羊口瘡病毒F1L融合Fe蛋白的表達與鑒定

邢雪 王元紅 李傳峰 繆秋紅 曹昳 王桂軍 劉光清

摘要：本研究克隆了羊口瘡病毒安徽分離株的F1L基因，融合Fe蛋白編碼基因后，插入載體pET-32a中，構建了重組質粒pET-F1L-Fe。將pET-F1L-Fe轉化BL21（DE3）感受態細胞，用IPTG誘導表達重組蛋白F1L-Fe。SDS-PAGE分析結果顯示，羊口瘡病毒F1L-Fe基因在BL21（DE3）獲得了正確表達。將大量表達的F1L-Fe蛋白進行純化，然后免疫BALB/c鼠，制備了抗F1L蛋白的多克隆抗體。最后，以制備的多克隆抗體對F1L-Fe融合蛋白進行Western-blot檢測和分析，結果表明F1L-Fe蛋白能與制備的多克隆抗體發生特異性反應，具有良好的反應原性。本研究結果為進一步研發羊口瘡病毒亞單位疫苗提供了物質基礎。

關鍵詞：羊口瘡病毒;F1L-Fe蛋白;多克隆抗體

中圖分類號：S855.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0130-06

Abstract：In this study， the F1L gene of orf virus（ORFV） Anhui isolated strain was cloned. After fusing with the coding gene of Fe protein， it was inserted into the expression vector pET-32a to construct recombinant plasmid pET-F1L-Fe. Subsequently， pET-F1L-Fe was transformed into BL21（DE3） competent cells， and the expression of recombinant protein F1L-Fe was induced by IPTG. The results of SDS-PAGE showed that the F1L-Fe gene was successfully expressed in BL21（DE3）. Then the F1L-Fe protein was expressed in large quantities and purified. To prepare the polyclonal antibody against F1L protein， BALB/c mice were immunized with the recombinant protein. Western blot results indicated that the F1L-Fe protein reacted specifically with the prepared polyclonal antibody and showed good reactogenicity. In a word， the results of this study provide the material foundation for further developing the subunit vaccine against ORFV.

Key words：orf virus（ORFV）;F1L-Fe protein;polyclonal antibody

羊口瘡（ORF），即羊傳染性膿皰（Contagious secthyma），是一種主要在病畜鼻孔、嘴唇處出現膿皰以及丘疹等病癥的流行病，該病主要感染1～3月齡的羔羊[1-2]。中國養羊地域均出現過該病，并且發病率呈顯著的上升趨向，危害著中國養羊業的發展，嚴重阻礙了中國畜牧業的持續發展[3-6]。

羊口瘡病毒（ORF virus， ORFV） 為線性雙鏈DNA病毒，屬痘病毒科副痘病毒屬，基因組大小約134 kb [7]。其中 ORFV 059 基因編碼F1L 蛋白，F1L蛋白作為羊口瘡的主要免疫原蛋白，能激發機體產生免疫反應，誘發宿主產生中和抗體[8]。因此，F1L蛋白可以作為研發羊口瘡新型疫苗的免疫原蛋白之一。

在疫苗開發方面，Fe蛋白作為普遍存在于生物界的鐵貯藏蛋白，有自組裝形成納米顆粒的功能，主要技術體現在鐵蛋白納米籠的高度對稱和自組裝性，形成了一個有效的抗原遞送系統，廣泛應用于疫苗、藥物研發等行業。在已開發研究的疫苗中，鐵蛋白作為抗原的理想載體，已成功將來自HIV-1病毒的Tat蛋白和流感病毒的血凝素蛋白分別與幽門螺旋桿菌的鐵蛋白融合形成納米籠，激起體液反應并誘導產生中和抗體，成功地開發了能夠有效針對這些病原體的疫苗[9] 。

