番茄抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病Mi基因探索與WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與抗病調(diào)控的研究進(jìn)展

摘要：根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病作為世界范圍內(nèi)危害植物最為廣泛的土傳病害之一，給農(nóng)作物生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。番茄作為新疆紅色支柱產(chǎn)業(yè)，其設(shè)施生產(chǎn)飽受線(xiàn)蟲(chóng)病的侵害。目前，生產(chǎn)上對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的防治多以化學(xué)防治為主，但藥劑的頻繁使用給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了巨大壓力。近年來(lái)，生物防治的綠色可持續(xù)優(yōu)勢(shì)逐漸擴(kuò)大，但生防資源少、田間防治效果差異大等缺陷也掣肘了其應(yīng)用。優(yōu)質(zhì)基因資源的挖掘與利用，仍是從根本上解決番茄抗病的最佳策略。本文首先介紹番茄Mi基因家族中已發(fā)掘的10個(gè)成員在分子層面的研究進(jìn)展，闡釋番茄抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的現(xiàn)有分子機(jī)理；Mi基因可使用的抗源單一、抗病范圍有限及土壤溫度等條件的制衡，阻礙了優(yōu)質(zhì)番茄種質(zhì)的抗性改良，更多非R基因的挖掘變得尤為重要。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在作物生物脅迫調(diào)控方面扮演重要角色，本文綜述近年來(lái)WRKY在作物防衛(wèi)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病方面的研究應(yīng)用，以期為后續(xù)番茄從不同層面并避免完全依賴(lài)Mi基因的抗病育種提供新思路。

關(guān)鍵詞：番茄；Mi基因；根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)；WRKY轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.412.1+9" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0016-07

收稿日期：2024-04-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號(hào)：32302652）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號(hào)：2022D01B95）。

作者簡(jiǎn)介：陳銀霞（1996—），女，河南淮陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉逊肿舆z傳育種。E-mail：cyx61222@163.com。

通信作者：杜 崇，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事番茄分子遺傳育種研究。E-mail：godv2018@163.com。

根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（root-knot nematodes，RKN）是一種專(zhuān)性植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)。1855年，自Berkeley首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，世界各地有關(guān)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病報(bào)道逐年增多，其中危害嚴(yán)重、分布較廣的有南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）、爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（M. javanica）、花生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（M. arenaria）、北方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（M. hapla）。根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)體型小而透明，幼蟲(chóng)通常為細(xì)長(zhǎng)的蠕蟲(chóng)形態(tài)，成蟲(chóng)雌雄異體，雌蟲(chóng)呈梨形狀，雄蟲(chóng)呈線(xiàn)狀。雌蟲(chóng)卵囊表面粗糙不平，通常呈棕褐色［1］。

RKN的寄主范圍廣泛，涉及114科3 000多種植物；研究發(fā)現(xiàn)，蔬菜中的茄科、葫蘆科、十字花科等植物受害較為嚴(yán)重［2］。RKN每年造成世界農(nóng)作物平均減產(chǎn)24.5%，經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)1 000億美元，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了不小的沖擊［3］。番茄（Solanum lycopersicum L.）是對(duì)RKN最為敏感的作物之一，在我國(guó)新疆，特別是在伊犁哈薩克自治州、吐魯番市、烏魯木齊市、巴音郭楞蒙古自治州、阿克蘇地區(qū)的設(shè)施番茄生產(chǎn)上，RKN均普遍發(fā)生。番茄受侵染后，植株呈現(xiàn)矮小、發(fā)育不良的現(xiàn)象，果實(shí)品質(zhì)大幅下降，一般造成減產(chǎn)30%～50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%，甚至絕收［4-5］。

