血清外泌體LncRNA用于鼻咽癌放療療效的預測價值

中圖分類號：R739.6 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2025.09.003

Predictive value of serum exosomal LncRNA in the efficacy ofradiotherapy for nasopharyngea carcinoma

PAN Guogangla ， YANG Bixiu1b， HUANG Chunchuan ^1a ， WANG Chunfang ^1a JIA Jihong ^1a ， PANG Xiaoxia ^1a ， NONG Shize ² ， HUANG Deyou ^1cs

（1a.Department of Laboratory Medicine，1b.Department of Oncology，lc.Department of Radiology，

1. Affliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533ooo， Guangxi， China; 2.Department of Laboratory Medicine，Baise People's Hospital，Baise 533Ooo，Guangxi，China）

【Abstract】ObjectiveTo explore the predictive valueof serumexosomal long non-coding RNA（LncRNA）fortheradiotherapy effcacyinpatients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）.MethodsAretrospective cohort study was conducted， 100NPC patientswhowereconfirmedbypathologyandreceivedradiotherapyinAfiliated HospitalofYoujiang MedicalUniversityforNationalities，BaisePeople'sHospitalaswellasseveralnationalcomprehensivethreeA-levelhospitalsofNaning fromJuly2O21toDecember2O22 wereselected，andtheserumexosomalLncRNAexpressionlevelsofpatientsbeforetreat mentwere measured.Acording totheimagingevaluationoflesionsafterradiotherapy，patientswere divided intoremision group （complete remission + partial remission） and non-remission group （stable disease + progression）.After the differentialanalysis ofLncRNA expressionbetweenthetwo groups，LncRNAsrelated to NPCoverall survival were screened incombinationwithTCGA-NPC（ n=523 ）database to obtain the intersection LncRNAs. Multivariate logistic regression analysis was used todeterminetheLncRNAsthatcouldultimatelybeused topredict theefcacyofradiotherapyinNPCpatients.Inaddition，the receiver operating characteristic curve（ROC），area under the curve （AUC）. ，sensitivity and specificity were used to evaluatethe prediction eficiencyofthescreened LncRNAs.ResultsThe study foundthatthree serum exosomal LncRNAswerediferentiallyexpressedbetweenNPC patients intheremision groupandnon-remission group，andtheirexpression levelswerecloselyassociatedwithoverallsurvival.Specifically，LincO324andLincO173weresignificantlyup-regulatedin the non-remission group，whereas LincOo312 was markedly down-regulated. The AUC ，sensitivity and specificity of the combined prediction of threeLncRNAs for NPC radiotherapywere O.75，80. 62% and 84.35%，respectively.ConclusionThe threeprognosticserumexosomalLncRNAsidentifiedinthisstudymayserveaspotentialnon-invasive biomarkers forpredictingradiotherapy efficacy inNPC patients.

【Keywords】 nasopharyngeal carcinoma（NPC）； long non-coding RNA（LncRNA）；exosome； radiotherapy

鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤。最新研究表明，NPC癌細胞與腫瘤微環境構成的復雜病理生態系統存在相互作用且不斷進展演化[1]。早期NPC常無特異性臨床癥狀，多數患者確診時已進展至中晚期。由于NPC解剖位置的特殊且對放療高度敏感，放療是目前NPC的首選治療方案。然而，部分接受放療的NPC患者會出現放療抵抗，其導致NPC的高復發率和轉移率并顯著降低總生存率[1-2]。目前常用的TNM分期系統只關注腫瘤解剖特征，而忽略腫瘤內在生物學異質性，無法準確預測患者個體預后。因此，進一步研究腫瘤放療抵抗機制以確定NPC有效的治療靶點具有重要意義。外泌體是一種直徑 30～ 100nm 的胞外囊泡樣結構，包含蛋白質、核苷酸、脫氧核苷酸等生物活性物質，在交換遺傳信息和調節生理、病理活動中發揮重要作用。腫瘤細胞以及其他多種活細胞可主動分泌外泌體，影響腫瘤的形成、生長、血管生成、轉移、耐藥性和免疫逃避等[3-5]。其中長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一種長度超過200個核苷酸，且不具有編碼蛋白質能力的RNA分子。既往研究表明，LncRNA在多種細胞生物學過程中發揮重要作用[4]。在病理狀態下，血清中存在組成成分和物質表達異常的外泌體，有望作為潛在腫瘤診斷標志物和治療靶點。本研究旨在探討基于血清外泌體LncRNA對NPC患者放療療效預測的應用價值。

