以金剛石氮-空位色心為探針的亞衍射級(jí)成像技術(shù)及應(yīng)用

中圖分類號(hào)：TQ163；O773文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract： Considering that conventional optical microscopes are limited by Abbe diffraction difraction，the resolution cannot meet research needs in the fields of biology，materials，and microelectromechanical systems， so some sub-diffraction imaging techniques based on fluorescent probes are needed for science research. Compared with traditional fluorescent probes，diamond nitrogen-vacancy（NV） color centers have stable luminescence characteristics，unique optical bright and dark state conversion characteristics， long electron spin correlation time， biocompatibility and other excellent characteristics，which can become a new type of probe to play an important role in the field of subdifraction imaging.This paper introduced two mechanisms of NV color centers as fluorescent probes， three types of fluorescent probe-based subdiffraction microscopy techniques，summarized and compared the applications of NV color centers in these subdiffraction imaging techniques， and finally prospected their applications.

Keywords： sub-diffraction imaging techniques; nitrogen-vacancy（NV） color centers; fluorescent probe

引言

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡受到光學(xué)衍射的限制，其分辨率只能達(dá)到阿貝極限（Abbediffractionlimit）d=λ/（2nsinα） 。在可見光范圍內(nèi)，該分辨率僅約為 200nm ，超出了許多微觀體系樣品的尺度，無法實(shí)現(xiàn)亞衍射級(jí)成像。因此，需要考慮更先進(jìn)的成像技術(shù)[1]

在過去幾十年里，研究人員開發(fā)了一系列亞衍射級(jí)熒光顯微鏡技術(shù)，如受激輻射損耗（stimulated emission depletion microscopy， STED）[2]結(jié)構(gòu)光照明（structured illumination microscopy，SIM）[3]、隨機(jī)光學(xué)重建（stochastic optical recon-structionmicroscopy，STORM）[4等，其精度遠(yuǎn)超衍射極限，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦熒光顯微鏡相比，這類熒光成像技術(shù)精度能達(dá)到5nm 以下；與電子顯微鏡相比，這類熒光成像技術(shù)應(yīng)用范圍更廣，對(duì)樣品的性質(zhì)和形態(tài)沒有要求，無需復(fù)雜的樣品制備流程，且能實(shí)現(xiàn)彩色成像?？梢哉f，超分辨熒光顯微鏡將“光學(xué)顯微鏡帶入納米維度”，填補(bǔ)了電子顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡之間的空白

以上這些技術(shù)都基于熒光探針吸收特定波長(zhǎng)的光并以更長(zhǎng)的波長(zhǎng)重新發(fā)射的特性來實(shí)現(xiàn)。為實(shí)現(xiàn)更好的成像效果，需要熒光探針具備熒光特性可控、熒光明亮穩(wěn)定、無毒無損傷的特點(diǎn)。傳統(tǒng)上，常采用有機(jī)熒光染料或生物熒光基團(tuán)作為熒光探針，但這些探針存在光穩(wěn)定性較低、靈敏度不足、熒光特性不可控、會(huì)造成漂白損傷等缺陷[7-8]。因此，需要尋找性能更出色的新型熒光探針用于實(shí)現(xiàn)亞衍射級(jí)成像。

近年來，研究者發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)摻氮金剛石的基礎(chǔ)上，通過離子注人[9-10]或電子輻照[11]后退火的方法，可以獲得一種發(fā)光缺陷：氮-空位（nitrogen-vacancy，NV色心，由氮原子與空穴復(fù)合形成，其結(jié)構(gòu)如圖1所示[12]。色心具有穩(wěn)定的發(fā)光特性、獨(dú)特的光學(xué)亮暗態(tài)轉(zhuǎn)換特性、較長(zhǎng)的電子自旋相關(guān)時(shí)間、生物兼容等特點(diǎn)，可以作為新型量子點(diǎn)熒光探針，在亞衍射級(jí)成像領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[12]

圖1NV色心金剛石晶體結(jié)構(gòu)示意圖[12] Fig.1Schematic diagram of the crystal structure ofNV color centerdiamond