目前，化學(xué)防治仍是應(yīng)對(duì)RKN的主要手段，但隨著毒性增大、生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重污染、線(xiàn)蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生等問(wèn)題［6］凸顯，一些高毒性的殺線(xiàn)蟲(chóng)劑已被嚴(yán)禁使用。生物防治具有綠色環(huán)保且可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為作物病害防治的首選方法，但也存在可用生防資源少、田間防治效果參差不齊等缺點(diǎn)［7］。因此，通過(guò)尋找優(yōu)質(zhì)抗病（R）基因和非典型R基因進(jìn)行抗性改良，仍是從根本上解決作物抵御線(xiàn)蟲(chóng)入侵的最佳策略。

1 番茄抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病Mi基因家族成員

Mi基因家族是番茄中抗RKN的主效基因家族，該家族中，一個(gè)名為Meloidogyne incognita-1（Mi-1）的顯性基因，定位于6號(hào)染色體上，于1941年被首先發(fā)現(xiàn)。Mi-1基因可誘導(dǎo)番茄對(duì)3個(gè)有絲分裂孤雌生殖群體（M. incognita、M. arenaria、M. javanica）產(chǎn)生較強(qiáng)的抗性，同時(shí)具有溫敏性，即土壤溫度高于28 ℃時(shí)，Mi-1失去抗性。目前，Mi-1基因是唯一用于商業(yè)育種的R資源，其提供的抗性最早在番茄發(fā)芽2周后便被誘導(dǎo)，并在番茄植株的葉、根中大量表達(dá)［8］。研究表明，野生番茄具有能夠在線(xiàn)蟲(chóng)抗性位點(diǎn)處發(fā)生變異的遺傳系統(tǒng)，從而產(chǎn)生新的抗性指標(biāo)。在后續(xù)探索過(guò)程中，以Mi-1為首的其他Mi家族成員也相繼被發(fā)掘與鑒定。在鑒定出的10個(gè)抗源中，有7個(gè)（Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-9、Mi-HT）基因表現(xiàn)出熱穩(wěn)定的抗性，即土壤溫度達(dá)到32 ℃，植株抗性仍存在［9］，其余3個(gè)熱穩(wěn)定R基因均未被定位（表1）。

2 番茄抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的分子機(jī)制

植物與病原體之間的相互作用被概括為zigzag模型，這種先天免疫系統(tǒng)，可以識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），從而觸發(fā)第1道免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）［11］，但部分病原體可積極抑制PTI，將病原效應(yīng)因子釋放到宿主植物中，而植物體內(nèi)特異性抗病蛋白（R）通過(guò)響應(yīng)此類(lèi)效應(yīng)子，觸發(fā)第2道防線(xiàn)——效應(yīng)子觸發(fā)免疫（effector-triggered immunity，ETI）［12］。在ETI中，抗體-病原相互作用有直接和間接2種模式（圖1）。直接方式取決于基因?qū)颍╣ene-for-gene）假說(shuō)，在該模式下，番茄中相應(yīng)受體蛋白與線(xiàn)蟲(chóng)效應(yīng)子直接相互作用［13］。

根據(jù)Bakker等的理論，番茄抗性的遺傳與RKN致病能力均由成對(duì)的匹配基因所控制［14］。Mi基因可特異性地識(shí)別來(lái)自RKN中Avr基因編碼的效應(yīng)因子，這類(lèi)防御的表征之一是局部程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD），最終導(dǎo)致超敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）［15］。線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)入番茄根部后，其Avr基因產(chǎn)生的效應(yīng)物以不親和互作的方式觸發(fā)Mi基因的表達(dá)，因此沒(méi)有形成侵蝕位點(diǎn)，從而阻礙巨型細(xì)胞的進(jìn)一步形成［16］。