1資料與方法

1.1一般資料本研究采用回顧性隊列研究的方法，收集2021年7月至2022年12月，在右江民族醫學院附屬醫院、百色市人民醫院、南寧等多家三甲醫院接受放療的100例NPC患者的全血樣本。NPC患者人組標準：（1）首次發現且經組織病理學證實為NPC；（2）采集血清樣本前未進行任何抗腫瘤治療；（3）無遠處器官轉移（如肺、肝、骨等）；（4）具有完整治療前后影像學隨訪資料。排除標準：（1）有其他癌癥病史；（2）無完整影像及臨床診療記錄。放療方案：使用6MVX射線直線加速器；放療劑量為 2.12～2.24Gy/f（? 5周共28次），大體腫瘤區（GTV）總劑量為 59.36～62.72Gy 。根據RE-CIST1.1指南[6，為規避早期放射性炎癥及水腫對評估的干擾，患者于放療結束4周后行增強MR檢查評估療效，將患者分為緩解組（完全緩解 + 部分緩解）和非緩解組（疾病穩定 + 進展）。NPC患者血清收集標準： ① 初次發現病灶入院； ② 未經任何治療干預。此外，收集TC-GA數據庫中523例NPC患者腫瘤組織樣本的LncRNA測序數據以及預后信息。所有患者均簽署知情同意書后被納人研究。本文已經倫理委員會批準通過，倫理批號為YYFY-LL-2024-238。

1.2血清外泌體提取及qRT-PCR

1.2.1血清外泌體提取采集每位受試者空腹靜脈血約 5mL 。將血液樣品在 4^°C 環境中以 2500×g 離心10分鐘。將置于去RNA酶離心管中的血清樣本以7500×g 再次離心15分鐘后取 1.5mL 放置于 -80°C 冰箱中儲存。使用ExoQuick-TC試劑（批號：EX-OQ5A-1，美國 SBI，5mL 瓶） 63μL 與 250μL 血清混勻，在 4^°C 環境下孵育30分鐘后于 4^°C 下離心2次并去除上層清液。

1.2.2血清外泌體鑒定將PBS 稀釋過的外泌體樣本加至碳膜銅網，用 2%w/v 多聚甲醛在室溫下固定5分鐘，后用醋酸鈾酰對外泌體進行染色，在透射電子顯微鏡下觀察。外泌體的大小和濃度分布情況采用NanoSightNS300進行納米顆粒跟蹤分析。外泌體Western blotting 鑒定：CD63、Tsg101作為外泌體標志物檢測對象。

1.2.3qRT-PCR使用TRIzol試劑提取總RNA，使用TaKaRaPrimeScriptRTMasterMix逆轉錄試劑盒（貨號：RR036A，日本TaKaRa）合成cDNA樣本。實時定量聚合酶鏈反應采用SYBRGreenPCRKits（批號：28104，德國Qiagen，200反應）。每個樣品重復測定三次取平均Ct值，以 2^-ΔG 計算基因的相對表達水平。

1.3 觀察指標

1.3.1療效評估指標根據RECIST1.1指南將NPC患者放療后的療效分為緩解組（完全緩解 + 部分緩解）和非緩解組（疾病穩定 + 進展）。通過影像學檢查評估患者病灶的變化情況，以此作為判斷放療療效的主要依據。

1.3.2LncRNA表達水平差異利用qRT-PCR技術檢測血清外泌體中LncRNA的表達水平，比較緩解組和非緩解組患者之間LncRNA的差異表達情況，篩選出與放療療效相關的LncRNA。

1.3.3 總生存期相關LncRNA篩選結合TCGA-NPC數據庫中的LncRNA測序數據及預后信息，運用COX回歸分析篩選出與NPC患者總生存期相關的LncRNA，并與差異表達LncRNA取交集，確定可用于預測放療療效的LncRNA。

1.3.4預測效能評估指標采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）及曲線下面積（theareaunder thecurve， AUC ）、敏感性和特異性等指標，對篩選出的LncRNA單獨及聯合預測NPC患者放療療效的能力進行評估，以確定其作為潛在生物標志物的有效性和可靠性。

