‘金如意’山楂葉綠體基因組特征與系統進化分析

中圖分類號：S661.5：Q784 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）08-0024-11

AbstractUsing the leaves of Crataegus pinnatifida Bge.var. major Jinruyi as materials，the complete chloroplast genome sequence was sequenced，assembled and analyzed by Illumina high-throughput sequencing technology in this study.The phylogenetic analysis was also conducted on the chloroplast genomes of 34 Rosaceae species. The results showed that the complete chloroplast genome of C . pinnatifida Bge. var. major Jinruyi was 159 655 bp in length with the GC content of 36.65% ，and contained a large single copy （LSC） region of 87748bp ，a smallsingle copy（SSC） region of 19 139 bp and a pair of inverted repeats （IR） regions of 26 384 bp. A total of 130 genes were encoded，including 85 protein-coding genes，37 tRNA genes，and 8 rRNA genes.A total of 264 SSR loci and 57 repeats were detected by repeat analysis with most SSR loci consisting of A- and T-repeat bases. There were 31 high-frequency codons （RSCU gt;1 ），29 of which ended with A/U. Compared with other Rosaceae species， the IR region boundary of the C . pinnatifida Bge. var. major Jinruyi chloroplast genome was relatively conserved. The phylogenetic analysis showed that C ： pinnatifida Bge. var. major Jinruyi was most closely related to C ： pinnatifida var. major（GenBank No. NC_O65486.1） ，indicating that it belonged to the large-fruit hawhorn type.These findings could laya foundation for the identification of hawthorn germplasm resources，the analysis of genetic diversity，and the utilization of hawthorn resources.

KeywordsCrataegus pinnatifida Bge. var. major Jinruyi； Chloroplast genome； Phylogenetic analysis

山楂（Crataeguspinnatifida）屬于薔薇科桃亞科山楂屬落葉喬木或灌木，廣泛分布于亞洲、歐洲、北美洲及南美洲北部等地區。作為藥食同源的果品，山楂富含黃酮類、萜類、有機酸類、多糖類等多種活性成分，具有健胃消食、調節免疫、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等功效，廣泛應用于鮮食、加工及大健康領域[1-3]。我國是山楂屬植物的起源中心之一，種質資源豐富，栽培歷史悠久，共有20個種、7 個變種和1個變型[4-5]。山楂屬植物普遍存在多倍化、無融合生殖、基因滲入等現象，使其表型變異豐富，為山楂屬植物的傳統分類與鑒定帶來困難[6]

葉綠體是植物和藻類進行光合作用的場所，其基因組大都為雙鏈環狀DNA，能自主編碼遺傳信息并傳遞基因，是代謝活躍的半自主細胞器[7-9]。葉綠體基因的功能元件，如啟動子、同源區域、調控元件、選擇標記和重要的轉基因整合位點已用于遺傳轉化和基因編輯研究[10]。隨著高通量測序技術的快速發展，基于組學數據通過系統進化分析確定物種之間的親緣關系，成為分子演化及系統發育學領域的重要研究手段[11]。與細胞核基因組相比，葉綠體基因組具有結構簡單穩定、序列保守、進化速度緩慢等特點，是研究種間甚至種內材料系統進化和親緣關系的理想工具，廣泛用于植物不同分類水平的系統發育及物種鑒定等研究[12-13]。高守輿等[14]對白羊草（Bo-thriochloaischaemum）葉綠體基因組密碼子進行分析，解析了白羊草及其近緣物種的系統發育關系，為孔穎草屬植物系統發育研究提供參考；胡賽文等[15]對蕊蓄（Polygonum aviculare）進行了葉綠體基因組測序，并對蕊蓄及19種近緣植物的葉綠體基因組序列進行了系統發育分析。此外，在蘋果[16]、杜梨[17]、草莓[18]等多個物種中也完成了葉綠體基因組測序和分析。在山楂屬葉綠體基因組研究方面，趙振寧等[19]對包含云南山楂（Cratae-gusscabrifolia（Franch.）Rehd.）在內的11種山楂屬植物葉綠體基因組進行分析，發現山楂屬植物葉綠體基因組結構保守，未發現基因倒置和重排現象;Zhang等[20]組裝并分析了伏山楂（CrataegusbretschneideriC.K.Schneid.）和相關物種的葉綠體基因組和核序列，揭示了伏山楂和相關物種的種間關系。因此，進一步開發和利用山楂屬葉綠體基因組，全面了解葉綠體基因組及其在系統進化中的作用，對深人開展山楂種質資源鑒定和遺傳多樣性研究具有重要意義。

