紫五加根莖中總黃酮含量的測定

胡棟寶+黃太聚+李瀟雨

摘要：以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法，于420 nm波長處測定吸光度，計算紫五加（Acanthopanacis senticosi Radix）根莖中總黃酮的含量。結果表明，在4～28 μg/mL的范圍內，蘆丁含量與吸光度有良好的線性關系，加標回收率為100.25%（n=4，RSD=0.92%），紫五加根莖提取液中總黃酮平均含量29.62 μg/mL。該方法簡便、快速、準確、靈敏，可作為紫五加根莖中總黃酮含量的測定方法。

關鍵詞：紫五加（Acanthopanacis senticosi Radix）；紫外分光光度法；總黃酮；含量

中圖分類號：O657.32；O949.763.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）22-4341-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.033

Abstract： Rutin was used as control， the absorbance was determined at the wavelength of 420 nm by UV spectrophotometry， and the content of total flavonoids in roots of Acanthopanacis senticosi Radix was calculated. The results showed that at 4～28 μg/mL，there was a good linear relationship between rutin content and absorbance，the recovery rate was 100.25%（n=4，RSD=0.92%），the average content of total flavonoids in stems of Acanthopanacis senticosi Radix is 29.62 μg/mL. This method is simple，rapid，accurate and can be used as a method for the determination of total flavonoids in roots of Acanthopanacis senticosi Radix.

Key words： Acanthopanacis senticosi Radix； UV spectrophotometry； total flavonoids； content

紫五加（Acanthopanax senticosi Radix），隸屬五加科，生長于灌木叢中，現已實現人工栽培，莖桿為淺紫色，果實呈球狀，有特異香氣[1]。紫五加在云南省墨江縣成為了特有的特色生態蔬菜。紫五加具有生津止渴、提高睡眠質量、消除精神疲勞等功效，被譽為“睡眠專家”和“血管清道夫”。

黃酮類化合物是具有酮式結構的一類化合物，主要有抗氧化、抗腫瘤、抗微生物和除味等功能，對植物體的生長發育起著重要的作用。黃酮類化合物大多不溶于水，易溶于有機溶劑，其分子中大多含有酚羥基而使該化合物呈酸性，因此易溶于稀堿性水溶液、吡啶及二甲基甲酰胺等有機溶劑[2]。黃酮類化合物可發生氫氧化鈉反應、鋁鹽反應、濃硫酸反應、濃氨水反應、鐵離子反應、鹽酸-鋅粉反應，因此，可將該類反應用于鑒定黃酮類化合物[3]。目前國內提取黃酮的方法主要有索氏提取法、超聲波浸提法、微波提取法、加熱回流法、溶劑萃取等方法。

本研究以墨江縣紫五加為研究對象，采用紫外分光光度法測定紫五加根莖中總黃酮含量，將為該種生物資源的開發利用提供理論方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 所用樣品采自云南省普洱市墨江縣，經墨江縣農經站農藝師許忠鑒定為紫五加，樣品保存于玉溪師范學院資源環境學院植化室。

1.1.2 儀器和試劑

1）儀器。索氏提取器、可調控溫電熱套、電子分析天平、UV-2550型紫外分光光度計。

2）試劑。116 μg/mL蘆丁試劑，精密稱取蘆丁對照品5.8 mg（已于105 ℃恒重），用40%乙醇溶解，并定容至50 mL[4]；0.1 moL/L三氯化鋁溶液，取結晶三氯化鋁2.46 g于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，備用；1.0 moL/L醋酸鈉溶液，取無水醋酸鈉8.20 g于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，備用。

1.2 方法

1.2.1 紫五加根莖中總黃酮的提取 準確稱取經預處理后的紫五加根莖粉末1 g，用濾紙包裹后放入索氏提取器中，加入100 mL 40%的乙醇溶液回流提取，直到顏色變得較淺為止，用相應濃度的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中（反復洗滌圓底燒瓶及濾紙包）備用。

1.2.2 最大波長的選取 準確移取116 μg/mL的蘆丁標準溶液1.00 mL于25 mL比色管中，分別加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL、1 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻放置40 min，在200～800 nm處測定吸光度，以試劑空白做參比，將最大吸收峰作為最佳測定波長，以該波長作為試驗的測定波長。

1.2.3 蘆丁標準曲線的繪制 精確吸取蘆丁標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL比色管中，按表1加試劑，用40%乙醇溶液定容、混勻，靜置40 min，于420 mm處測定吸光度，用試劑空白做參比在最大波長420 nm處測定其吸光度，繪制蘆丁標準曲線。并以蘆丁濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線[5]。

1.2.4 單因素試驗

1）提取濃度的選擇。準確稱取1.000 g經預處理后的紫五加莖粉末，用濾紙包好后放入索氏提取器的提取筒中，用濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液100 mL回流提取2 h，將提取液移至100 mL的容量瓶中定容，移取同一的樣品液15.00 mL于25 mL的3支比色管中，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL；加入1.0 mol/L醋酸鈉溶液5 mL， 用不同濃度的乙醇定容、搖勻，放置40 min。以試劑空白作參比，在420 nm處測定其吸光度。

