ＫＬＦ４過表達對ＲＡＷ２６４．７巨噬細胞和Ｃ_２Ｃ_１２肌原細胞增殖的影響

摘 要：為探討Kruppel樣因子4(Kruppel-like faetor4，KLF4)過表達對RaW264.7巨噬細胞和C₂C₁₂小鼠肌原細胞生長的影響，采用脂質體轉染KLF4的真核表達質粒于RaW264.7巨噬細胞和C₂C₁₂，細胞中，G418篩選陽性克隆，western blotting鑒定高表達克隆；觀察各轉染細胞生長情況，CCk-8法檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞周期分布，凋亡百分率，發現與空質粒轉染細胞相比，KLP4過表達對Raw264.7巨噬細胞的生長曲線、細胞周期分布、凋亡百分率沒有明顯的影響，而C₂C₁₂細胞生長速度減慢，細胞凋亡百分率明顯高于空載體組，上述結果表明KLF4基因對Raw264.7巨噬細胞增殖沒有明顯影響，而對C₂C₁₂細胞增殖起負調控作用。

關鍵詞：KLF4；基因轉染；R8w264.7細胞；C₂C₁₂細胞；細胞增殖

中圖分類號：R361 文獻標識碼：A 文章編號：1007－7847(2007)03－0263－05

Kruppel樣因子4(Kruppel-1ike factor4，KLF4)是Sp/Kdlppel樣鋅指轉錄因子家族的成員之一，這個家族目前已發現20多個成員，如Spl-4、KLPl-14等，Sp/Kruppel樣因子是機體內一類具有重要功能的蛋白質，它們參與調控細胞增殖、分化、胚胎發育等重要生命過程，并與腫瘤等多種疾病有關，研究表明，KLF4在胚胎發育晚期及腸管分化終末期的上皮細胞中其表達均增高，提示KLF4具有抑制某些細胞增殖的功能，為了深入探討KLF4的功能，本研究室建立了穩定高表達該基因的Raw264.7小鼠巨噬細胞株和C₂C₁₂小鼠肌原細胞株，在此建株過程中，我們發現轉染KLF4對上述兩種細胞增殖的影響明顯不同。

1 材料和方法

1．1 材料

Raw264.7巨噬細胞株購自上海細胞中心；C2Cn小鼠肌原細胞由本校細胞中心提供：DMEM及RPMI-1640培養基購自Gibeo公司；G418購自Promega；無支原體小牛血清，杭州四季青生物工程公司產：丙烯酰胺、N，N′2亞甲基雙丙烯酰胺購自Fluka公司；二硫蘇糖醇(DTT)、過硫酸胺、TEMED、硝酸纖維素膜購自Promega公司；Lipo-feetamine^TM 2000、真核表達載體質粒pcDNA3.1購自Invitrogen life technologies公司：peDNA3.1-KLF4重組質粒本室構建；兔抗KLF4多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG及DAB顯色試劑盒購自博士德生物工程有限公司：CCK-8溶液由日本同仁化學株式會社提供。

1．2 方法

1．2．1 KLF4過表達細胞株的建立

利用脂質體介導的轉染技術(根據Invitrogenlife technologies公司提供的轉染操作說明書進行操作)將空載體pcDNA3.1和重組質粒pcDNA3.1-KLF4導人Raw264.7和C₂C₁₂細胞中，根據本室以往所建立的方法篩選過表達細胞株。

1．2．2 免疫印跡分析

按《分子克隆實驗指南》所載方法進行，用1×SDS加樣緩沖液裂解細胞，收集細胞蛋白質，采用Bradford法進行蛋白定量。制備好的蛋白樣品置，80℃冰箱保存備用，每泳道上樣30μg蛋白，經10％SDS-PAGE(70V，120V分別電泳2h和4h左右)電泳后，電轉膜至硝酸纖維膜，室溫封閉后加入兔抗KLF4多克隆抗體，室溫孵育2h，加入HRP標記的羊抗兔IgG孵育1h，DAB顯色，拍攝照片，記錄試驗結果。

1．2．3 細胞形態觀察

取各轉染細胞于倒置顯微鏡下，觀察其生長速度和形態改變，并逐日記錄。

1．2．4 CCK-8法檢測細胞的增殖

取生長狀態良好的對數生長期各組細胞接種于96孔板(每孔1×10⁴個細胞)，每組接種5個復孔，在含10％新生小牛血清的條件下分別培養24h，48h及72h后加入CCK-8溶液10μL繼續培養4h，將96孔板放人酶標儀，在450nm波長處測定各孔OD值。

1．2．5 流式細胞術檢測

本實驗由北京鼎國生物技術公司協助完成，分別接種等量的對數生長期的各組細胞于100mL培養瓶中，每組5瓶，培養24h后，參考該公司流式細胞檢測說明收集細胞，送北京鼎國生物技術有限公司進行流式細胞術分析。