‘金如意’山楂（Crataegus pinnatifida Bge.var.majorJinruyi）是從‘小黃紅子'野生山楂芽變中選育出的早熟鮮食黃色山楂新品種[21]，目前其分類地位尚不明確。本研究以‘金如意’山楂葉片為材料，利用Illumina高通量測序技術進行葉綠體基因組測序，并對測序結果進行組裝和注釋，進而分析葉綠體基因組的序列特征、重復序列、密碼子偏好性、反向重復序列（invertedrepeats，IR）邊界特征和間隔區信息位點等特征，并與34種薔薇科植物葉綠體基因組進行系統進化分析，旨在明確‘金如意'山楂葉綠體基因組的結構特征，為山楂種質資源鑒定、系統發育分析和資源開發利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1 材料

‘金如意'山楂葉片采集于省臨沂市費縣大門山山楂研究所基地。34種薔薇科植物的葉綠體基因組序列下載于NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/），詳見表1。

1.2 葉綠體基因組測序與分析

1.2.1 DNA提取和高通量測序采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取‘金如意’山楂葉片總DNA。利用Illumina 公司NovaSeq 600O 測序平臺進行雙端（pairend，PE）測序，使用Fastp（vO.20.O）軟件對原始數據進行過濾，獲得高質量的Clean data，用于后續拼接和注釋。

表1用于本研究的薔薇科植物葉綠體基因組序列

1.2.2 葉綠體基因組序列拼接和注釋 使用SPAdesv3.10.1軟件[22]對葉綠體基因組序列進行組裝，獲得pseudo genome序列，并與測序序列比對，進行基因組校正和坐標重排，得到完整的葉綠體環狀基因組序列。以大果山楂葉綠體基因組序列（NCBI登錄號NC_065486.1）為參考序列，對組裝后的葉綠體基因組進行質控以確保測序結果的準確性。使用Prodigal v2.6.3 軟件[23]（https：//www.github.com/hyattpd/Prodigal）對葉綠體基因組進行注釋，并對注釋結果進行校正。最后，使用OGDRAW 在線工具[24]（https：//chlorobox.mpimpgolm.mpg.de/OGDraw.html）繪制葉綠體基因組圖譜。

1.2.3 重復序列與密碼子使用分析 使用Vmatch v2.3.0 軟件（http：//www.vmatch.de/）鑒定葉綠體基因組序列中的重復序列。使用MISAv1.0 軟件[25]（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）分析葉綠體基因組中的簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）。使用 MEGA11.0軟件[26]分析同義密碼子相對使用度（relative syn-onymous codon usage，RSCU）。

1.2.4IR邊界的收縮和擴張分析使用IRscope軟件[27]（https：//github.com/xul962464/perl-IR-scope）將IR邊界信息可視化，繪制‘金如意'山楂與近緣物種葉綠體基因組IR邊界對比圖。使用Geneious11.0.3軟件[28]比較葉綠體基因組的IRA/IRB（反向互補重復區）、LSC（大單拷貝區）、SSC（小單拷貝區）和邊界基因的序列長度，分析IR邊界的擴張和收縮特征。

1.2.5 葉綠體基因組基因間隔區信息位點分析使用Phylosuitev1.2.1軟件[29]比對‘金如意'山楂和薔薇科植物共有的葉綠體基因間隔區，通過DnaSP軟件[30]統計間隔區的信息位點百分率。

1.3 系統進化分析

使用MAFFT軟件對‘金如意'山楂和薔薇科植物的葉綠體基因組序列進行多重序列比對，利用MEGA11.0軟件構建系統進化樹（bootstrap τ=τ 1 000）。

