不同基因組野生稻隨機微衛星擴增多態ＤＮＡ（ＲＭＡＰＤ）遺傳分析

摘 要：采用32對RMAPD引物對水稻9種類型基因組的44份材料遺傳多樣性進行研究，PCR產物經凝膠電泳后進行帶型統計并用NT3YS軟件進行聚類分析，結果顯示44份材料可分為AA基因組和其他基因組2個人組，其他基因組可分為BCD、EFG和HJ等3個小組；BCD小組聚類結果表明CC基因組與BBCC基因組關系親緣最近，與CCDD基因組次之，而與AA基因組最遠，結果同時表明，AA基因組野生稻和非AA基因組野生稻含豐富的栽培稻所沒有的基因，RMAPD標記在群體遺傳結構和親緣關系分析等水稻遺傳育種領域具有廣闊的應用前景。

關鍵詞：野生稻；基因組；RMAPD；遺傳多樣性

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：1007－7847(2007)03－0248－05

野生稻長期處于野生狀態，經受各種災害和不良環境的自然選擇，擁有豐富的基因庫，保存著栽培稻不具有或消失了的特異基因，其遺傳多樣性遠遠高于栽培稻，挖掘野生稻優秀基因的研究日益受到重視，近年來從野生稻中篩選出有效基因轉入栽培稻中，使栽培稻具有野生稻的高產、抗褐飛虱、抗白葉枯病等性狀的研究有了很大的發展，從野生稻中搜尋和克隆優良基因并轉入栽培稻中在育種中應用逐漸成為育種家的研究新方向。

在水稻中應用的分子標記很多，從較早應用的RFLP、RAPD和AFLP等標記到現在常用的SSR和ISSR等，這些分子標記在研究水稻的多態性、構建分子圖譜、基因的定位與克隆、種子純度鑒定、品種的鑒定和育種等方面有廣泛的應用，各種分子標記都有自己的特點，但RFLP、RAPD和AFLP重復性差，結果不夠穩定；SSR多態性不夠；ISSR多態性較SSR豐富，但穩定性也不夠，且主要擴增的是非編碼區。

RMAPD標記采用隨機引物和微衛星的上游或下游引物一起作為一對擴增引物，該標記不僅具有RAPD標記的多態性同時還具有SSR標記的穩定性，在群體遺傳結構和親緣關系分析以及標記輔助選擇等領域具有廣泛的應用前景，該標記是一種新的分子標記。目前主要應用在動物中，在植物中應用很少，本研究應用此標記對不同基因組野生稻進行分析，為野生稻的分類、不同基因組野生稻的親緣關系提供分子依據，并期待能在育種中得到應用。

1 材料和方法

1．1 材料

AA基因組材料20個(包括栽培稻4個、陸稻1個、爪哇稻2個、普通野生稻12個，尼瓦拉野生稻1個)，BBCC基因組2個，CC基因組材料6個，CCDD基因組材料8個，EE基因組材料3個，HHJJ基因組材料2個，BB、FF和GG基因組材料各1個，共計44個材料(表1)。

1．2 方法

1．2．1 引物

RAPD引物參考文獻[2]，SSR引物選自www.gramene.org(表2)，從中隨機抽取RAPD引物和SSR引物進行配對試驗，篩選出擴增效果好、多態性強的的引物32對。

1．2．2 DNA提取采用略做改進的CTAB法提取基因組DNA。

1．2．3 RMAPD反應體系

2.5μL 10*PCR Buffer，0.5μL 2OD SSR引物，1.0μL 2OD RAPD引物，0.3μL140mmol/LdNTPs，1U Taq，40ng Template，補充超純水至總體積25μL。

1．2．4 RMAPD反應程序

95℃預變性4min→36個循環(94℃變性30s→X℃退火30s→72℃延伸45S→94℃變性30s→36℃退火60s→72℃延伸90s)→72℃最后延伸10min(注：X℃為不同微衛星引物的退火溫度)。

1．2．5 RMAPD產物電泳檢測及數據分析

產物在3％瓊脂糖電泳檢測，然后在Gel-Logic 100 Image System上凝膠成像，將成像的條帶按有無分別賦值1和0，轉換為數值矩陣，然后用NTSYS2，10e軟件進行遺傳距離計算并構建系統樹。

2 實驗結果

2．1 不同基因組野生稻RMAPD遺傳多樣性分析

32對RMAPD引物在44份不同基因組材料中共擴增帶533條，平均每對引物擴增16.66條，其中多態性帶522條，比例為97.85％，不同基因組材料多態性以AA基因組相對較高(表3)，20個材料平均多態性帶為13.89條：CC基因組和CCDD基因組分別為11.50條和11.75條，EE基因組材料較少，平均每個材料為10.33條，這與鄭景生13)等運用SsR分子標記對野生稻不同基因組多樣性分析的結果一致，AA基因組材料是遺傳多樣性比較豐富的基因組類群。

把材料分為AA基因組和非AA基因組野生稻進行遺傳多樣性比較(表4)，AA基因組材料比非AA基因組野生稻的特異帶和平均特異帶明顯偏少，說明非AA基因組野生稻具豐富的AA基因組材料沒有的基因片段，具有較大的遺傳多樣性差異。