本研究即在選擇ORFV F1L為靶基因，去除其跨膜區后，與鐵蛋白基因融合，構建重組質粒pET-F1L-Fe，然后轉化感受態細胞BL21（DE3）表達重組融合蛋白F1L-Fe，并制備抗F1L-Fe重組蛋白的多克隆抗體，以便為研發ORFV亞單位疫苗提供物質基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒、細胞和菌株羊口瘡病毒株及其陽性血清、載體pET-32a均由本實驗室儲藏; DH5α 和BL21（DE3）感受態細胞均來自TransGen Biotech公司。

1.1.2主要試劑LA Taq 聚合酶購自TaKaRa（大連）公司，pMD19T載體、SolutionⅠ連接酶、 EcoR Ⅰ和EcoR V限制性內切酶購自NEB（北京）公司，質粒小提試劑盒來自美國AXYGEN 公司，膠回收試劑盒來自Sangon Biotech公司，兔抗羊IgG-HRP來自CW Bio公司，ECL化學發光試劑盒來自美國 Thermo 公司，其余試劑均為分析純。

1.1.3試驗動物5周齡的BALB/c健康雌鼠來自上海杰思捷實驗動物有限公司[許可證號碼：SCXX（滬）2018-0004]。

1.2方法

1.2.1重組質粒pET-F1L-Fe的構建據GenBank上已發表的ORFV F1L基因序列，去除其跨膜區（TMH）設計用于擴增F1L截短基因的PCR引物，擴增片段大小為873 bp。并設計融合PCR引物通過linker蛋白（SGG）將F1L與Fe連接起來，上下游引物兩端分別添加酶切位點EcoR ?I和EcoR Ⅴ。引物（由上海擎科公司合成）序列見表1。

先以ORFV基因組為模板以F1L F/F1L R為引物進行PCR擴增，膠回收后連接PMD-19T，轉化后獲得PMD-19T-F1L，然后將上述重組質粒以引物F1L （TMH）-F/F1L R（TMH）進行PCR擴增，膠回收后加DMT（Dimethyl terephthalate， 對苯二甲酸二甲酯）轉化DH5α后，挑取單克隆進行PCR鑒定，鑒定正確后分別以F1L-Fe F1 （EcoR V）/F1L-Fe R2 （EcoR V）為引物擴增F1L（TMH），以F1L-Fe F2/F1L-Fe R1 （EcoRⅠ）為引物擴增Fe蛋白，膠回收后進行融合PCR，第一次反應條件為95 ℃預變性 5 min;94 ℃ 20 s、72 ℃ 90 s ，10個循環;72 ℃延伸 5 min， 第一次反應結束后，取出PCR管加入引物F1L-Fe F1 （EcoR V）、F1L-Fe R1 （EcoRⅠ）。第二次反應條件為95 ℃預變性 5 min;94 ℃ 20 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s，10個循環;72 ℃延伸 5 min。待反應結束后，膠回收 PCR 產物。用EcoR ?I和EcoR Ⅴ 雙酶切后膠回收，然后與經EcoR I和EcoR Ⅴ雙酶切的pET-32a載體連接，并轉化DH5α，于含AMP （氨芐青霉素，Amoxicillin）的LB平板37 ℃培養。次日挑單克隆并進行PCR鑒定。鑒定正確后進行EcoR I和EcoR Ⅴ雙酶切鑒定，將雙酶切驗證準確的質粒送桑尼（上海）公司測序。

1.2.2F1L-Fe蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析將質粒pET-F1L-Fe轉化感受態細胞BL21（DE3），挑取單克隆于含AMP的LB培養液中，37 ℃、220 r/min培養。OD600值為0.6～0.8時，加1 mmol/L的IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），分別以16 ℃，220 r/min誘導過夜， 37 ℃，220 r/min誘導5 h，取菌液，經12 000 r/min離心1 min，棄上清液。加PBS重懸，與蛋白質上樣緩沖液混勻，95 ℃ 10 min后進行SDS- PAGE電泳分析。