2 結果與分析

2.1‘金如意'山楂葉綠體基因組結構

測序結果去除接頭和低質量數據后，獲得原始 reads 27322 713 條，Q20 達 97.06% ，Q30 達91.72% ，經組裝和注釋得到‘金如意’山楂的完整葉綠體基因組。結果（圖1）表明，‘金如意'山楂葉綠體基因組全長 159 655bp ，具有典型的四分區域結構，包括1個LSC區、1個SSC區和一對IR區（IRA與IRB），長度分別為 87748、19139bp 和26384bp ;平均GC含量為 36.65% ，其中IR、LSC和 SSC區的GC含量依次為 42.64% 、 34.38% 和30.56% （表2）。

圖1‘金如意'山楂葉綠體基因組

2.2 葉綠體基因組的組成和特點

對‘金如意’山楂葉綠體基因組的組成和特點進行分析，結果（表2）表明，共編碼130個基因，包括85個蛋白編碼基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因。經功能注釋，主要包括自我復制基因、光合作用基因、其他功能基因和未知功能基因4種類型（表3），其中，光合作用基因有45個，包括光系統I基因、光系統Ⅱ基因、NADH脫氫酶亞基基因、細胞色素b/f復合物亞基基因、ATP合酶亞基基因、Rubisco大亞基基因；自我復制基因有74個，包括核糖體蛋白大亞基基因、核糖體蛋白小亞基基因、RNA聚合酶基因、核糖體RNA基因、轉運RNA基因;其他功能基因有5個，未知功能基因有6個；18個基因具有內含子序列，其中，ndhA、ndhB、petB、petD、atpF、rpll6、rpl2、rps16、rpoC1、trnA-UGC、trnG-UCC、trnI -GAU、trnK -UUU、trnL-UAA和 trnV-UAC 基因只有1個內含子， _rpsI2，clpP 和ycf3基因有2個內含子。

表2‘金如意'山楂葉綠體基因組的組成和特點

表3‘金如意’山楂葉綠體基因組編碼基因

注：標注*、**的基因分別為具有1、2個內含子的基因;基因后的（2）表示多拷貝基因的拷貝數。

2.3 葉綠體基因組特征比較分析

對‘金如意'山楂及34種其他薔薇科植物的葉綠體基因組特征進行比較分析，結果（表4）表明，葉綠體基因組大小介于 155549～160296bp ，其中草莓的最小，新疆野蘋果的最大。GC含量范圍為 36.50%～37.24% ，其中新疆野蘋果的最低，‘月月粉’月季的最高。由于遼寧山楂和新疆桃葉綠體基因組注釋不完整，只對其葉綠體基因組全長和GC含量進行分析，結果表明，33種薔薇科植物LSC區序列長度介于 85532～88440bp ，草莓的最短，蛇果的最長;SSC區序列長度介于 18145～19342bp ，草莓的最短，‘寶珠’梨的最長；IR區序列長度介于25372～26540bp ，掌葉覆盆子的最短，羽裂山楂的最長。綜合而言，金如意'山楂與16種山楂屬植物的葉綠體基因組GC含量相近，葉綠體基因組長度變異較小，與大果山楂和大果山楂變種最為接近。

表4‘金如意'山楂與34種薔薇科植物葉綠體基因組的特征

表4（續）

注：“—”代表GenBank注釋缺失，信息不完整。

2.4 重復序列與密碼子使用分析

在‘金如意’山楂葉綠體基因組中共鑒定出264個SSR位點（圖2），其中172個單核苷酸重復（ 65.15% ）、20個二核苷酸重復（ （7.58% ）、67個三核苷酸重復（ 25.38% ）、4個四核苷酸重復0 （1.52%） ）和1個五核苷酸重復；位于LSC區、SSC區和IR區的SSR位點數量分別為171、47個和46個。此外，檢測到57個重復序列，包括24個正向重復和 23 個回文重復，其中長度 30～40bp 的重復序列有53個。對85個蛋白編碼基因進行密碼子偏好性分析表明，編碼亮氨酸（Leu）的密碼子數量最多，為2789個 （10.53%） ；編碼半胱氨酸（Cys）的密碼子數量最少，為305個（ 1.15% ）。如圖3所示，金如意'山楂葉綠體基因組中有67個同義密碼子，其中高頻密碼子（ RSCUgt;1? 有31個，而以 ΔA/U 結尾的高頻密碼子有29個，占 93.5% ；以 A/U 結尾的密碼子數量18584個（ 70.80% ），以C/G結尾的密碼子數量7890個（ 29.80% ），說明‘金如意'山楂葉綠體基因組中的密碼子更傾向于使用 A/U 結尾。