1氮空位色心做熒光探針的機(jī)理

熒光探針常見的設(shè)計(jì)機(jī)理包括光致電子轉(zhuǎn)移、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、通過鍵能量轉(zhuǎn)移、內(nèi)部電荷轉(zhuǎn)移、扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移和聚集誘導(dǎo)發(fā)射[13]。對(duì)于氮-空位色心而言，主要的機(jī)理包括光致電子轉(zhuǎn)移和熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

內(nèi)部電荷轉(zhuǎn)移是最經(jīng)典的一種熒光探針發(fā)光機(jī)理，可以很容易地根據(jù)前線軌道理論來解釋[13]。如圖2所示，NV色心有NV和NV兩種電荷態(tài)，波長(zhǎng)為 1064nm 左右的近紅外光可以激發(fā)NV和 NV⁰ 的激發(fā)態(tài)發(fā)生電離，從而導(dǎo)致電荷轉(zhuǎn)移，改變兩種價(jià)態(tài)色心的分布，NV光穩(wěn)定且明亮， NV⁰ 則沒有顯著的熒光[14]。因此，近紅外光可以被視為控制色心熒光的“開關(guān)”，通過掃描收集微觀體系的熒光強(qiáng)度，可以反應(yīng)體系內(nèi)近紅外光的強(qiáng)度分布，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該體系的成像。這種機(jī)理對(duì)近紅外光有高度的敏感性，能夠幫助排除背景干擾。如此，近紅外光可以被有效地利用來控制色心的發(fā)光行為，提高光探針的活性和靈敏度，為微觀體系的研究提供更多可能。

圖2近紅外光電離激發(fā)態(tài)NV和 NV⁰ 示意圖[14] Fig.2Schematic diagram of NV^- and NV⁰ in the excited states ofnear-infraredphotoionization

熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理基于NV色心特殊的能級(jí)結(jié)構(gòu)[15]，如圖3所示，當(dāng)基態(tài) ³A₂ 的NV色心受 637nm（1.945eV） 的激發(fā)光照射后，會(huì)吸收能量躍遷至激發(fā)態(tài) ³E ，激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定的，電子會(huì)通過自發(fā)輻射能量回到基態(tài)，釋放出熒光，通過 637nm 激光的激發(fā)，可以實(shí)現(xiàn)熒光的“開關(guān)”效應(yīng)。

氮-空位色心熒光的“開關(guān)”機(jī)制，結(jié)合激STED、SIM、STORM等亞衍射級(jí)熒光顯微鏡成像技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)高精度成像。

除了熒光發(fā)光現(xiàn)象外，一般情況下， ms= ±1 的兩個(gè)能級(jí)是簡(jiǎn)并的，在外加 D=2.8GHz 磁場(chǎng)的作用下，這兩個(gè)能級(jí)會(huì)發(fā)生劈裂，改變NV色心的量子自旋狀態(tài)。利用這一性質(zhì)，結(jié)合亞衍射級(jí)熒光顯微鏡成像技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)多種物理場(chǎng)的高精度測(cè)量，其精度參數(shù)如表1所示。

圖3NV色心能級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖[1] Fig.3Schematic diagram ofNV color center energy level structure

表1 NV色心探測(cè)各物理場(chǎng)的性能[17]

Tab.1 TheperformanceofNVcolorcenterdetection foreach physics

一般情況下，選擇納米顆粒狀態(tài)的色心金剛石做熒光探針，稱為熒光納米金剛石（fluorescentnanodiamonds，F(xiàn)ND）。

2基于熒光探針的成像技術(shù)

基于熒光探針的成像技術(shù)主要可以分為三類，即STED、SIM、單分子定位顯微鏡（single-molecule localization microscopy，SMLM），其中STED方法可以直接提供亞衍射級(jí)分辨率的圖像，“所見即所得”，實(shí)時(shí)成像；而SIM和SMLM則需要通過數(shù)學(xué)重建算法實(shí)現(xiàn)亞衍射級(jí)成像，造成成像延遲，并且重建算法的質(zhì)量會(huì)影響圖像的質(zhì)量[]