另一種間接方式稱(chēng)為保護(hù)假說(shuō)，該理論機(jī)制是由病原體效應(yīng)物觸發(fā)植物的毒力因子/蛋白，最終誘發(fā)R基因表達(dá)［17-18］。在這種情況下，線(xiàn)蟲(chóng)Avr基因與番茄輔助蛋白相互作用，導(dǎo)致該蛋白發(fā)生修飾，從而被NB-LRR（nucleotide binding-leucine rich repeat）型蛋白所識(shí)別。在RKN侵染時(shí)，例如AvrB和AvrRpm1可磷酸化RIN4，AvrRpt2則通過(guò)自身的半胱氨酸蛋白酶活性降解RIN4，而作為樞紐的RIN4是多種毒力效應(yīng)因子的靶向，其磷酸化和降解可活化R蛋白活化RPM1和RPS2來(lái)介導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)［19-20］。這種間接相互作用的最終結(jié)果同樣是通過(guò)抑制進(jìn)食部位的形成來(lái)防止線(xiàn)蟲(chóng)侵入［21］。

3 Mi基因家族成員研究進(jìn)展與利用

Mi-1基因首先在野生秘魯番茄中被發(fā)現(xiàn)，隨后被引入到栽培番茄中，該基因?qū)?種典型的RKN均具有抗性［22］。到目前為止， Mi-1是番茄商業(yè)育

種中唯一的抗性來(lái)源，但存在溫敏性。Mi-1及其同源物分為2個(gè)簇，分別包括3、4個(gè)拷貝，間隔大概300 kb。1998年，在Mi位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)基因：Mi-1.1、Mi-1.2、Mi-1.3，但只有Mi-1.2基因具有對(duì)RKN的抗性。Mi-1.2基因全長(zhǎng)3 774 bp，編碼1 257個(gè)氨基酸，它的3個(gè)外顯子中有2個(gè)可以進(jìn)行翻譯，屬于典型的NBS-LRR基因，在NBS結(jié)構(gòu)域之前包含1個(gè)CC結(jié)構(gòu)域［23］。Mi-1位于6號(hào)染色體短臂上。在諸多茄科植物中，6號(hào)染色體上該區(qū)域是R基因的重要分布區(qū)［24］。

Mi-2基因是顯性基因，在30～32 ℃土壤溫度下秘魯番茄PI 270435和PI 126433品種中不僅表現(xiàn)出對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的熱穩(wěn)定抗性同時(shí)對(duì)北方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)也具有抗性，目前為止，該基因仍未被定位［25］。Mi-4基因的研究相對(duì)較少，該基因同樣未被定位，秘魯番茄LA1708在32 ℃土壤溫度條件下，對(duì)花生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)表現(xiàn)出抗性，這可能是由Mi-4行使功能所引起的［8］。Mi-5作為熱穩(wěn)定R位于12號(hào)染色體端粒區(qū)，與Mi-3連鎖在一起表達(dá)。Mi-5、Mi-3均存在于1MH-clone PI126443中（表1），研究表明，在大多數(shù)涉及弱連鎖的條件下，這2個(gè)耐熱基因可能作為單個(gè)位點(diǎn)起作用［26］。Mi-6作為熱穩(wěn)定基因?qū)KN表現(xiàn)出較好的抗性，在3MH-clone PI270435中被發(fā)現(xiàn)，與Mi-7之間存在弱連鎖關(guān)系，而Mi-7介導(dǎo)植株的抗性卻不表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性［27］。Mi-8是2R2-clone PI270435中的顯性基因，和Mi-2存在弱連鎖關(guān)系，但與Mi-7一樣，為非熱穩(wěn)定抗源，可介導(dǎo)番茄植株在常溫下表現(xiàn)出對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性［28］。