1.4統計學方法統計分析采用SPSS24.0軟件進行。多因素logistic回歸和 Cox 回歸分析均使用向前逐步回歸法，變量納入水平 Plt;0.05 ，排除水平Pgt;0.10 ，因變量賦值 1= 非緩解組/死亡， 0= 緩解組/存活。使用ROC及 AUC 、敏感性和特異性等指標評價每個交集LncRNA以及聯合療效預測效能。符合正態分布的連續性資料采用均數 ± 標準差 表示，分類資料采用頻數 （n） 及百分比 （%） 表示。連續性資料和分類資料分別采用 χ_t 檢驗以及 χ² 檢驗。檢驗水準： α=0.05 ，雙側檢驗。

2結果

2.1受試者基線資料統計100例NPC患者平均年齡（ 62.15±2.47 ）歲，男性67例，女性33例。NPC患者經放療后隨訪，58例納人緩解組，42例納入非緩解組。兩組隊列患者年齡、性別及TNM分期均差異無統計學意義（ ?Pgt;0.05） 。見表1。

2.2血清外泌體鑒定從血清中分離的外泌體樣本經透射電子顯微鏡和蛋白質印跡分析，分離的顆粒表現出直徑約 100nm 的外泌體形態并富含外泌體標記蛋白Tsg101，CD63（圖1A-B）。

2.3LncRNA預測NPC患者放療療效經緩解組和非緩解組NPC患者間基因差異表達分析，共篩選出41個高表達及18個低表達LncRNA， ∣log2 foldchange（FC） |gt;1 ，矯正 P -value lt;0.001 ，聯合TCGA隊列COX回歸分析共篩選出 Linc00173 （ FC= 2.18）、 Linc00324 （ FC=1 .94）、 Linc00312 （ FC= 0.43）3種交集LncRNA與患者總生存期相關（表2）。經多因素logistic回歸分析，3種LncRNA可作為NPC患者放療療效的獨立預測因子（表3）。3種LncRNA及聯合放療療效預測ROC曲線見圖2，聯合療效預測能力表現最佳， AUC 值為0.75（敏感性：80.62% ，特異性： 84.35% ）。

表1NPC患者基線資料

圖1血漿外泌體鑒定

注：（A）透射電子顯微鏡下外泌體顆粒，比例尺 =100nm ；（B）外泌體蛋白質Tsg101和CD63蛋白質印跡結果，兩組NPC患者之間無明顯差異

表23種LncRNACox回歸分析結果

表33種LncRNA多因素logistic回歸分析

圖23種LncRNA及聯合預測NPC患者放療療效ROC曲線

3討論

由于NPC的特殊解剖結構及其對電離輻射的敏感性，目前NPC的主要治療方法仍是放療。放療的核心是引起細胞DNA損傷，并通過輻射暴露誘導細胞凋亡，但同時放射線可能會觸發DNA損傷修復機制從而導致這種治療形式的耐受[5.7]。目前，相同TNM分期的患者基本采用相同的放療方案，但由于放療劑量缺乏個體化考慮，導致放療抵抗患者接受劑量不足或放療過敏患者出現周圍正常組織損傷。因此，如何預測患者放療敏感性，改善個體化放療劑量以獲得更好的療效以及減少放療損傷是NPC臨床治療中迫切需要解決的問題。近年來，LncRNA參與腫瘤的發生、進展以及治療耐藥性和用于腫瘤患者的生存預測等研究相繼被報道[8-10]。研究表明，LncRNA在NPC放療中發揮關鍵作用，可能成為提高放療敏感性及患者生存率的潛在靶點。例如位于8q24.21染色體的人類PVT1基因在NPC組織中高表達，其與放療抵抗和患者預后相關[\"]。敲除PVT1可以通過隔絕miR-515-5p來降低PIK3CA的表達，抑制NPC細胞的增殖及抗輻射能力，并促進細胞凋亡，從而提高NPC患者放療療效。此外，外泌體作為具有胞吞作用的納米大小囊泡，被發現是一種新的重要細胞間通信載體，可以運輸宿主來源的基因組、蛋白質和脂質物質[12-13]。外泌體由多種細胞產生并釋放到細胞外空間后可通過胞吞作用進入周圍細胞，在信號轉導、免疫調節和靶向傳遞等功能中發揮重要作用[14-15]。然而，目前NPC 患者外泌體生物學功能尚未完全闡明。通過非侵入性方法采集患者血清外泌體并確定潛在的生物標志物對于疾病的早期檢測、療效以及預后至關重要。ZHOU等[6]發現EBV病毒感染人群和NPC患者血清外泌體中miR-99b-5p顯著低表達，并通過改變腫瘤微環境促進了NPC細胞的增殖、遷移以及抑制細胞凋亡能力。另有研究指出NPC患者循環外泌體濃度的升高與淋巴結轉移和不良預后相關，其中TW03來源的外泌體通過抑制T細胞增殖以及Th1和Th17的分化促進NPC 細胞誘導Treg，從而損害T細胞功能[17]。另有研究指出來自γ8T細胞的外泌體具有抵消在NPC干細胞樣細胞中觀察到的放療抵抗程度[2]。此外，在紫杉醇耐藥NPC 細胞中，DDX53的上調表達與之相關。DDX53可以通過外泌體轉移調節MDR1的表達，進而影響NPC對紫杉醇的敏感性[3]。因此，了解外泌體LncRNA在NPC中的作用機制和生物學特性，探究其作為診斷、療效預測及治療靶點的潛力具有重要意義。