2）提取時間的選擇。稱取1 g經預處理后的紫五加莖粉末，在索氏提取器中放入已經用濾紙包裹好的紫五加莖粉末，加入40%乙醇溶液100 mL分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 6組樣品，轉移至10 mL的容量瓶并定容，準確移取1 mL樣品溶液于3支25 mL比色管中，分別加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL；加入1.0 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，定容并混勻，放置40 min。測定吸光度并用試劑空白作參比。

2 結果與分析

2.1 最大波長的選取

由圖1所示，在400～460 nm范圍內，吸光度先隨波長的增加而增加，到420 nm后開始下降，而在420 nm處的吸收峰為最大值，因此選用420 nm為最大吸收波長[6]。

2.2 蘆丁標準曲線的繪制

由圖2可知，該標準曲線的回歸線方程為y=0.022 4x-0.003 4，R2=0.999 7，（y為吸光度，x為蘆丁濃度）。蘆丁濃度在4～28 μg/mL范圍內具有較好的線性關系。

2.3 提取條件的優化

2.3.1 提取濃度的選擇 由圖3可以看出，在其他條件保持不變的情況下，紫五加根莖中的總黃酮含量隨著乙醇濃度的升高而升高，而當乙醇濃度為40%時總黃酮含量達到最大值，隨后總黃酮的含量逐漸降低，可能是隨著乙醇濃度的增大，有些醇溶性雜質也會隨之增加，從而影響了總黃酮的析出，因此，乙醇濃度選擇40%較好。

2.3.2 提取時間的選擇 由圖4可以看出，在其他條件保持不變的情況下，紫五加根莖中總黃酮含量隨著時間的增大而增大，2 h時總黃酮含量達到最大值，隨后總黃酮含量逐漸降低，時間越長越不利于總黃酮提取，因此，提取時間選擇為2 h較好。

2.4 樣品中總黃酮含量的測定

準確稱取1.000 g經預處理后的紫五加根莖粉末，用濾紙包好后放入索氏提取器中，用濃度為 40%乙醇溶液提取2 h，將提取液定容至100 mL，分別移取15.00 mL于4支25 mL比色管中，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL、1 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容，搖勻放置40 min。以試劑空白作參比，在420 nm處測定其吸光度，計算樣品中的總黃酮含量[7]，結果見表2。

2.5 精密度試驗

準確移取已提取好的樣品溶液10 mL于25 mL比色管中，并加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL、 1 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容，搖勻放置40 min。以試劑空白作參比，在420 nm處測定其吸光度，連續測5次[8]，測得吸光度并計算含量，結果見表3。

2.6 回收率試驗

精密稱取已知總黃酮含量的紫五加根莖粉末約1 g，置于磨口錐形瓶中分別加入1 mg/mL的蘆丁標準溶液5 mL，按前面樣品處理法提取，計算總黃酮含量和回收率，平均回收率為100.25%，RSD=0.92%，結果見表4。

3 小結

紫五加根莖中總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度為40%、提取時間2 h，并通過以蘆丁為基準物，用氯化鋁-醋酸鈉為顯色劑在紫外分光光度計下測量繪制出標準曲線，根據回歸線方程y=0.022 4x-0.003 4，R2=0.999 7，計算出紫五加根莖提取液中總黃酮的平均含量為29.62 μg/mL。

參考文獻：

[1] 徐 禮.中草藥有效成分分析法（下冊）[M].北京：人民衛生出版社，1984.

[2] 曹根生.脈安沖劑總黃酮的含量測定方法的初步研究[J].中成藥研究，1981，6（12）：13-15.

[3] 王小寧，楊黎彬，劉少靜.正交實驗優化山楂總黃酮提取工藝[J]. 應用化工，2012，41（11）：1963-1965.

[4] 程昆木，王 斌，曾偉芹，等.刺五加總黃酮含量的分析[J].人參研究，2006，18（2）：17-19.

[5] 孫玉艷，崔玉海，張 穎，等.紫外分光光度法測定刺五加口服液中總黃酮含量[J].中國新技術新產品，2010（14）：17.

[6] 于 潔，豐貴鵬，程 迪，等.刺五加注射液中總黃酮含量測定[J].平原大學學報，2007，24（6）：117-118.

[7] 劉偉玲.刺五加葉中的主要活性成分分析[J].中醫藥導報，2009， 15（7）：87-88.

[8] 王 穎，孫 捷，邢桂菊，等.刺五加片質量標準探討[J].時珍國醫國藥，2001，12（2）：119-120.

[9] 徐 曉，劉起華，范 慧，等.刺五加口服液中總黃酮含量測定[J].中國林副特產，2002（1）：41.