蛋白質芯片技術在腫瘤蛋白質組學研究中的應用及進展

摘 要 蛋白質芯片技術是一種快速、高效、高通量、微型化和自動化的蛋白質分析技術。目前，它已成為腫瘤蛋白質組學研究的重要工具之一。它能洞察腫瘤細胞、組織和生物體蛋白質含量的細微變化，且能精確分析某一特定蛋白質的理化性質。就近年來蛋白質芯片的發展及其在腫瘤蛋白質組學研究中的應用做了簡要的敘述，提出了該技術存在的問題，并對其發展前景進行了展望。

關鍵詞 蛋白質芯片 蛋白質組學 腫瘤

中圖分類號 Q-49文獻標識碼 E

人類基因組計劃（human genomic project， HGP）的完成，極大推動了功能基因組研究的發展和后基因組時代的到來。但基因數量有限性和結構相對穩定性與生命現象復雜性和多變性之間的巨大反差，使人們的目光逐漸從基因組學轉向蛋白質組學，作為生命活動執行者，基因組編碼的所有蛋白質隨之成為研究熱點。其中腫瘤蛋白質組學是從細胞整體水平上認識在腫瘤的發生、發展過程中蛋白表達譜的變化。為了達到這個目的，就需要高通量、快速簡便的技術平臺支持。而傳統的蛋白質組學研究方法——二維凝膠電泳和酵母雙雜交技術等往往操作煩瑣，結果具有不確定性，且所需費用高。因此，人們發展了一種蛋白質組學研究新技術——蛋白質芯片。

1 蛋白質芯片技術

蛋白質芯片又稱蛋白質陣列或蛋白質微陣列，它是將大量的蛋白質、蛋白質檢測試劑或檢測探針作為配基以預先設計的方式固定在玻片、硅片或纖維膜等固定載體上組成密集的陣列，能夠高通量地測定蛋白質的生物活性、蛋白質與大分子和小分子的相互作用，或者用于高通量定性和定量檢測蛋白質。

1.1 蛋白質芯片的分類及特點

根據芯片表面修飾的不同可分為：化學表面芯片和生物表面芯片。化學表面芯片又可分為疏水、親水、弱陽離子交換、強陰離子交換、金屬離子鰲合等。這些芯片可以根據蛋白質的化學特性如疏水或親水性及所帶電荷而選擇性地捕獲特異蛋白質。而生物表面芯片可分為抗原－抗體、受體－配體、DNA－蛋白質、酶等芯片，其原理是抗原、抗體結合或供體、受體結合從而分離某一特異性蛋白質。

蛋白質芯片特點：① 可直接用粗生物樣品進行分析，如血清、尿、體液等；② 靈敏度高，只需0.5~5 μL樣品，或2 000個細胞即可檢測；③ 特異性高，并可定量；④ 高通量，操作自動化；⑤ 可同時快速發現多個生物標記物；⑥ 可發現低豐度、小分子量蛋白質，并能測定疏水蛋白質，特別是膜蛋白質。

1.2 蛋白質芯片技術的作用原理

蛋白質芯片技術主要包括4個基本要點：芯片陣列的構建、樣品的制備、芯片生化反應、信號檢測及分析。首先按設計好的陣列方式將蛋白質分子點印在介質上，將用熒光標記的樣品蛋白質與芯片反應，通過激光共聚焦顯微鏡和CCD照相機對熒光信號進行掃描分析，得出檢測結果。蛋白質芯片的核心技術是芯片的制備和反應信號的檢測分析。由于蛋白質分子的活性依賴于不同的折疊方式，因此對芯片的表面修飾非常重要，要保證蛋白質穩定地固定在片基上而又不失生物活性。

1.3 SELDI－TOF-MS技術

為使操作進一步快捷方便，在同一系統中集分離、純化、鑒定、檢測和數據分析為一體。如今，蛋白質芯片常與芯片閱讀器和分析軟件結合使用，從而形成了“表面加強激光解析電離化飛行時間質譜”蛋白質芯片技術。其中芯片閱讀器是激光解析電離飛行時間質譜儀，它通過激光脈沖輻射將樣品轉化為運動的氣態離子并按質荷（M/Z）大小進行分離，根據不同質荷比在電場中飛行時間長短不一，從而繪制出一張質譜圖。分析軟件，用來處理實驗所得的數據，通過對已知數據進行差異性分析，從而發現有鑒別意義的峰值變化。