2．2 不同基因組野生稻聚類分析

應用NTSYS軟件對基于32對RMAPD標記數據的不同基因組野生稻進行了聚類分析，并繪制了樹狀圖(圖1)，44份不同基因組材料分為2個大組。

第1大組為AA基因組的20個材料，包括4個栽培稻、12個普通野生稻、2個爪哇稻、1個陸稻和1個尼瓦拉野生稻，4個栽培稻聚為1小類，且秈稻和粳稻材料單獨成小支，12個普通野生稻中位于北緯20°～26°之間的海南普通野生稻、合浦普通野生稻、柳江普通野生稻、桂林普通野生稻、扶綏普通野生稻、田陽普通野生稻、公館普通野生稻、增城普通野生稻和江永普通野生稻等9個材料聚為1類，而處于北緯26°～28°之間的茶陵普通野生稻、安仁普通野生稻和東鄉普通野生稻等3個材料又為1類。這樣的聚類結果說明AA基因組的野生稻材料分布可能與緯度有一定的關系，2個爪哇稻材料成1小支，與陸稻優先聚類，再與栽培稻聚類。尼瓦拉野生稻在最外層，這1大組中，栽培稻與普通野生稻優先聚類，然后再與其他材料聚類，這說明了栽培稻與普通野生稻有較近的親緣關系。

第2大組為其他基因組，包括BCD、EFG和HJ等3類，BCD類則包括BB、BBCC、CC和CCDD等4個基因組的野生稻，其中BBCC基因組的2個材料與CC基因組的5個材料優先聚類，然后再與BB基因組材料聚類，這說明BBCC基因組與CC基因組親緣較近，與BB基因組稍遠。與CCDD基因組則更遠，EFG類群中包括EE基因組的澳洲野生稻與FF基因組的短花野生稻和GG基因組的疣粒野生稻，GG基因組與PP基因組優先聚類，再與EE基因組聚類，HJ類群為HHJJ基因組的馬來野生稻，單獨為一小類群。

3 討論

亞洲栽培稻起源于普通野生稻，普通野生稻的秈粳分化一直是研究熱點，Morishima通過同工酶和形態性狀分析，認為大多數普通野生稻介于典型秈稻和粳稻之間，中國普通野生稻主要偏粳和秈粳中間型，南亞偏秈：才宏偉的同工酶研究表明，中國普通野生稻偏秈和偏粳都有；本研究中普通野生稻材料與典型秈粳特異性帶進行對比，各普通野生稻都存在秈粳特異帶，有的偏秈比例較高，有的偏粳比例較高；朱世華等檢測到普通野生稻(AA基因組)的rDNA間隔區長度變異類型的地理分布與緯度有關，高緯度來源的普通野生稻的rDNA間隔區長度較短。低緯度來源的普通野生稻的rDNA間隔區長度較長，黃光文運用SSR和ISSR標記對部分普通野生稻的研究認為，低緯度的普通野生稻秈型成分比高緯度的要多，本文的研究結果認為AA基因組的普通野生稻起源可能和緯度有關，可以依據緯度把普通野生稻分為低緯區野生稻和高緯區野生稻，同時結果還認為普通野生稻比同AA基因的栽培稻有更多的基因，非AA基因野生稻又含有AA基因組野生稻沒有的基因，這表明野生稻是一個很大的“基因庫”，栽培稻在馴化過程中很多基因喪失，栽培稻的資源利用率已經很高了，要想進一步提高產量。不得不考慮栽培稻外的資源，而野生稻有著如此多的栽培稻所沒有的基因，這說明野生稻在育種方面大有潛力可挖。

盧寶榮等把野生稻分為AA+BCD、FF和其它為一組的兩大組：張乃群等，認為野生稻分為AA、BCD和其余的為一組等3組；鄭景生等則認為不同基因型野生稻可分為AA+BCD、FF+GG和HHJJ等3大組，由此可見對于野生稻進行大組歸類時，不同基因組的歸組問題仍然有不同的看法，本研究直接把不同基因組材料分為了兩個大組：AA基因組和其他基因組，其他基因組再包括幾個小組，Nayar在總結稻屬染色體組間關系時指出，A染色體組和C染色體組是公認的基本染色體組，B、C和D染色體組彼此間有一定的關系，E、F染色體組和其他染色體組的關系不清楚；Wang等采用核DNA限制性片段長度多態性(RFLP)方法研究了稻屬21個種的親緣關系，在單獨探討二倍體親緣關系時，結果是E染色體組明顯位于C染色體組和B染色體組共同的分支之外，顯示E染色體組和另兩個染色體組間較遠的關系；包穎等對葉綠體matK基因、nrDNA ITS片段、低拷貝核基因Adhl和Adh2進行序列分析，得出C染色體組和B染色體組的親緣關系要比它們和E染色體組的更近，本文研究結果表明A染色體組是基本染色體組之一，C染色體組位于其他染色體組的核心位置，分組時C染色體組位于基部，其他染色體組則由此展開，由此也說明了A染色體組和C染色體組是基本染色體組；實驗結果還說明了EE染色體組與GG和FF染色體組親緣較近，與BC染色體組親緣則相對較遠。

作者簡介：陳覺梁(1982－)，男，湖南常德人，碩士研究生，主要從事植物發育與分子生物學研究；陳良碧(1956－)，男，湖南沅陵人，湖南師范大學教授，博士生導師，通訊作者，主要從事植物發育與分子生物學研究。