STED方法的原理如圖4所示，該圖片來自NicoleGleichmann的工作。其中左邊為常規(guī)顯微鏡，只有一束綠色入射光束，分辨率受到阿貝極限限制。右邊為STED顯微鏡，人射光束被分為綠色光束和紅色的空心耗盡光束，后者使得邊緣的熒光探針被“關(guān)閉”，從而突破衍射極限?？梢钥吹?，其分辨率將從 200nm 提升到 50nm 甚至更高[3]

空心耗盡光束光強(qiáng)為 I_STED ，飽和光強(qiáng)為I_S ，根據(jù)公式

可以看到，理論上，空心耗盡光束光強(qiáng)可以無限增大，STED的分辨率可以無限小。但為了規(guī)避實(shí)際成像中空心耗盡光束對(duì)樣品的損傷，需要選擇合適的光強(qiáng)，一般被限制在 5×10³mW/m³ 以下，因而其分辨率往往被限制在 20nm 以上[24-25]

圖4STED原理示意圖

STED法已被廣泛應(yīng)用于成像，其分辨率可以到達(dá) 15nm^[26] 。通過結(jié)合固體浸入透鏡（solidimmersionlens，SIL）技術(shù)，用NV色心提高折射率和熒光亮度，其精度甚至可以達(dá)到 2.4nm^[27] 如圖5所示。

10nm 以下[28-29]乃至 4.1nm^[30] （2號(hào) 。

SIM 原理如圖6所示[31]。在光路上插入光柵、空間光調(diào)制器等裝置，將入射光調(diào)制成光束亮度規(guī)律性變化的圖案入射到樣品上，收集樣品反射的熒光信號(hào)。通過移動(dòng)和旋轉(zhuǎn)裝置獲得不同（至少3種角度）的熒光信號(hào)反饋并用計(jì)算機(jī)對(duì)其圖像進(jìn)行數(shù)學(xué)重建。結(jié)構(gòu)光規(guī)避了光束的衍射，從而實(shí)現(xiàn)突破衍射極限的目的。這類成像機(jī)制不太需要熒光可以“開關(guān)”的特性，因此色心在這一領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較少。

圖6SIM原理示意圖

Fig.6SchematicdiagramofSIM principle

STED和SIM成像都是確定性成像技術(shù)，SMLM則是基于隨機(jī)性的成像方法，包括STORM、光活化定位顯微鏡、量子成像技術(shù)等，以STORM技術(shù)為代表。

Fig.4Schematicdiagramof STED

圖5STED-SIL原理示意圖Fig.5Schematic diagramof STED-SIL principle

在此基礎(chǔ)上，根據(jù)推廣到基態(tài)耗盡（GSD）[28-29]、電荷態(tài)耗盡（CSD）方法[30]等，這些新的方法所需的耗盡光束強(qiáng)度遠(yuǎn)小于STED方法，一般低于 50mW/m³ ，可以有效規(guī)避對(duì)樣品的光損傷，因此可以進(jìn)一步提升成像分辨率到

STORM技術(shù)是基于對(duì)單個(gè)熒光點(diǎn)的精確定位技術(shù)。阿貝極限指出，當(dāng)若干個(gè)熒光點(diǎn)同時(shí)發(fā)光時(shí)，光點(diǎn)之間會(huì)發(fā)生衍射，因此STORM技術(shù)考慮每個(gè)循環(huán)里只讓一部分隨機(jī)的熒光點(diǎn)發(fā)光的方法避免距離較近的不同熒光點(diǎn)之間衍射對(duì)分辨率的不利影響，通過多次循環(huán)，將得到的圖像同樣通過計(jì)算機(jī)數(shù)學(xué)重建算法進(jìn)行組合，從而得到亞衍射級(jí)分辨率的圖像。這種方法理論上可以達(dá)到極高的分辨率，但其提高分辨率需要大量的循環(huán)次數(shù)，對(duì)計(jì)算量提出極大要求，導(dǎo)致分辨率受到算法和計(jì)算機(jī)算力的極大限制。但這一方法的優(yōu)勢(shì)是需要的入射光強(qiáng)可以低 ，適用于高質(zhì)量的樣品。且該方法統(tǒng)計(jì)的光子計(jì)數(shù)與電子自旋直接相關(guān)，因此可與光探測(cè)磁共振（ODMR）技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)微物理場(chǎng)的檢測(cè)。Pfen-derM團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用STORM技術(shù)對(duì)NV色心進(jìn)行成像，其半高全寬（fullwidthathalfmaximum，F(xiàn)WHM）達(dá)到了 27nm ，如圖7所示[32]。