1.2.3F1L-Fe蛋白的可溶性分析及純化取3 ml菌液到300 ml的含AMP的LB培養液中，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃，220r/min誘導5 h，將已誘導的菌液4 ℃ 8 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入30 ml PBS吹打混勻沉淀，離心，重復上述步驟3次。最后向沉淀加入10 ml PBS后超聲裂解，最后4 ℃ 8 000 r/min離心20 min，SDS-PAGE電泳分析沉淀和上清液。結果證明F1L-Fe重組蛋白主要以包涵體的形式存在，收集沉淀，分別加2 mol/L、4 mol/L尿素洗滌沉淀，離心取沉淀，用4 ml 8 mol/L尿素溶解沉淀，離心，將上清液放于透析袋中透析復性，獲得目的重組蛋白。

1.2.4F1L-Fe蛋白的透射電鏡觀察取重組融合蛋白F1L-Fe ?4 ℃，8 000 r/min離心10 min，吸取20 μl上清液滴于封口膜，銅網吸附3～5 min，以10 g/L磷鎢酸（pH 6.8～7.4）負染1 min，透射電鏡（TEM）下觀察并拍照。

1.2.5F1L-Fe蛋白的Western-blot鑒定將F1L-Fe蛋白經SDS-PAGE電泳后，半干轉法轉移至硝酸纖維素濾膜（CN）上，使用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉2 h。加ORFV陽性血清為一抗，4 ℃孵育12 h，TBST清洗3次。加兔抗羊IgG-HRP為二抗，37 ℃孵育1 h，清洗后ECL顯色觀察。

1.2.6F1L-Fe蛋白的鼠源多克隆抗體的制備與鑒定將融合蛋白F1L-Fe與弗氏完全佐劑等比例混合，乳化完全后免疫5周齡 BALB/c雌鼠， 每只50 μg皮下注射，7 d后進行第二次免疫，將融合蛋白F1L-Fe與弗氏不完全佐劑等比例乳化后，每只50 μg皮下注射。首次免疫后的第4周和第6周進行第三次和第四次免疫，步驟與第二次免疫相同。第四次免疫后7 d小鼠眼眶處采血，分離血清。以獲得的小鼠血清為一抗，以F1L-Fe融合蛋白為抗原，進行Western-blot鑒定分析。

2結果

2.1F1L-Fe基因PCR 擴增

PCR 擴增產物，在700～1 000 bp處有特異性條帶，約873 bp，與預期相符合（圖1A）。融合PCR擴增產物，在1 000～2 000 bp處有特異性條帶，約1 371 bp，與預期相符合（圖1B）。

2.2F1L-Fe蛋白的誘導表達及鑒定

將鑒定正確的表達質粒pET-F1L-Fe轉入BL21（DE3）進行誘導表達，電泳結果表明，表達質粒PET-F1L-Fe經IPTG誘導后出現了特異性蛋白條帶，相對分子質量大小約70 000，與預期相符合，且在37 ℃下誘導的蛋白質產量顯著多于其他條件。結果說明，在37 ℃、1 mmol/L IPTG、4 h條件下能夠獲得正確的蛋白質表達且表達量較大（圖2）。

2.3F1L-Fe蛋白的可溶性分析及純化

SDS-PAGE分析結果表明，融合蛋白F1L-Fe主要出現在沉淀中。說明重組融合蛋白F1L-Fe主要以包涵體的方式存在（圖3A）。尿素純化該包涵體蛋白，純化后通過SDS-PAGE分析，結果獲得了相對單一的目的條帶（圖3B）。