本研究發現Linc00324、Linc00173、Linc00312在不同放療療效NPC患者中顯著差異表達且與患者總生存期相關。聯合以上3種LncRNA具有良好的放療療效預測能力。有研究表明Linc00324在NPC細胞中顯著高表達，Linc00324與miR-3164結合并負調控miR-3164的表達，以減少由miR-3164引起的PAD4的降解并激活PI3K/AKT通路，可促進NPC增殖能力且抑制細胞凋亡和自噬，進而影響放療療效[18]。另有研究發現在NPC患者腫瘤組織中Linc00173表達水平顯著升高19]。該研究證明Linc00173與細胞核中的CHK2蛋白激酶結合，破壞輻射誘導的CHK2磷酸化，進而抑制P53信號通路的激活，最終抑制NPC細胞的凋亡而導致放療抵抗。GUO等[20]研究發現Linc00312與其在NPC的進展、耐藥性、短期療效和總生存期中有重要影響。上調 Linc00312 可以通過抑制輻射誘導的信號轉導途徑和DNA損傷修復相關蛋白的表達來提高NPC對放療的敏感性。Linc00312具有3種調控特征的單核昔酸多態性與接受放化療NPC患者出現嚴重白細胞減少顯著相關[2I]。單核苷酸多態性可破壞或創建多個miRNA與 Linc00312 之間的結合位點改變其折疊結構、最小自由能和表達水平，進而影響由放化療誘導的血液毒性反應。盡管本研究使用生物信息學方法建立了可用于NPC放療療效預測的Ln-cRNA分子標志物，但這些LncRNA在NPC中的特定分子機制有待進一步實驗闡明。本研究為單中心小樣本研究，結論需通過多中心大樣本研究進一步驗證。

綜上所述，本研究發現了3種NPC患者血清外泌體LncRNA可作為NPC放療療效預測的有效生物學標志物。

參考文獻

[1] 陳麗君，梁秀妹，吳蕓，等.基于醫院登記的78046例 惡性腫瘤患者生存報告[J].中國癌癥防治雜志， 2024，16（2）：229-237.

[2] 胡丹，陳志杰，林燕彬，等.基于IMRT同步放化療方 案治療局部晚期鼻咽癌不良預后危險因素及預測模 型構建[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2023，30（3）： 148-151.

[3] 林秋紅，羅飄，韓加輝，等.miR-4497靶向TMEM88通 過PI3K/AKT信號通路調控下咽癌FaDu細胞增殖 和凋亡的研究[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2023，30 （11）：693-700.

[4] TIAN YH，AI ML，LIU CS，et al.Upregulated long non-coding RNA lnc-MRPL39-2：1 induces the growth and invasion of nasopharyngeal carcinoma bybinding to HuR and stabilizing β -cateninmRNA[J].IntJBiol Sci，2023，19（8） ：2349-2365.

[5] DWIJAYANTIF，PRABAWAA，BESRAL，etal.The five-year survival rate of patients with nasopharyngeal carcinoma based on tumorresponse after receiving neoadjuvantchemotherapy，followedbychemoradiation，in Indonesia：a retrospective study[J].Oncology，2020， 98（3）：154-160.

