鯽屬魚類線粒體D-loop區(qū)結(jié)構(gòu)及其系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號：S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）09-0077-06

Abstract：Carassus is agenus with widedistributioniAsiaandEurope.Due totheircomplex and variableapearancemophology， as wellas the existenceofmultiple ploidiesandreproductivemethods，theclasificationofthisgenus hsnotbeen wellresolved. In this study，PCR andDNA sequencing were employed tosequence the mitochondrial DNA（mtDNA）D-loopregion offour Carassius species：C.auratus auratus，C.auratus var.SuoguC.auratusvar.Pengze，and C.auratus.Theobtained sequences were then compared withthose publishedonNCBITheresultsshowedthat telengthofthe mtDNAD-loopsequences ofCarasiusrangd from 919 bp to 959 bp，with the average content of adenine （A） and thymine （T） being 65.7% and showing a bias in the base composition of A+T. The average interspecific genetic distance was between O.002 and O.O78. The genetic distance between C. auratus auratus and C.auratus var. Suogu， as well as between C.auratus var. Pengze and C.auratus gibelio clone D ，was the shortest，while thatbetween C.auratus in Qihe Riverand C carassius was the longest.A phylogenetic analysis was conducted on 15 Carassius species via the neighbor-joining method，clusteringthe15speciesintofourmajorcdes.CladeIincluded10speciesofnativespeciesandselected breeds in China. Clade II consisted of three species of Japanese crucian carp.Clade III was C. cuvieri，andCladeIV was C carassius. Clade Icould be further clasified into three subclades （A，B，and C）. C.auratus auratus showed acloser kinship with C_? auratus var. Suogu，while C.auratus var.Pengze had a closer kinship with C.auratus gibelio.

Keywords：Carassius;D-loop region; phylogeny

鯽屬（Carassius）系鯉形目（Cyprini-formes）鯉科（Cyprinidae）魚屬，是我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，廣泛分布于亞歐地區(qū)。由于其外觀形態(tài)復(fù)雜多變，且存在多種倍性和繁殖方式，其分類一直沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[。我國魚類學(xué)家認(rèn)為，中國大陸鯽屬魚類可劃分為鯽（Carassiusauratus）與黑鯽（Carassiuscarassius），其中鯽（C.auratus）可進(jìn)一步細(xì)分為鯽指名亞種和銀鯽亞種[2]。程磊等[3]的研究將鯽屬魚類分為鯽、白鯽和黑鯽3個(gè)種。

線粒體DNA（MitochondrialDNA，mtDNA）具有結(jié)構(gòu)簡單、分子量小、嚴(yán)格母系遺傳、幾乎無重組、檢測便捷等特點(diǎn)；其非編碼區(qū)演化速率快，但編碼區(qū)受自然選擇約束，且存在異質(zhì)性與閾值效應(yīng)等復(fù)雜特性，被作為有效的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于魚類進(jìn)化學(xué)和群體遺傳學(xué)研究。常用的魚類mtDNA分子標(biāo)記有細(xì)胞色素b基因（Cytochromeb， Cytb ）、ND、COI、COⅡ和控制區(qū)（D-loop）等[4]。劉蘭苑等[5基于線粒體 Cytb 基因?qū)?4種光唇魚種進(jìn)行有效種的鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將14種光唇魚分為2大支系；李強(qiáng)等[對縮骨鯽（Carassiusauratusvar.suogu）線粒體 Cytb 基因進(jìn)行測序并使用NJ和MP2種方法構(gòu)建鯽屬魚類進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)了縮骨鯽與紅鯽、淇河鯽和野鯽存在較近的親緣關(guān)系；杜民等[7]選取線粒體ND6基因作為分子標(biāo)記，對巨丕遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)巨群體的遺傳多樣性處于較高水平，而分布于不同河流的巨胚群體間存在遺傳分化現(xiàn)象。

線粒體DNA控制區(qū)（D-loop）處于 tRMA^Pro 與tRNA^Phe 基因之間，屬于非編碼區(qū)域。該區(qū)域結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)3部分組成，其進(jìn)化速率是mtDNA其他區(qū)段的2～5倍[8]。研究此區(qū)段的序列，能較好地反映種內(nèi)群體或種間群體的遺傳變異情況。袁娟等基于D-loop區(qū)研究了銅魚9個(gè)地理群體之間的遺傳關(guān)系，結(jié)果表明9個(gè)地理群體屬于同一種群。

本研究通過PCR擴(kuò)增及基因測序獲取4種鯽屬魚類mtDNAD-loop區(qū)序列，整合NCBI已發(fā)表的11種同源序列，基于15個(gè)物種的聯(lián)合數(shù)據(jù)集計(jì)算遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，解析鯽屬魚類親緣關(guān)系與分類框架，以期為鯽屬魚類的鑒定與分類提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用金魚（C.auratusauratus）購自廣東省市花鳥魚蟲市場;縮骨鯽（ C. auratusvar. suogu）和彭澤鯽（C.auratusvar.Pengze）采自廣東省韶關(guān)市；鯽（C.auratus）采自廣東省市。采樣時(shí)間為2025年2一3月，將采集的活魚麻醉后進(jìn)行解剖，剪取樣本尾鰭后立即用 95% 的無水乙醇固定，于 -20% 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提取：采用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒，具體操作按說明書進(jìn)行；使用Primer5工具進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，引物序列如下：正向引物（F）：5^′ -TTTTAACTCTCACCCCTGGC-3'；反向引物（R）：5'-TTGAGGGCATATTCACTGGG-3'。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（ 25μL ）：模板DNA2μL，正向引物和反向引物各 1μL ， 2× TaqPCRMasterMix