1．2．6 統計學處理

數據以均數土標準差(x±s)表示，兩組間比較用t檢驗分析，以P＜0.05判斷為有統計學意義。

2 結果

2．1 Western blotting篩選高表達KLF4的細胞克隆

采用脂質體分別轉染KLF4的真核表達質粒pcDNA3.1-KLF4和空載體pcDNA3.1至Raw264.7和C₂C₁₂，細胞中，經G418篩選后，利用KLF4多克隆抗體進行Western印跡分析，鑒定高表達克隆，結果顯示，篩選到高表達克隆，在兩種細胞株中KLF4蛋白表達量較轉空載體組明顯增加(圖1)。

2．2 細胞生長情況

2．2．1 KLF4過表達對細胞形態的影響

KLF4過表達的Raw264.7細胞形態無明顯變化，C2C12空載體組貼壁細胞主要呈長梭形，極向或交叉排列，部分KLF4基因過表達的細胞形態發生改變，如細胞向多角形轉變，細胞形狀多樣等(見圖2)。

2．2．2 CCK-8法結果

Raw264.7的空載體組和KLF4組之間細胞增殖能力無明顯變化(p＞0.05)(表1)，C₂C₁₂的KLF4組與其空載體組相比較，細胞增殖能力降低(p＜0.05)(表2)。

2．2．3 流式細胞術分析KLF4對細胞周期及細胞凋亡的影響

利用流式細胞術檢測了Raw264.7-pcDNA3.1、Raw264.7-KLF4，C₂C₁₂-pcDNA3.1及C₂C₁₂-KLF4 4組細胞的周期分布及凋亡百分率，結果顯示轉染空載體和KLF4過表達對Raw264.7細胞的細胞周期分布及細胞凋亡無明顯影響(P＞0.05)；與轉空載體的C₂C₁₂相比較，KLF4過表達的C₂C₁₂細胞中處于S期的細胞減少，而G1期的細胞相應增多(圖3)，凋亡細胞也增多(P＜0.05)(圖4)。

3 討論

KLF4是Kriippel樣鋅指轉錄因子家族的一個重要成員，小鼠KLF4蛋白全長包含483個氨基酸殘基，分子質量為53kD，和人的KLF4蛋白具有90％的相似性，KLF4蛋白的羧基端具有3個連續的C2H，鋅指結構，這3個鋅指的結構均符合保守序列：CX_2-4CX₃FX₅LX₂HX₃H；兩個鋅指結構之間由一個7個氨基酸殘基的H/C連接序列連接，該連接序列為了GEKP(Y/F)X，KLF4能夠對角蛋白4(keratin)、腸堿性磷酸酶(intestinalalkaline phosphatase，IAP)、鳥氨酸脫羧酶(omithine decarboxylase，ODC)、β鏈蛋白(β-catenin)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)等多個啟動子的轉錄活性進行調控，從而在機體的生長和發育過程中起著重要的調節作用，對KLF4的研究最初是從胃腸道開始研究的，它的表達在生長抑制的狀態下明顯增高：此后的研究發現，KLF4除了在腸的不同組織中表達外，還在表皮有高水平的表達并在皮膚表皮細胞分化晚期起重要作用；KLF4缺失能導致皮膚屏障功能障礙從而使新生小鼠在出生后短時間內死亡，此外，最近的研究還表明，KLF4在精子細胞及其支持細胞的終末分化過程中出現高表達，這說明KLF4可能在哺乳動物睪丸發育過程中起到重要作用，但是，KLF4對Raw264.7細胞和C₂C₁₂細胞增殖的影響，目前尚未見報道。

為了闡明KLF4對Raw264.7細胞和C₂C₁₂細胞增殖的影響，本研究分別建立了KLF4過表達的Raw264.7和C₂C₁₂細胞株，并采用多種方法共同檢測了KLF4過表達對該兩種細胞增殖的影響，結果顯示，KLF4過表達對Raw264.7細胞的形態和增殖無明顯影響：而KLF4過表達的C₂C₁₂細胞株中，多角形的細胞增多，細胞周期中S期的細胞相對減少，細胞增殖速度明顯減慢，由此可見，KLF4對這兩種細胞增殖的影響具有顯著的細胞差異性。

KLF4在細胞內的調節機制非常復雜，Jun-ichi okano等發現，KLF4可以結合對角蛋白4啟動子上CACCC盒而激活之，角蛋白4在細胞分化和細胞骨架構成中具有重要作用；小分子cyclin D1啟動子也包含多個CACCC元件，KLF4在體外能夠與其相結合并能夠在體內抑制該啟動子的轉錄活性，實驗證明，KLF4也能夠與p300和CBP相互作用，從而實現其生長抑制功能，KLF4還可能是通過乙酰化來逆轉其與其他蛋白的相互作用，KLF4在C₂C₁₂細胞內是否也通過上述途徑調節C₂C₁₂細胞，導致C₂C₁₂細胞生長減慢，具體機制還有待進一步研究，總之，KLF4的轉錄調控機制很復雜且對選擇性的修飾和蛋白間相互作用很敏感，在一個完整的細胞周期中，KLF4起著多重的關鍵性作用。

作者簡介：劉梅冬(1970－)，女，湖南耒陽人，中南大學實驗師，主要從事心血管內源性保護的機制研究；劉瑛(1977－)，女，河南焦作人，中南大學講師，博士，通訊作者，主要從事心血管內源性保護的機制研究。