Mi-3、Mi-9是現(xiàn)在研究相對(duì)較多的抗病R基因。Mi-3基因的遺傳特性為單基因顯性遺傳，可在32 ℃土壤溫度條件下賦予對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性。隨后發(fā)現(xiàn)，盡管其純合子和雜合子均顯示出較強(qiáng)的抗性，但純合子的抗性要比雜合子更強(qiáng)。Yaghoobi等將Mi-3定位到番茄12號(hào)染色體短臂的端粒區(qū)域，并在Mi-3側(cè)翼標(biāo)記TG180、NR18之間發(fā)現(xiàn)1個(gè)600 kb的重疊群，其遺傳距離約為7.2 cM；在Mi-3已定位到的12號(hào)染色體的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在其他茄科植物上還分配了重要的R基因，包括馬鈴薯中針對(duì)胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的R基因、辣椒中針對(duì)RKN的R基因Me3、Me4，以及抗黃瓜花葉病毒（CMV）的R基因。然而，很少有常用標(biāo)記在12號(hào)染色體上定位R基因，并且尚無(wú)更多信息可確認(rèn)Mi-3是否與這些R基因等位［29］。與Mi-3一樣，Mi-9為單基因顯性遺傳，在常溫條件下對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)和茄生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)3種常見(jiàn)的RKN都有較強(qiáng)的抗性。先前的研究表明，Mi-9不能有效抵抗可突破Mi-1基因抗性的重要RKN生理種。就RKN特異性而言，Mi-9與Mi-1的表達(dá)具有相同的作用與模式，但是表型鑒定的唯一區(qū)別是在土壤高溫下的穩(wěn)定抗性；Mi-9基因在土壤溫度32 ℃以上仍具有抗性。RNA沉默試驗(yàn)證實(shí)Mi-9是Mi-1的同源基因，Mi-9位于2個(gè)標(biāo)記（C32.1、C8B）之間的6號(hào)染色體的短臂上［30］。最新研究結(jié)果表示，通過(guò)納米孔（nanopore）長(zhǎng)讀長(zhǎng)、Illumina短讀長(zhǎng)、Hi-C 測(cè)序，對(duì)野生番茄LA2157進(jìn)行染色體水平的基因組組裝，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的Mi-9分子標(biāo)記REX-1、C8B，將7個(gè)候選基因定位在12.96 Mb的范圍內(nèi)，而 NBS-LRR 基因主要分布在706 kb的區(qū)域內(nèi)，最終通過(guò)RNAi挖掘到了Mi-9基因［31］。

Mi-HT被認(rèn)為是在番茄源ZN17中發(fā)現(xiàn)的1個(gè)新R基因，被定位在6號(hào)染色體短臂上，與Mi-1、Mi-9連鎖，具有較好的熱穩(wěn)定抗性［32］。

4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子

WRKY轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）是一類(lèi)DNA結(jié)合蛋白，作為T(mén)Fs中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，N端有一段由60個(gè)氨基酸組成的高度保守結(jié)構(gòu)域［33］。該結(jié)構(gòu)域包含1～2個(gè)WRKYGQK七肽序列，C端包含C2H2（CX4-5CX22-23HXH）或C2HC（CX7CX23HXC）型鋅指結(jié)構(gòu)［34-35］。WRKY通常分為三大類(lèi)：第Ⅰ類(lèi)含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)［36］；第Ⅱ類(lèi)只含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，根據(jù)氨基酸序列特點(diǎn)，Ⅱ類(lèi)WRKY蛋白又可分為a～e這5個(gè)亞類(lèi)；第Ⅲ類(lèi)也只含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型［37］。大多數(shù)WRKY屬于第Ⅱ類(lèi)，第Ⅲ類(lèi)較多存在于高等植物中，為了反映WRKY的系統(tǒng)演化，也有將WRKY TF分為Ⅰ、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd+Ⅱe和Ⅲ［38］。此外，WRKY TF中富含絲/蘇氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸等，還含有TIR-NBS-LRR、激酶結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈等其他組分［39］。

WRKY的N末端含有保守的七肽序列WRKYGQK，導(dǎo)致WRKY可特異性結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)W-box元件參與復(fù)雜的生物學(xué)途徑［40］?；诖颂卣鳎琖RKY可被MAPK級(jí)聯(lián)激活信號(hào)磷酸化修飾來(lái)調(diào)節(jié)PTI、ETI進(jìn)程；同時(shí)，許多WRKY蛋白是SA-/JA-介導(dǎo)植物防御途徑中的共同組成部分，包括激活水楊酸（salicylic acid，SA）介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance，ISR）等［41］；除此之外，WRKY還可以通過(guò)影響效應(yīng)蛋白形成復(fù)合體或直接調(diào)控R基因的表達(dá)，來(lái)改變植物的抗病能力［42］。