widefield200nm 直 27 nm100X position [nm]（a）STORM成像 （b）點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

3基于氮-空位色心的成像技術(shù)的應(yīng)用

Tzeng等[33]用白蛋白包裹熒光納米金剛石（FND）導(dǎo)入hela細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行熒光標(biāo)記，基于FND分別進(jìn)行共聚焦和STED成像和熒光強(qiáng)度檢測(cè)，如圖8所示。可以看到，STED的精度達(dá)到了 40nm 左右，大大超越了共聚焦顯微鏡的精度，且點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)半高全寬極窄，為活性生命體內(nèi)生命活動(dòng)的研究提供了實(shí)時(shí)且高精度成像的方法。

圖7STORM成像與一維方向點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) Fig.7STORM imagingand1D directional pointspreadfunction

（a）共聚焦圖像；（b）STED圖像；（c）白線方向的熒光強(qiáng)度圖8共聚焦和 STED對(duì)FND標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行成像[3]Fig.8 Confocal and STED imaging of FND-labeledcells

在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，GregoireLaporte和DemetriPsaltis實(shí)現(xiàn)了基于綠色FND（gND）的STED 成像[34]，如圖9所示。綠色FND可以有效地與常見的紅色有機(jī)染料區(qū)分開來，實(shí)現(xiàn)雙色STED成像，同時(shí)表征多種特異性結(jié)構(gòu)。

Prabhakar團(tuán)隊(duì)則用STED-TEM光電聯(lián)合顯微鏡（CLEM）對(duì)內(nèi)體囊泡中內(nèi)化了FND的MDA-MB-23 細(xì)胞進(jìn)行成像，如圖10所示[35]?？梢钥吹剑現(xiàn)ND可以在惡劣的電鏡樣品制備條件下存在，并且可以直接在TEM超薄切片上使用STED和其他熒光顯微鏡成像。STED圖像可以作為TEM圖像的補(bǔ)充，彌補(bǔ)電鏡圖像無法感知熒光定位信號(hào)的缺陷。

FND在CLEM成像領(lǐng)域有著光明的應(yīng)用前景，因?yàn)榻饎偸瘷C(jī)械性能優(yōu)異且能在高能電子束下保持穩(wěn)定；由于原子密度大，它們還可以在電子顯微鏡中提供有用的對(duì)比度[36]。

圖9共聚焦和STED對(duì) gND 標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行成像[34]Fig.9Confocal and STED imagesof gND-labeled cells

圖10SLEM顯微鏡對(duì)FND標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行成像[35] Fig.10Imaging ofFND-labeled cells by SLEMmicroscopy

（a）SLEM成像圖，灰色為TEM圖，洋紅色為STED收集的FND熒光信號(hào)；（b）（c）線框區(qū)放大后的TEM、STED圖；（d）藍(lán)框處熒光強(qiáng)度分布及其洛倫茲擬合