2.5 葉綠體基因組IR邊界特征分析

為了進一步分析葉綠體基因組結構的差異，將‘金如意’山楂與大果山楂變種、‘月月粉’月季、野草莓、掌葉覆盆子、長梗垂梅、毛桃、蛇果、鴨梨和‘薩米脫’櫻桃9種薔薇科植物葉綠體基因組的IR邊界區域進行比較分析。結果（圖4）顯示，長梗垂梅、毛桃、蛇果、鴨梨’大果山楂變種和‘金如意'山楂的LSC/IRb邊界被rps19基因穿過；以JLB線為基準，‘鴨梨’、大果山楂變種和‘金如意'山楂的rps19 基因向LSC 區和 IRb區均擴展了 159bp 和 120bp ，長梗垂梅、毛桃和蛇果的rps19基因向LSC區和IRb區分別擴展了82bp 和 197bp，97AA bp和 182bp、194bp 和 85bp 。長梗垂梅、毛桃、蛇果、‘薩米脫'櫻桃、‘鴨梨’、大果山楂變種和‘金如意’山楂的IRb/SSC邊界被ndhF基因穿過。與其他薔薇科植物相比，‘金如意'山楂葉綠體基因組JSA邊界的擴張區域上，側翼基因均為ycf1基因（位于SSC區和IRa區），堿基變異長度分別為 4556～4659bp 和 1 049～ 1106bp_oJSB 邊界的擴張范圍顯示，金如意’山楂和蛇果的 ycfl基因在IRb 區和 SSC 區的堿基長度相同，分別為1074bp 和 8bp 。trnH基因均位于LSC區。

圖2‘金如意'山楂葉綠體基因組的SSR分析

圖3‘金如意'山楂葉綠體基因組的密碼子使用情況分析

2.6 葉綠體基因組基因間隔區信息位點分析

對35種薔薇科植物葉綠體基因組共有的26個基因間隔區信息位點進行分析，結果（表5）表明，信息位點百分率變化范圍為 3.7%～27.3% ，6個基因間隔區的信息位點超過 20% ，其中 trnH_- GUG_psbA基因間隔區的信息位點最多。

表535種薔薇科植物的26個葉綠體基因間隔區信息序列特征

2.7 系統進化分析

選用殼斗科栗屬中國板栗（Castaneamollis-sima，NCBI登錄號HQ336406.1）作為外類群，構建‘金如意'山楂及其他34種薔薇科植物葉綠體基因組的系統進化樹。結果（圖5）顯示，根據系統發育關系可以分為山楂屬，蘋果屬和梨屬，櫻桃屬和杏屬，懸鉤子屬、薔薇屬和草莓屬4個主要分支。其中，18個山楂屬植物構成一個單系分支，顯著區別于其他分支，而且山楂屬植物的分支節點均具有較高的支持率，說明結果可靠性高；‘金如意’山楂與大果山楂的親緣關系最近，屬于大果山楂類型。

圖5基于葉綠體基因組的系統進化分析

3討論與結論

葉綠體基因組作為獨立于核基因組的完整DNA序列，在進化過程中具有高度的保守性和穩定性，廣泛用于植物物種鑒定和系統進化分析[19-31]。本研究對‘金如意’山楂葉綠體基因組進行了測序、組裝與注釋，結果表明，‘金如意’山楂葉綠體基因組全長 159 655bp ，編碼130個基因，具有典型的四分體區域結構，包含一個87748bp的大單拷貝區、一個19139bp的小單拷貝區和一對26384bp的反向重復區；與山楂屬植物的葉綠體基因組GC含量相近，葉綠體基因組長度變異較小。