13.5μL ， ddH₂O7.5μL 。PCR反應(yīng)條件： 94^°C 預(yù)變性 3min ; 95°C 變性 0.5min ， 55^°C 退火 0.5min 72% 延伸 1.5min ，35個(gè)循環(huán)； 72% 延伸 10min [6]。使用 1% 瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純度檢測。

mtDNAD-loop區(qū)測序：收集條帶清晰的PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

完成測序后，將獲得的序列原始數(shù)據(jù)（如FASTQ文件）提交至NCBI平臺；利用BLAST工具進(jìn)行同源性比對，篩選高置信度自標(biāo)序列；隨后通過ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對，并進(jìn)行人工校正。使用MEGA11.0軟件對所測mtDNAD-loop區(qū)序列和從NCBI中下載的鯽屬魚類的mtDNAD-loop區(qū)序列進(jìn)行比對，統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成；利用MEGA11.0軟件，調(diào)整自舉值至1000，使用雙參數(shù)法[0]計(jì)算鯽屬魚類mtDNAD-loop區(qū)序列的遺傳距離；使用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行親緣關(guān)系分析。本研究所有物種相關(guān)信息見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽屬魚類mtDNAD-loop 堿基組成

研究運(yùn)用特定引物對4種鯽屬魚類的mtDNAD-loop區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均成功獲得相應(yīng)序列（圖1）。如表2所示，將試驗(yàn)測定的序列與NCBI中已有的鯽屬魚類序列整合分析后發(fā)現(xiàn)，鯽屬魚類mtDNAD-loop區(qū)序列去除載體及引物序列后，長度在919～959bp之間。堿基組成分析顯示，腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）鳥嘌呤（G）的平均含量分別為 32.8% 、 32.9% 一 20.3% 、 14.0% 。其中，A⁺T 的平均含量為 65.7% ， C+G 的總平均含量為34.3% ，呈現(xiàn)出的 A+T 堿基組成偏倚性，表明線粒體控制區(qū)具有更強(qiáng)的變異性與更快的進(jìn)化速率，適用于研究種間進(jìn)化關(guān)系。

2.2 鯽屬魚類遺傳距離分析

15條鯽魚的D-loop序列的遺傳距離如表3所示，各物種種間平均遺傳距離處于0.002～0.078之間。遺傳距離為0.002的有金魚與縮骨鯽、彭澤鯽與方正銀鯽D品系，表明其親緣關(guān)系較近；銀鯽與彭澤鯽之間的遺傳距離為0.003，表明2種魚也存在較近的親緣關(guān)系；遺傳距離最大的是淇河鯽與黑鯽（0.078），表明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；其中黑鯽與其他魚的種間遺傳距離都比較大，均超過了0.050，表明黑鯽與本研究其他鯽屬魚類都存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

表1研究所用物種的mtDNAD-loop區(qū)序列信息

圖14種鯽屬魚類mtDNAD-loop區(qū)片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2D-loop區(qū)序列長度和堿基組成

2.3基于鄰接法（NJ）構(gòu)建的鯽屬魚類系統(tǒng)發(fā)育樹

基于鄰接法構(gòu)建的15條鯽屬魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）顯示，引入的窄條光唇魚與其余鯽屬魚類有明顯的區(qū)分，屬于外類群；其他15個(gè)鯽屬魚類聚類為4大支系。支系I涵蓋包括縮骨鯽在內(nèi)的10種中國本土鯽魚及選育種；支系Ⅱ包括伯格氏鯽、蘭氏鯽和長背鯽在內(nèi)的3種日本鯽魚；支系Ⅲ為白鯽；支系V為黑鯽。支系I又可分為A系（縮骨鯽、金魚、淇河鯽、紅鯽、鯽）B系（方正銀鯽E品系、方正銀鯽D品系、銀鯽、彭澤鯽）和C系（萍鄉(xiāng)肉紅鯽）3個(gè)姐妹系。其中縮骨鯽和金魚聚成一支，彭澤鯽與銀鯽及其其他培育品系聚成一支，說明其親緣關(guān)系較近。