2 腫瘤蛋白組學的概念和研究內容

1994年澳大利亞的威克斯首先提出了蛋白質組的概念：即基因組所表達的全部蛋白質。它有別于傳統的單個基因或單個蛋白的研究模式，從機體或細胞的整體水平上來闡明生物體全部蛋白質的表達、修飾、結構功能和相互作用。因此產生了一個新的研究領域——蛋白質組學。其中腫瘤蛋白質組學主要是比較分析腫瘤組織細胞與正常的組織細胞、腫瘤在不同發展時期的細胞內整體蛋白質的差異，獲得腫瘤異質性的信息。腫瘤蛋白質組學研究的主要內容有：建立各種腫瘤的蛋白質組數據庫；尋找腫瘤相關蛋白質，分析腫瘤相關蛋白質的結構和功能，鑒定出腫瘤標志物，進而為腫瘤診斷、治療、預防以及發病機制的研究提供新的依據。

3 蛋白質芯片技術在腫瘤蛋白質組學研究中的應用

3.1 篩選腫瘤標志物

蛋白質芯片在此領域中進展最快，這是由于其對高通量的樣品處理是快速、敏感、批量的，這些特征使得蛋白質芯片技術適合從惡變前的病灶來研究腫瘤的進展，而這時微量的、多個的蛋白質的變化可能已具有病理診斷意義。

3.1.1 消化系統腫瘤

3.1.1.1 食管腺癌

通過造模結合蛋白質芯片技術研究食管腺癌蛋白表達，發現糖調控蛋白94（Grp94）高度表達，而食管腺癌中則沒有這種現象，在人體組織標本中也有相同結果。

3.1.1.2 胃癌

應用SELDI-TOF-MS蛋白質芯片技術篩查不同時期胃癌血清蛋白圖譜，其特異性與敏感性都相當突出。

3.1.1.3 肝癌

應用SELDI-TOF-MS技術研究肝癌患者、肝硬化及正常人血清的蛋白質譜，并建立一個肝癌蛋白質譜圖以檢測隨機標本，其敏感性達到88.2%，特異性達94.6%；相對于傳統的診斷方法，SELDI-TOF-MS技術具有更高的特異性及各級敏感性。對82例肝硬化患者(其中44例伴有原發性肝癌)血清蛋白進行分析表明，6組蛋白質高峰可用以鑒別有無肝癌，其準確率達92.5%，其中8 900 Da最具鑒別力。利用金屬親和蛋白質芯片技術研究相關性疾病的蛋白質圖譜，以判斷病變階段，區分正常肝組織、慢性丙肝病毒性肝炎與原發性肝癌，其特異性及敏感性為74%~95%。聯合檢測AFP、異常凝血酶原和GP73檢測原發性肝癌可使敏感性及特異性分別提高到75%、92%。

3.1.1.4 胰腺癌

用蛋白質芯片技術和SELDI-TOF-MS對來自胰腺癌患者和非胰腺癌患者的胰液進行分析，發現15例胰腺癌患者中10例樣品中有分子量為16 570 Da的蛋白表達，而7例非胰腺癌患者中只有1例出現此蛋白的表達，陽性率僅為17%。經免疫測定發現這種蛋白為HIP/PAP-1，經量化表明HIP/PAP-1在胰腺癌患者胰液和血清中的表達量遠遠高于對照組，因此胰液中的HIP/PAP-1可作為胰腺癌診斷的標志物。

3.1.1.5 結腸癌

通過對良性腸病、惡性和結腸癌前病變患者的血清與健康對照組樣品比較，發現了一種相對分子質量為13.8 K的特殊相關蛋白質，在結腸癌及其癌前病變中表達，而在非癌或克羅恩病及潰瘍性結腸炎等良性腸病中不表達。因此，通過檢測血中是否存在這些蛋白，可確定出腸病的良惡性，并對結腸癌作出早期篩查。

3.1.1.6 大腸癌

偌博茲等采用SELDI-TOF-MS選擇疏水性芯片（H4）分析了大腸癌患者與正常對照血清蛋白圖譜之間的差異，其中相對分子質量為8 942 Da的蛋白在大腸癌患者中高表達，而9 300 Da的蛋白呈低表達，正常對照組上述2個蛋白的表達情況與患者組相反。