密碼子偏好性可以反映基因乃至物種的起源和進化方式，一定程度上影響基因功能及其編碼蛋白的表達[32]。密碼子偏好性分析表明，‘金如意'山楂葉綠體基因組的蛋白編碼基因中，幾乎所有 A/U 端密碼子的RSCU值都大于1，而C/G端密碼子的RSCU 值都小于1;以 A/U結尾的密碼子占 70.80% ，說明‘金如意'山楂葉綠體蛋白編碼基因具有明顯的A/U偏好性，與秤錘樹屬[33]、豆蔻屬[34]、山楂屬[19]等物種的葉綠體基因組密碼子偏好性一致。以A或U結尾的密碼子可能更容易被選擇作為翻譯的起點，從而影響基因表達的效率和產物的穩定性。此外，A/U偏好性還可能與植物的環境適應性有關，進而影響物種的進化和適應能力，為研究‘金如意’山楂的分子進化關系及其環境適應性提供依據[32]。SSR是由1～6個核苷酸組成的基本單元，經多次串聯形成重復的一段 DNA 序列[35-36]。本研究對‘金如意'山楂葉綠體基因組進行SSR分析，發現大多數核苷酸為單核苷酸和三核苷酸，與大多數植物的葉綠體基因組一致。此外，葉綠體基因組中存在大量的短片段重復序列，可能對基因的表達與調控具有重要意義。

葉綠體基因組為環形的四分體結構，存在LSC-IRb、IRb-SSC、SSC-IRa、IRa-LSC 四個邊界[37]。IR區域一般具有高度的保守性，但其邊界區序列也可能向外延伸擴張或向內部收縮，從而導致基因拷貝數的變化或在邊界區域產生假基因[38]，并導致不同譜系間葉綠體基因組大小產生差異[39]。本研究結果表明，山楂屬植物葉綠體基因組的SC/IR邊界雖存在部分擴張或收縮，但總體而言，基因組較為保守，未發現基因組倒置和重排現象，與趙振寧等[19]的研究結果一致。‘金如意'山楂與大果山楂變種的IR邊界特征非常相似，對于深入了解‘金如意’山楂的遺傳信息及分子進化關系具有重要意義。

葉綠體基因組一般為母系遺傳，重組率較低，核苷酸置換率適中，廣泛用于植物不同分類水平的系統進化分析[10，31]。葉綠體基因間隔區的位點變異率能反映物種間差異的信息，更好地了解不同物種之間的親緣關系和進化歷史。黃瓊林等[40]對半邊旗（Pteris semipinnata L.）及其同屬植物進行葉綠體基因組比較，發現它們在matK、rbcL、rpoB等間隔區堿基差異明顯，表明利用葉綠體基因可以鑒別半邊旗與屬內近緣物種。山楂屬植物普遍存在多倍化、無融合生殖和基因滲入等現象，給山楂屬植物的分類鑒定和系統進化分析造成困難[6]。本研究對‘金如意’山楂在內的35種薔薇科植物的葉綠體基因組基因間隔區信息位點進行分析，結果表明存在26個基因間隔區，變異位點百分率變化范圍為 3.7%～27.3% ，具有豐富的信息位點。為研究‘金如意’山楂在屬間及薔薇科中的系統進化位置，選擇山楂屬、蘋果屬、梨屬、櫻桃屬、杏屬等34種薔薇科植物的葉綠體基因組數據，以中國板栗為外類群構建系統進化樹，結果表明，‘金如意’山楂與其他17種山楂屬植物構成一個單系分支，具有較高的支持率；而且其與大果山楂的親緣關系最近，證明‘金如意’山楂屬于大果山楂類型，對于深入了解‘金如意’山楂的起源及其在山楂屬中的系統分類具有重要意義。

綜上，‘金如意’山楂葉綠體基因組全長159655bp ，包含一個 87748bp 的大單拷貝區、一個 19139bp 的小單拷貝和一對 26384bp 的反向重復區，共檢測到264個SSR位點和57個重復序列，IR區邊界相對保守；與大果山楂的親緣關系最近，屬于大果山楂類型。本研究明確了‘金如意’山楂的系統發育位置，為山楂屬的系統分類和遺傳多樣性研究奠定了基礎。

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