不僅能增進對CLH功能的理解，還可能對現代農業生產、植物資源保存與管理提供重要支持。

4結論

本研究從花煙草中克隆得到NalaCLH2基因，其核心編碼區序列（GenBank登錄號為PP445034）全長為 960bp ，編碼319個氨基酸，定位于葉綠體，為親水性、非跨膜、非分泌蛋白，且為穩定蛋白；具有chlorophyllase2典型結構域。該基因在花煙草的根（主根和側根）、莖（上莖、中莖和下莖）葉（上部和下部葉）和花（花萼和花瓣）中均有表達，但其表達量在花萼中最高、在花瓣中最低。NalaCLH2可受短時低溫、ABA、GA和Me-JA處理誘導上調表達，而 NaCl 、干旱及 BR則抑制該基因的表達。這為今后深人研究NalaCLH2基因在花煙草非生物脅迫（特別是低溫和干旱）及激素信號傳導途徑中的作用奠定了基礎。

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