3.1.2 生殖系統腫瘤

3.1.2.1 前列腺癌

應用SELDI-TOF-MS蛋白質芯片技術對167例前列腺癌、77例良性前列腺增生患者以及82例正常對照的血清標本進行了檢測，并嚴格按照直腸指診陰性和小于4 ng/mL的條件挑選對照，并以年齡將對照與陽性病例相配對。檢測時聯合應用了多種芯片，包括H4、WC、IMAC等，其中IMAC-Cu-3蛋白質芯片的檢測效果最為理想。結果發現9個前列腺癌相對特異標記物，用分類決策樹軟件進行分析，使之與良性前列腺增生病例、正常人群鑒別，敏感性為83%、特異性為97%、準確性為96%，試驗組和總體人群的陽性預測值分別為96%和91%。

3.1.2.2 卵巢癌

用4種蛋白芯片（H4、WCX2、SAX2、IMAC-3-Cu）檢測了58例卵巢癌患者、50例正常對照者血清，其中在IMAC-3-Cu芯片上檢測到一相對分子質量為11 700的蛋白，經離子捕獲同步質譜測序，證實為珠蛋白A鏈。阿德卡尼等認為卵巢內發生的病理變化能夠在血漿中的生物標記物中得以反映，他們聯合運用SELDI質譜分析和基于人工智能的信息法則系統，在血漿中發現了很少量的能區別正常人群和卵巢癌病人的關鍵蛋白質。用C16疏水性蛋白芯片分析了66例健康婦女和50例卵巢癌患者，圖譜采用534、989、2 111、2 251、2 465質荷比（M/Z）蛋白峰綜合分析，靈敏度100%、特異性95%、預測準確率94%，同樣的標本用CA125預測準確率只有35%。

3.1.2.3 乳腺癌

相關研究應用SELDI技術IMAC-Ni芯片篩查169份血清樣品，其中包括103名乳腺癌（0期4例，Ⅰ期38例，Ⅱ期37例，Ⅲ期24例），41名健康婦女及25名良性乳腺疾病患者。0～Ⅰ期乳腺癌和非癌對照組中篩選出3個生物標記物來檢測所有血清，結果乳腺癌檢出敏感性為93%，特異性為91%。研究發現，乳腺癌患者的血清樣品中有一個28.3 ku的蛋白質，而且它僅存在乳腺癌患者的樣品中。由此，研究者設計出了NMP66試劑盒，用其對可疑患者進行檢測，結果發現這一蛋白在乳腺癌的早期診斷（無腋下淋巴結轉移）及晚期轉移性乳腺癌的診斷上特異性達到了100%，在排除非惡性腫瘤個體上的特異性達96%，遠遠高于臨床應用的其他檢測手段。

3.1.3 泌尿系統腫瘤

3.1.3.1 膀胱癌

阿達姆等應用SELDI蛋白芯片系統進行膀胱腫瘤的診斷研究，總共取185份尿樣，95份取自可轉移性膀胱癌患者，52份取自非癌性尿路疾病患者，35份取自正常個體，蛋白芯片檢測后獲得圖譜中有16個較為有意義的蛋白波峰，可用于疾病分類，預測準確率達77%，靈敏度79%，特異性81%。

3.1.3.2 腎癌

由于腎臟位置較隱蔽，早期常無明顯臨床癥狀，且缺乏臨床可實用的腎癌診斷、監測用標記物，極易延誤診斷，因此尋找腎癌相對特異性腫瘤標志物更有必要。科學家用SELDI技術結合蛋白質芯片研究8例腎細胞癌（RCC）組織（包括正常組織、外周癌組織和中心癌組織），4例子宮頸上皮細胞瘤組織，3例子宮頸癌組織。用H4芯片發現RCC組織過度表達1 1951.2 Da及12 019.9 Da蛋白質。用SAX2芯片發現RCC組織過度表達12 027 Da蛋白質，但低表達10 205 Da、10 953 Da及12 738 Da蛋白質，從而為RCC病人的檢測提供方法。

3.1.4 呼吸系統腫瘤

3.1.4.1 喉癌

肖雪媛等采用蛋白質芯片技術對33例喉癌(12例聲門癌，18例聲門上癌，3例聲門下癌)病人血清和31例正常人血清進行了檢測。結果顯示與正常人血清蛋白質譜相比，喉癌病人血清中有16個差異蛋白，其中8個標志分子在病人血清中高表達，8個標志分子在病人血清中低表達。Biomarker Pattern軟件在設定條件下自動選取上述標志分子中的2個蛋白質（8 153 Da和2 035 Da）用于建立喉癌診斷的分類樹模型。此分類樹具有2層3個葉結點，可將96.9%的喉癌病人和96.7%的正常人正確劃分出來。