5 WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物抗RKN的研究進(jìn)展

近年來(lái)，諸多WKRY蛋白在不同植物抗RKN過(guò)程中被相繼篩選與鑒定。前期利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測(cè)序聯(lián)合分析接種南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的豌豆材料發(fā)現(xiàn)，防衛(wèi)網(wǎng)絡(luò)的核心集中在NBS-LRR、WRKY基因之間的相互作用，來(lái)激活R基因表達(dá)，產(chǎn)生蛋白酶抑制劑并維持細(xì)胞骨架，從而阻止巨細(xì)胞的形成［43］。香蕉基因組共鑒定出153個(gè)WRKY基因，通過(guò)測(cè)序和接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WRKY52、-69、-92對(duì)RKN入侵表現(xiàn)出特異性表達(dá)［44-45］。通過(guò)對(duì)272份野生稻進(jìn)行RKN抗性鑒定，基于Affymetrix芯片分型SNP進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究，在鑒定出的40份抗性種質(zhì)中，共篩出7個(gè)含有WRKY基因的QTL位點(diǎn)，接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些基因被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)［46］。利用RT-PCR對(duì)黃瓜材料9930侵染RKN的根系中分離到24個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)qPCR發(fā)現(xiàn)8個(gè)WRKY基因上調(diào)表達(dá)，2個(gè)WRKY下調(diào)表達(dá)［47］。野生番茄材料F5利用RNA-Seq技術(shù)分析，南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)侵染過(guò)程中15個(gè)WRKY家族差異表達(dá)明顯［48］。通過(guò)對(duì)秘魯番茄材料LA3858設(shè)置土壤溫度（25、34 ℃）形成抗感態(tài)進(jìn)行RNA-Seq，共76個(gè)WRKY基因被篩選，鑒定出6個(gè)目標(biāo)WRKY在接種南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的植株根部高差異表達(dá)，并且積極響應(yīng)并參與SA、JA、ROS信號(hào)的調(diào)節(jié)來(lái)介導(dǎo)抗病進(jìn)程［49-50］。這些成果為后續(xù)功能研究及分子標(biāo)記輔助育種提供了重要依據(jù)。

在具體功能鑒定方面，Warmerdam等在擬南芥中，通過(guò)T-DNA插入獲得WRKY19基因的突變體wrky19-1，在該突變體中，DSC1基因表達(dá)量嚴(yán)格下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，dsc1-1突變體增強(qiáng)了對(duì)于 M. incognita 的敏感性，因此，WRKY19很可能正向調(diào)控DSC1的表達(dá)來(lái)改變植株的抗性［51］。CaWRKY30、CaWRKY6基因受非毒性M. incognita的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)；CaWRKY6基因的沉默降低了辣椒對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性，轉(zhuǎn)基因超表達(dá)CaWRKY30基因的番茄植株對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)入侵的敏感性增大，植株的抗性降低［52］。Zhang等在茄子中，通過(guò)對(duì)抗性品種TG1轉(zhuǎn)錄圖譜進(jìn)行篩選，共9個(gè)WRKY基因差異表達(dá)，qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)WKRY75很可能參與TG1植株防衛(wèi)RKN的入侵［53］。辣椒CM-334對(duì)于RKN表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性水平，這緣于WRKY1、WRKY-a的高量表達(dá)，易感品種超表達(dá)上述基因，伴隨根系過(guò)氧化氫酶（CAT）活性增強(qiáng)，綠原酸含量升高，從而導(dǎo)致植株對(duì)RKN的敏感性減弱［54］。在番茄中，WRKY72型轉(zhuǎn)錄因子SlWRKY72、SlWRKY73、SlWRKY74均積極調(diào)控著 Mi-1 介導(dǎo)的對(duì)RKN和馬鈴薯蚜蟲(chóng)的ETI過(guò)程［55］。Chinnnapanndi等研究發(fā)現(xiàn)，SlWRKY45的超表達(dá)下調(diào)了JA、SA信號(hào)途徑中標(biāo)記基因（PR-1、Pin2）的表達(dá)［56］。Huang等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SlWRKY45可特異性結(jié)合JA合成基因SlAOC的啟動(dòng)子，抑制其表達(dá)，從而增強(qiáng)植株對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的易感性［57］。Chinnnapanndi等發(fā)現(xiàn)，SlWRKY3、SlWRKY35在RKN感染后5 d內(nèi)的番茄根部攝食處被顯著誘導(dǎo)，其中SlWRKY3在SA信號(hào)中積極響應(yīng)，超表達(dá)和敲除SlWRKY3表明其正向調(diào)控番茄對(duì)M. javanica的抗性［58］。Nie等根據(jù) RNA-Seq 對(duì) Mi-3 番茄材料篩選出了目標(biāo)WRKY，根據(jù)組織特異性表達(dá)、根部表達(dá)模式鑒定及病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）初步功能驗(yàn)證，挖掘到SlWRKY80在番茄防衛(wèi)RKN的入侵過(guò)程中可作為正調(diào)控因子參與抗病調(diào)控［59］。