3 討論

3.1 鯽屬魚類mtDNAD-loop 序列組成

傳統(tǒng)分類學(xué)主要通過外形特征、骨骼結(jié)構(gòu)、攝食習(xí)性以及生活史等多方面信息對魚類進(jìn)行分類。對于一些魚類種內(nèi)細(xì)微的分化特征，傳統(tǒng)分類方法無法實(shí)現(xiàn)精確分類。基于分子遺傳學(xué)的D-loop分子標(biāo)記技術(shù)通過識別mtDNA序列中的堿基變化來實(shí)現(xiàn)精確分類的目的，這對于研究動(dòng)物的遺傳分化有重要意義[11]。本研究對15 種鯽屬魚類的 mtDNA D-loop區(qū)序列組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鯽屬魚類mtDNAD-loop區(qū)序列長度為919～959bp，符合Lee等[12]發(fā)現(xiàn)的硬骨魚線粒體控制區(qū)長度在 856～1500bp 之間；鯽屬魚類mtDNAD-loop區(qū)序列AT平均含量（ 65.7% ）明顯高于CG平均含量（ 34.4% ），略低于鯉亞科mtDNAD-loop 區(qū)序列AT平均含量（67.48%）[13]

表3鯽屬魚類兩兩對比的種間遺傳距離

圖2基于鄰接法構(gòu)建的鯽屬魚類系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 鯽屬魚類的系統(tǒng)地位分析

白鯽又稱大阪鯽、源五郎鯽、日本鯽，原產(chǎn)于日本琵琶湖，1976年引入中國后，已在廣東、臺灣、江浙等南方多地廣泛分布，成為常見養(yǎng)殖及野生魚種之一[14]；黑鯽自然分布于歐洲與西亞，可能起源于東方（亞洲）[15]。依據(jù)我國魚類學(xué)家的研究觀點(diǎn)，中國大陸的鯽屬魚類可劃分為鯽和黑鯽2個(gè)種類，鯽又能進(jìn)一步細(xì)分為鯽指名亞種以及銀鯽亞種[16]；而日本學(xué)者在對日本鯽魚進(jìn)行分類時(shí)，則將其區(qū)分為鯽和白鯽2類[3]。本研究基于鯽屬魚類的mtDNAD-loop區(qū)序列構(gòu)建進(jìn)化樹，認(rèn)為可將鯽屬魚類分為白鯽、黑鯽、鯽和日本鯽4種，其中日本鯽包括長背鯽、蘭氏鯽和伯格氏鯽。Nakabo等[17]將鯽屬魚類分為白鯽和鯽2大類，其中鯽包括長背鯽、蘭氏鯽和伯格氏鯽等在內(nèi)的5種鯽魚，本研究觀點(diǎn)與之一致；Podlesnykh等[18]將日本境內(nèi)的長背鯽與白鯽分為2個(gè)獨(dú)立的分支，同時(shí)發(fā)現(xiàn)2種鯽魚與銀鯽的遺傳距離較遠(yuǎn)，此觀點(diǎn)支持本研究將銀鯽、白鯽和長背鯽分為不同支系的結(jié)論。

本研究將鯽（分支I）分為A、B、C3個(gè)姐妹支系，其中彭澤鯽與方正銀鯽D品系聚成一支。前人研究發(fā)現(xiàn)，雌核發(fā)育銀鯽品系內(nèi)具有高度的遺傳同質(zhì)性且方正銀鯽A品系與彭澤鯽的平均遺傳距離僅為0.001^[19-20] ，本研究中雖未比對方正銀鯽A品系與彭澤鯽的序列，但胡玉婷等[21]對鯽屬魚的分類研究中，將方正銀鯽D品系與方正銀鯽A品系聚成一支，可推測方正銀鯽D品系與彭澤鯽也存在較近的親緣關(guān)系，也驗(yàn)證了本研究結(jié)果。本研究將鯽、紅鯽、淇河鯽和縮骨鯽歸為同一支系（支系I-A），這與李強(qiáng)等基于線粒體 Cytb 基因?qū)a屬魚類的分類結(jié)果一致。同時(shí)將金魚也歸入支系I-A，且與縮骨鯽聚成一支；Komiyama等[22在金魚起源的研究中，通過聚類分析將金魚與白鯽和蘭氏鯽分為不同支系，本研究與之觀點(diǎn)一致，同時(shí)認(rèn)為金魚起源于中國的銀鯽。目前，關(guān)于金魚與中國本土鯽魚及鯽屬魚類選育種系統(tǒng)發(fā)育的研究較少，金魚的系統(tǒng)地位有待進(jìn)一步討論。

4結(jié)論

本研究首次基于鯽屬魚類的mtDNAD-loop區(qū)序列分析了鯽屬魚類D-loop序列的組成，并構(gòu)建了15條鯽屬魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹。15條鯽屬魚 A⁺T 的平均含量為 65.7% ， C+G 的平均含量為 34.3% ；構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹大致將15條鯽屬魚分為4大支系，其中支系I為中國本土鯽魚及選育種，支系Ⅱ?yàn)槿毡决a魚，支系Ⅰ又可分為3個(gè)姐妹系。在本研究測序的3種鯽魚中，縮骨鯽與金魚同屬于支系I中的A支系且聚成一支，彭澤鯽與銀鯽及其他品系構(gòu)成支系I中的B支系；萍鄉(xiāng)肉紅鯽自成支系I中的C支系，與其他中國本土鯽魚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

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（責(zé)任編輯：成平）