山羊支原體山羊肺炎亞種DnaK基因的原核表達及亞細胞定位研究

山羊傳染性胸膜肺炎（Contagiouscaprinepleuropneumonia，CCPP）俗稱“爛肺病”，是由山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp）引起的一種山羊特有的急性或慢性高度接觸性呼吸道疾病[1]。患病羊以發熱、咳嗽、呼吸困難、胸腔發生纖維素性肺炎和胸膜炎為特征[2]，世界動物衛生組織（WOAH）將其列為必須法定報告傳染病[3，我國將其列為二類動物疫病。Mccp是1976年首次從肯尼亞患病羊中分離到[4，而我國直到2007年才分離出第一株菌株[5]。自2023年冬季以來，CCPP在我國北方地區大面積流行，給山羊養殖業造成了巨大的經濟損失。因此，有效防控Mccp感染已成為當前亟須解決的問題。

本研究對Mccp菌株的DnaK序列進行比對與密碼子優化，構建了原核表達載體，成功在體外表達并純化了DnaK重組蛋白，進而分析了其免疫原性及在Mccp細胞中的亞細胞定位。本研究為深入探索DnaK蛋白的生物學功能及闡明Mccp的致病機制奠定了工作基礎。

1材料與方法

1.1菌株與主要試劑

山羊支原體山羊肺炎亞種M1801株由本實驗室保存；大腸埃希菌BL21（DE3）感受態細胞購自生工生物技術有限公司；HighAffinityNi-ChargedResinFF為金斯瑞公司產品；預染Marker、BCA蛋白定量分析試劑盒、MO蛋白分離試劑盒、ECL發光試劑購自Thermo公司。

1.2DnaK基因的分析與優化

基于GenBack中MccpM1601菌株的基因組數據，對其DnaK基因序列進行系統分析。將該序列與其他已知的Mccp菌株DnaK基因序列進行比對，根據大腸埃希菌表達系統的密碼子偏好性對全序列進行優化。最后將優化的序列委托武漢金開瑞生物公司進行合成，并克隆連接至pET-30a（+）載體上。

1.3重組蛋白的誘導表達及純化

將鑒定正確的重組質粒pET30a-DnaK轉化大腸埃希菌BL21（DE3）感受態細胞，挑取單克隆過夜培養，再用IPTG進行誘導。最后用PBS離洗菌體，用適量PBS重懸后超聲破碎。離心分別取適量上清和沉淀用SDS-PAGE分析蛋白的表達形式，與未誘導菌液對比。選擇可溶性表達的條件進行大量誘導，獲得上清表達的蛋白經 0.45μm 濾膜過濾后，用親和樹脂按照說明書步驟進行純化，并進行SDS-PAGE電泳分析。

1.4Western blot分析

將純化的蛋白rDnaK在SDS-PAGE電泳后轉印至PVDF膜，隨后將PVDF膜置于 5% 的BSA中室溫封閉^2h ，分別以抗His標簽的鼠單克隆抗體作為一抗（稀釋比為1：20000），于室溫反應 ^1h 。洗膜后加入HPR標記的山羊抗小鼠IgG抗體，稀釋比為1：20000，于室溫孵育 ^1h ；TBST洗膜4次，每次 10min ；避光加人ECL顯色液，于Tanon成像系統中成像。

1.5重組蛋白DnaK多克隆抗體的制備

使用BCA試劑盒測定純化的rDnaK蛋白的濃度后，將適量的重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合乳化。選取體重約2kg的新西蘭大白兔，采用背部皮下多點注射方式進行初次免疫，每只動物接種劑量為 只。14d后進行第2次免疫，改用弗氏不完全佐劑，免疫劑量降至 250μg/ 只。間隔11d后實施第3次免疫，方法和劑量與第2次免疫相同。末次免疫后7d采集耳緣靜脈血樣檢測抗體效價，達到要求后實施終末采血，分離血清，分裝保存備用。

1.6多克隆抗體效價測定

用碳酸鹽緩沖液將重組rDnaK蛋白稀釋至合適濃度后包被酶標板，經過反應，通過酶標儀讀取OD（ 450nm ）值，計算相應的P/N值，以 ?≥2.1 來判定多抗血清的效價。

1.7DnaK蛋白在山羊支原體山羊肺炎亞種細胞內的分布

第一，Mccp全菌蛋白的提取。配制MTB培養基，之后將保存的Mccp菌株接種于MTB培養基中進行復蘇培養。采用超聲破碎法（工作2s，間隔3s）處理重懸菌液，待菌液透明度提高停止超聲，此樣品為支原體的全菌蛋白樣品。

第二，Mccp膜蛋白與胞質蛋白的提取。同時培養 200mL 對數生長后期的Mccp菌液，采樣膜蛋白分離試劑盒進行膜蛋白和胞質蛋白的分離，對部分步驟進行優化。用BCA法進行蛋白定量，并通過SDS-PAGE分析。

第三，亞細胞定位分析。采用Westernblot技術分析DnaK蛋白在Mccp中的定位情況，將等量上述獲得的Mccp全菌蛋白、膜蛋白和胞質蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離后進行Westernblot分析。