6 研究問(wèn)題與展望

Mi基因家族作為番茄防衛(wèi)RKN的主效R基因，其使用存在一定的局限性。首先，Mi基因不是對(duì)所有類(lèi)型的RKN都起抗性作用。例如，象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（M. enterolobii）、M. hapla，尤其是 M. enterolobii，它的致病性強(qiáng)，經(jīng)常突破番茄Mi-1基因和辣椒Me3、Me4基因介導(dǎo)的抗性［60］。除此之外，美國(guó)弗羅里達(dá)州首次發(fā)現(xiàn)的瑪雅古根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（sM. mayaguensis）同樣可以讓Mi番茄植株產(chǎn)生致病態(tài)［61］。大多數(shù)線(xiàn)蟲(chóng)物種中，孤雌生殖為其主要繁殖方式，盡管孤雌繁殖會(huì)影響RKN物種數(shù)量，但物種內(nèi)部和物種之間針對(duì)的宿主范圍以及RKN本身的毒力存在顯著的波動(dòng)性，這就導(dǎo)致在不同外界因素干擾下，盡管抗性番茄（Mi）也會(huì)被RKN所感染［62］。溫度不但影響Mi的抗性，同時(shí)也影響RKN的侵染活力，前期研究表明，土壤溫度在不超過(guò) 27 ℃ 時(shí)，RKN保持高效的入侵能力，而Mi-1基因在28 ℃土壤溫度條件下，抗性大幅減弱，導(dǎo)致植株的敏感性驟增呈感病態(tài)。Mi基因家族中，雖然大部分成員表現(xiàn)為熱穩(wěn)定抗性，但是現(xiàn)在唯一能利用商業(yè)育種的Mi-1卻呈現(xiàn)非熱穩(wěn)定性，掣肘了其高效的利用［63-64］。

番茄抗RKN的入侵仍然依賴(lài)于Mi基因，可利用抗源單一，其有效性也面臨著線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)、毒力及外界因素等多重影響的挑戰(zhàn)，因此，挖掘其他有價(jià)值基因?qū)τ诜逊N質(zhì)抵御RKN的抗性改良顯得尤為重要。WRKY蛋白作為植株中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在抗病領(lǐng)域的研究也愈發(fā)深入，其對(duì)于抗病信號(hào)及進(jìn)程的調(diào)控功能在種質(zhì)抗性改良方面具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。因此，育種人可以嘗試不依賴(lài)于R基因提高作物抗病能力的傳統(tǒng)策略，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面及其他非典型R基因的發(fā)掘入手，完成番茄對(duì)RKN的抗性改良。本文可為今后番茄抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病育種突破瓶頸提供新思路。

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