2.4F1L-Fe蛋白的透射電鏡負染觀察

透射電鏡負染觀察可見F1L-Fe蛋白可自組裝為球形顆粒，大小均一且結構、形態穩定，直徑約100 nm（圖4）。

2.5F1L-Fe蛋白的Western-blot 鑒定及其多克隆抗體的制備

使用羊口瘡陽性血清對F1L-Fe重組融合蛋白進行Western-blot試驗，結果顯示在約70 000處有特異性條帶，表明重組融合蛋白F1L-Fe已獲得準確表達且能夠被ORFV 陽性血清特異識別（圖5A）。用鑒定正確的重組融合蛋白免疫小鼠，第四次免疫后7 d，采血并分離小鼠血清，將該血清作為一抗，以純化后的重組融合蛋白F1L-Fe作為抗原，Western-blot 分析鑒定結果表明，獲得的鼠源多克隆抗體血清能夠與重組融合蛋白F1L-Fe發生特異性反應（圖5B）。

3討論

羊口瘡病主要病癥是在患病羊的口唇、顎及舌面等大量長出水皰丘疹，水皰部位會出現結痂從而引起患病羊進食困難，消瘦、抵抗力下降甚至死亡 [10]。目前該病在中國養羊區流行普遍，又屬于人畜共患病，不僅感染羊，也威脅了養殖人員的健康，因此羊口瘡病的暴發與流行對中國養殖業的發展及人類的健康都有嚴重的威脅。目前，羊口瘡病的暴發趨勢逐年上升，但對該病的治療尚無特效方法，國內外在防控方面上主要以接種羊口瘡弱毒活疫苗的方法進行預防，但是仍然不能預防和控制該病[11-12]。

據調查，亞單位疫苗的安全性和效率通常需要通過佐劑來改善，在此鐵蛋白納米顆粒疫苗提供了另一種輔佐免疫原的思路[13]。此外還有研究報道，鐵蛋白的納米顆粒疫苗能夠有效地改善流感病毒疫苗免疫的效力和廣度[14]。據研究，高度有序重復的結構形式可以誘導更強的免疫應答，因此鐵蛋白納米籠可以通過在其外表面上有序地展示多種抗原來增強抗原的免疫原性[15]。

本研究將ORFV F1L蛋白與Fe蛋白融合，但通常2個蛋白質結構域之間可能存在結構的擾動，從而引起融合蛋白質的不穩定性，產生錯誤折疊成為異構產物，導致生物學活性受損以及表達率下降[16-17]。在此，Linker蛋白可能成為2個蛋白質之間有效的連接工具，可在結構域之間供應適當的間距以降低其干擾，恢復甚至改善折疊，允許體內釋放游離蛋白質藥物結構域以改善生物活性[18]。本研究選擇以Gly和Ser為組合的柔性接頭，以及親水性的氨基酸來提供結構柔性，以此來改善融合蛋白F1L-Fe的表達率和生物學活性。

F1L基因作為ORFV新型疫苗研究中的一個重要免疫原性基因[19]，本試驗選擇F1L基因作為預防羊口瘡的候選疫苗，并將鐵蛋白作為其免疫佐劑，通過SGG的Linker蛋白聯接。在本試驗中我們首次將羊口瘡F1L蛋白與鐵蛋白利用融合PCR進行融合，然后將其與pET-32a載體連接起來，成功構建可表達F1L-Fe融合蛋白的原核表達載體pET-F1L-Fe，SDS-PAGE分析結果表明，pET-F1L-Fe原核表達載體在大腸桿菌感受態細胞中成功且大量表達了F1L-Fe重組融合蛋白， 其中通過SDS-PAGE分析試驗可以看出F1L-Fe蛋白的表達量很高，說明鐵蛋白可能存在促進F1L蛋白表達的作用，但有待后續研究。最后我們獲得了F1L-Fe融合蛋白的多克隆抗體，Western-blot鑒定結果表明其具有良好的反應原性。本研究首次選擇了F1L蛋白與鐵蛋白通過Linker蛋白進行融合，初步構建了F1L-Fe蛋白納米顆粒以及獲得了其多克隆抗體，為后續羊口瘡亞單位疫苗的研發奠定了物質基礎。

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（責任編輯：陳海霞）