2結果

2.1pET30a-DnaK蛋白的誘導表達

pET30a-DnaK轉化至大腸埃希菌表達菌BL21（DE3），經不同IPTG濃度誘導后的SDS-PAGE分析，結果顯示，rDnaK重組蛋白在3種誘導條件下均以可溶性蛋白和包涵體兩種形式表達，其中 0.05mM IPTG在16 C 和26 C 兩個溫度誘導條件下可溶性蛋白表達量基本一致，可用于后續研究（圖1）。

2.2rDnaK重組蛋白的純化與鑒定

大量接種表達菌液，在 0.05mM IPTG、 26°C 條件下表達，超聲破碎后取可溶性表達上清液進行鎳柱親和層析純化，結果顯示在 49kDa 處有明顯條帶（圖2A）；WesternBlot結果（圖2B）在約 49kDa 處檢測到His標簽陽性條帶，進一步證實成功獲得了純度較高、濃度適宜的重組rDnaK蛋白。

圖2rDnak重組蛋白的純化與鑒定

注：A：純化蛋白的SDS-PAGE分析，B：WesternBlot鑒定DnaK重組蛋白的His標簽；M：蛋白分子量標準；1，2：純化的rDnaK蛋白。

2.3多抗血清的制備

rDnaK重組蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫新西蘭大白兔，三次免疫后分離血清進行倍比稀釋，與提前包被適量rDnaK蛋白的酶標板進行抗體效價測定，結果見（圖3），血清效價可達1：10200以上，說明重組蛋白具有良好的免疫原性，能夠誘導機體產生免疫應答，產生特異性抗體。

圖1SDS-PAGE分析重組蛋白的表達

注：M：蛋白分子量標準；1：未誘導的pET30a-DnaK；2/5、3/8、4/11分別為 0.05mM IPTG26 、0.05mMIPTG16℃、0.5mMIPTG37 C 誘導的菌體蛋白；泳道6、9、12：誘導表達的上清樣品；泳道7、10、13：誘導表達的沉淀樣品。

圖3ELISA檢測抗DnaK多克隆抗體的效價

圖4SDS-PAGE分析Mccp各種蛋白的提取結果

注：M：蛋白分子量標準；1：Mccp全菌蛋白；2：Mccp胞質蛋白；3：Mccp膜蛋白

圖5Westernblot分析DnaK蛋白在Mccp 細胞中分布

注：M：蛋白分子量標準；1：Mccp全菌蛋白；2：Mccp胞質蛋白；3：Mccp膜蛋白

2.4Mccp各組分蛋白的提取

將提取的Mccp全菌蛋白、膜蛋白和胞質蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果見（圖4），各蛋白樣品條帶清晰，大小分布在 10kDa～100kDa 。用BCA進入蛋白定量后使用相同的濃度進行下一步Westernblot分析。

2.5DnaK蛋白在Mccp中的分布

免疫印跡分析顯示，rDnaK的多抗血清能與Mccp的全菌蛋白、膜蛋白及胞質蛋白發生特異性結合，在約 49kDa 處出現了特異性反應條帶，該條帶位置與DnaK蛋白大小一致（圖5）。結果表明DnaK蛋白在細胞膜上和細胞質中均有分布，主要分布于膜蛋白中。

3討論

CCPP是WOAH法定報告動物疫病，在我國被列為二類動物疫病，且對野生動物的威脅也越來越嚴重。因亞單位疫苗更安全有效、工藝簡單、成本低廉，而篩選和評價潛在的免疫原性蛋白是研發新疫苗的基礎。

結語

本研究基于大腸埃希菌表達系統，對Mccp的DnaK基因進行密碼子及表達條件優化，成功實現了該蛋白的可溶性表達，并獲得分子量約為49kDa的重組蛋白。在此基礎上制備的兔源多克隆抗體效價超過1：102400，表明DnaK蛋白具有良好的免疫原性。這些為進一步研究DnaK蛋白的生物學功能提供了基礎和材料，也為評估其是否為Mccp的潛在亞單位疫苗候選抗原奠定了基礎。

參考文獻：

[1]張才旦卓瑪，杜梅卓.羊傳染性胸膜肺炎流行特點及防治[J].畜牧獸醫科學（電子版），2020，01：99-100.

[2]穆國冬，張忠湛，盧松巖.羊支原體肺炎的流行病學、臨床癥狀、預防和治療措施[J].現代畜牧科技，2020，01：53-54.

[3]袁小平.羊傳染性胸膜肺炎診斷與治療[J].畜牧獸醫科學（電子版），2019，24：104-105.

[4]劉瓊.羊傳染性胸膜肺炎藥物治療效果比照觀察［J].中國畜禽種業，2019，1507：147.

[5]辛九慶，張建華，胡守萍，等.一株致病性山羊支原體山羊肺炎亞種支原體的分離[A].中國科學技術協會，2006：8.

收稿日期：2025-09-01

作者簡介：楊儒愛（1984一），男，漢族，甘肅省蘭州市，碩士研究生，助理研究員。研究方向：疫苗臨床應用與疫病防控。

*通信作者：史耀旭（1980一），男，漢族，河南省平頂山市，博士研究生，副研究員。研究方向：反芻疫苗研發與疫病防控。