基于NV色心的亞衍射級(jí)成像技術(shù)可以還用于微納結(jié)構(gòu)半導(dǎo)體發(fā)射器，對(duì)交替GaP/GaInP段（“條形碼”）形成的異質(zhì)結(jié)構(gòu)半導(dǎo)體納米線，利用GaInP片段特有的光致發(fā)光效應(yīng)，運(yùn)用GSD技術(shù)對(duì)其進(jìn)行成像，其精度為 78nm 左右。結(jié)合反卷積算法，可以提高到 75nm^[37] 。由于FND的熒光穩(wěn)定性，在SMLM技術(shù)中，他們不僅可以作為熒光標(biāo)記，還可以用作基準(zhǔn)標(biāo)記，用于校正由于環(huán)境振動(dòng)、電噪聲等外界原因?qū)е螺d物臺(tái)物理位移而引起的圖像像差。A.Balinovic團(tuán)隊(duì)的工作展示了這一點(diǎn)，如圖11所示[3]?？梢钥吹?，如果沒有FND作為基準(zhǔn)標(biāo)記，在較長(zhǎng)的圖像采集時(shí)間（30000幀）中，圖像的誤差將導(dǎo)致圖像模糊且誤差極大。

圖11用FND作為基準(zhǔn)標(biāo)記進(jìn)行成像Fig.11Imaging using FND asabenchmark marker

（a）（b）校準(zhǔn)前和校準(zhǔn)后FND的SMLM圖像；（c）（d）校準(zhǔn)前和校 準(zhǔn)后FND和其他染料染色后的細(xì)胞的SMLM圖像[38]

總結(jié)與展望

金剛石氮-空位色心因其優(yōu)異的性能，如穩(wěn)定的發(fā)光特性，獨(dú)特的光學(xué)亮態(tài)、暗態(tài)轉(zhuǎn)換特性，較長(zhǎng)的電子自旋相關(guān)時(shí)間，極高的生物兼容性等，作為新型量子探針在亞衍射級(jí)成像領(lǐng)域扮演著重要角色。金剛石NV色心還可以利用其自旋特性在微觀物理場(chǎng)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本文詳細(xì)分析了NV色心的熒光機(jī)理，介紹并對(duì)比了三類常見的亞衍射級(jí)成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)三類方式各有優(yōu)勢(shì)和不足：其中，STED成像實(shí)時(shí)直觀，但缺點(diǎn)是需要“逐點(diǎn)掃描”，成像緩慢，受光強(qiáng)限制，分辨率有限，需要與其他技術(shù)結(jié)合或者進(jìn)一步改進(jìn)；SIM成像速度更快，但需要圖像重建，容易引入誤差，需要尋找更好的圖像重建算法[3；STORM同樣存在類似問題，不過其需要的光強(qiáng)極低，適用于高質(zhì)量樣品?？傊鞣N成像方式有其優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，需要根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景選擇合適的方法。此外，相關(guān)技術(shù)的優(yōu)化也是未來重要的研究方向。

為拓展NV色心在成像領(lǐng)域的應(yīng)用，需要考慮如何抑制納米金剛石的“團(tuán)聚效應(yīng)”，F(xiàn)ND的團(tuán)聚會(huì)使細(xì)胞標(biāo)記變得困難，生成更厚的結(jié)構(gòu)，使得STED顯微鏡解析更困難，同時(shí)顆粒大小和色心密度的不均勻性會(huì)使定量研究復(fù)雜化[34]。一些研究指出，納米金剛石錐陣列可以固定納米金剛石位置，避免團(tuán)聚效應(yīng)，并且具有其他優(yōu)勢(shì)，如可以主動(dòng)刺穿樣品實(shí)現(xiàn)成像[39]，無需吞人樣品或其他導(dǎo)入過程；納米結(jié)構(gòu)還可以作光學(xué)腔，實(shí)現(xiàn)高效的光捕獲和提取[40]。通過這種結(jié)構(gòu)，NV色心可以更好地滿足相關(guān)領(lǐng)域的成像需求。

此外，還需要進(jìn)一步研究光場(chǎng)調(diào)控技術(shù)，優(yōu)化光路，通過性能更佳的光學(xué)系統(tǒng)降低需要的入射激光功率，提高成像效率，使基于NV色心的亞衍射級(jí)成像技術(shù)能更好的應(yīng)用于生物、材料科學(xué)、機(jī)電微納系統(tǒng)等相關(guān)領(lǐng)域

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（編輯：張磊）