3.1.4.2 肺癌

北京師范大學蛋白質組學中心何大澄教授用SELDI技術從30名患者和相應數量的健康人血樣品中成功篩選出15個肺癌標志分子，為肺癌診斷技術的發展提供了關鍵性的基礎，將大大改變我國目前所有對肺癌臨床檢測手段都要待病灶形成后才能檢測出來的狀況，能夠在人體甚至細胞未出現任何病變，僅從蛋白質的變化中即可檢測出癌變前兆。

3.2 基礎研究

使用蛋白質芯片技術對正常B細胞分泌的蛋白質和EB病毒轉化的B細胞分泌的蛋白質進行質譜分析，發現轉化后的B細胞系有一過度表達的M/Z為4 972.1的蛋白質峰值，通過逆相層析技術和胰蛋白酶消化，肽段相對應的片段被確認為胸腺素beta-4。

用SELDI蛋白質芯片和二維電泳對頭頸部腫瘤培養細胞系的轉移相關蛋白進行了研究，通過對頭頸部鱗狀細胞癌培養細胞系UM-SCC10A和UMSCC10B（前者來自原發部位，而后者來自同一病人轉移性淋巴結）的分析發現，在轉移性淋巴結培養細胞系中的兩種膜相關蛋白（層黏連蛋白和）和糖酵解蛋白A烯醇化酶是上調的，而calumenin前體則是下調的，從而提示蛋白質組學是了解腫瘤發展和演進中不正常分子的重要手段。

在研究腫瘤壞死因子亞家族成員在慢性淋巴細胞白血病的發病機理時發現，用BCMA-Fc阻斷BAFF及其受體的結合可以加速白血病淋巴細胞的凋亡，并且白血病淋巴細胞的BAFFmRNA增高，膜上有表達BAFF。據此推測有可溶性的BAFF，但是Western印跡、免疫沉淀等技術卻沒發現。他們用兔子的BAFF抗體包裹的蛋白質芯片與5份慢性淋巴細胞白血病患者的血清混合，然后用SELDI蛋白質芯片檢測，發現一個28 161 Da的單峰，證明是BAFF，而用同樣的方法檢測5份健康供者的血清卻沒發現相應的峰值。正是高通量、高敏感的蛋白質芯片的應用使BAFF在慢性淋巴白血病的發病中的作用被認識。這啟發科學家探索新的治療方法，例如給患病者注射BAFF抗體或可溶性的BAFF受體。

4 存在的問題和發展前景

蛋白質芯片將為生物化學和分子生物學提供強有力的工具，相對于DNA芯片研究的進展速度，蛋白質芯片的研究進展顯得相對滯后，主要有以下問題亟待解決：（1） 尋找材料表面的修飾方法；（2） 簡化樣品制備和標記操作；（3） 增加信號檢測的靈敏度，如低拷貝蛋白質的檢測和難溶蛋白質的檢測；（4） 高度集成化樣品的制備及檢測儀器的研制和開發。這些問題不僅為蛋白質芯片技術增加了難度，同時也是蛋白質芯片能否從實驗室推向臨床應用的關鍵所在。隨著技術的不斷深入和更加完善，如表面化學修飾技術的進步，可以做到在載體上固定多種活性蛋白質;納米標記的引入，可提高芯片檢測的靈敏度;近期也有望開發出簡便可靠的檢測系統，這些技術難題將逐漸被解決。

蛋白質芯片提供了一種高通量的蛋白質分析技術，能夠進行受體配體檢測，多種感染因素篩查和腫瘤的診斷，了解蛋白質同包括藥物在內的小分子相互鍵合的作用，從基因水平上尋找靶目標和靶藥物。因此，蛋白質芯片在整個蛋白質組分析以及在多蛋白質表達異常的遺傳病診斷、治療和新的藥物發現方面具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

［１］ 荊濤，荊友等．蛋白質組學研究進展及在泌尿系腫瘤研究中的應用[J]．腫瘤研究與臨床，2006，（18）：348-351.

［2］ 鐘春英，彭蓉，彭建新，洪華珠．蛋白質芯片技術[J]．生物技術通報，2004，（2）：34-37.