[6] SCHWARTZLH，LITIERES，DEVRIESE，et al. RECIST1.1-Updateand clarification：From theRECIST committee[J].EurJCancer，2016，62：132-137.

[7]曹華琳，賈彥召，曲莉，等.CircFAT1調節miR-296- 3p/ MAPRE1軸對鼻咽癌細胞增殖、凋亡和放療敏感 性的影響［J].山東大學學報（醫學版），2023，61 （9） ：38-46.

[8] 李君，葉方，韓富光.敲低lncRNALINC01296調節 PD-L1抑制鼻咽癌細胞免疫逃逸的機制研究［J].免 疫學雜志，2023，39（10）：847-856.

[9] 薛華，安寧，向光明，等.IncRNALINC01410靶向miR205-5p抑制胰腺癌細胞放療敏感性的研究[J].中國 臨床藥理學雜志，2022，38（20）：2434-2439.

[10] 侯歌，張家杰，肖陳虎，等.IncRNAZSWIM8-AS1對結 直腸癌細胞RKO增殖、凋亡、遷移和放射敏感性的 影響[J].鄭州大學學報（醫學版），2021，56（4）：485- 492.

[11] HAN YY，LIF，XIE J，et al. PVT1 mediates cell proliferation，apoptosis and radioresistance in nasopharyngeal carcinoma through regulating miR-515-5p/PIK3CA axis[J].Cancer Manag Res，2020，12：10077-10090.

[12] WANGXW，ZHANGYM，MUXF，et al.Exosomes derived from γδ-T cells synergize with radiotherapy and preserve antitumor activities against nasopharyngeal carcinoma in immunosuppressive microenvironment[J]. J Immunother Cancer，2022，10（2）：e003832.

[13] YUANF，ZHOU Z F. Exosomes derived from Taxol-resistant nasopharyngeal carcinoma（NPC）cells transferred DDX53 to NPC cells and promoted cancer resistanceto Taxol[J].EurRevMedPharmacol Sci，2021， 25（1） ：127-138.

[14] 段依璠，顧靜，舒亞妃，等.心肌成纖維細胞來源的外 泌體miRNA參與放射性心肌纖維化損傷[J].中國 生物化學與分子生物學報，2023，39（1）：108-120.

[15] 高心雨，毛子俊，黃圣喆，等.腫瘤干細胞源性的外泌 體促進結直腸癌細胞的化療耐藥和侵襲[J].中國生 物化學與分子生物學報，2024，40（8）：1119-1131.

[16] ZHOUXJ，XUHM，HUANGGS，et al.Nasopharyngeal carcinoma derived exosomes regulate the proliferationand migration of nasopharyngeal carcinomacells by mediating the miR-99a-5p BAZ2A axis[J]. Braz J Otorhinolaryngol，2024，90（1） ：101343.

[17] YESB，LIZL，LUODH，etal.Tumor-derived exosomes promote tumor progression and T-cell dysfunction through the regulation of enriched exosomal microRNAs in human nasopharyngeal carcinoma[J]. Oncotarget， 2014，5（14） ：5439-5452.

[18] CHEN H，WEIL N，LUO M，et al. LINCO0324 suppresses apoptosis and autophagy in nasopharyngeal carcinoma through upregulation of PAD4 and activation of the PI3K/AKT signaling pathway[J].Cell Biol Toxicol，2022，38（6） ：995-1011.

[19] MIAO J J，CHEN BY，XIAO Y Y，et al. Long noncoding RNA LINCoo173 induces radioresistance in nasopharyngeal carcinoma via inhibiting CHK2/P53pathway[J]. Cancer Gene Ther，2023，30（9） ：1249-1259.

[20] GUOZ，WANGYH，XUH，et al.LncRNAlinc00312 suppresses radiotherapy resistance by targeting DNAPKcs and impairing DNA damage repair in nasopharyngeal carcinoma[J]. Cell Death Dis，2021，12（1） ：69- 77.

[21] GUO Z，WANGYJ，HEBS，etal.LincO0312 single nucleotide polymorphism as biomarker for chemoradiotherapy induced hematotoxicity in nasopharyngeal carcinoma patients[J]. Dis Markers，2022，2022：6707821.

（收稿日期：2024-12-12 修回日期：2025-05-26）（編輯：王琳葵 潘明志）