ｎ－６脂肪酸去飽和酶ｆａｔ－１基因?qū)ι窠?jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制作用

摘 要：將C.elegans n-6脂肪酸去飽和酶基因fat-1的cDNA插入到腺病毒的穿梭載體pAd-CMV中，并與骨架載體同源重組，構(gòu)建腺病毒重組載體(Ad.GFP.fat1)，通過包裝細(xì)胞系(293)產(chǎn)生重組腺病毒，感染原代培養(yǎng)的大鼠皮層細(xì)胞，在顯微鏡下觀察、細(xì)胞增殖試劑盒(MTT)和凋亡染色試劑盒分析fat-1基因?qū)Υ笫笃蛹?xì)胞凋亡的影響，核糖核酸酶保護性分析，檢測fat-1基因在大鼠皮層細(xì)胞內(nèi)的表達，酶聯(lián)免疫分析花生四烯酸類(Eicosanoids)前列腺素(ProstaRlandin E₂)的含量，結(jié)果表明，通過基因重組技術(shù)，得到預(yù)期的重組病毒；fat-1基因在原代培養(yǎng)的大鼠皮層細(xì)胞中能有效異源表達，2d后，可檢測到fat-1mRNA的條帶，與對照Ad.GFP細(xì)胞相比，fat-1基因明顯抑制了大鼠皮層細(xì)胞因誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡(35％)，受保護細(xì)胞的前列腺素含量也明顯地減少(30％)。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)元細(xì)胞；凋亡；多不飽和脂肪酸；基因治療

中圖分類號：Q735；R741.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1007－7847(2007)03－0227－06

哺乳動物的大腦富含長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFAS)，尤其是花生四烯酸(AA，20:4n-6)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6n-3)，許多研究已經(jīng)表明DHA在大腦發(fā)育和突觸形成時是不可缺少的，是神經(jīng)元發(fā)揮正常功能的必需物質(zhì)，人類低血壓、癲癇發(fā)作、精神運動性阻滯、耳聾和視網(wǎng)膜病，都是與n-3 PUFA缺乏有關(guān)的幾種特征性疾病。

在發(fā)育過程中，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是常常發(fā)生的，它對神經(jīng)系統(tǒng)的形成是至關(guān)重要的，然而，這種生理性細(xì)胞死亡的形式也與許多神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，如早老性癡呆和帕金森病，由于n-3PUFAs對正常大腦發(fā)育和功能的重要性，一些研究表明，補充DHA可促進大鼠視網(wǎng)膜感官器的存活，以及體外培養(yǎng)的神經(jīng)2A和PC-12細(xì)胞的存活，而且，注射n-3脂肪酸可以防止短暫性缺血動物模型的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，還可防止癲癇發(fā)作引發(fā)的興奮毒素性細(xì)胞死亡。

補充外源性脂肪酸是提高哺乳動物神經(jīng)元n-3 PUFAs含量的唯一可能的方法，因為哺乳動物細(xì)胞既不能合成n-3 PUFAs的前體-ALA，也不能使n-6 PUFAs轉(zhuǎn)變成n-3 PFAs，最近，我們發(fā)現(xiàn)利用C.elegans n-6脂肪酸去飽和酶(一種使n-6PUFAs轉(zhuǎn)變?yōu)閚-3 PUFAs的酶)的基因轉(zhuǎn)移，可以增加細(xì)胞膜必需脂肪酸的組成，在本研究中，我們觀察了n-6去飽和酶能否在皮質(zhì)神經(jīng)元中表達，以及這種酶的表達能否抑制誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡作用。

1 材料和方法

1．1 重組體腺病毒的構(gòu)建

攜帶fat-1基因的重組體腺病毒的構(gòu)建依照Kang等的方法，含有n-6脂肪酸脫氫酶cDNA(fat-1基因)的質(zhì)粒經(jīng)EcoR V/Kvn I切割后，插入到pAdTrack-CMV載體中，并與腺病毒骨架載體pAdEasy 1在E.coli內(nèi)進行同源重組，得到2個克隆：Ad.GFP，只攜帶綠熒光蛋白基因(GFP，作為報告基因)，用作對照病毒，和Ad.GFP.fatl，攜帶2個基因fat-1和GFP，通過酶切和DNA測序檢測重組載體的正確性，重組的腺病毒載體DNA用Pac I消化，回收目的大片段后與SuperFect(QIAGEN)混合，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝、繁殖、分離純化病毒后即可用于感染原代培養(yǎng)的大鼠皮層細(xì)胞。

1．2 組織培養(yǎng)和腺病毒轉(zhuǎn)染

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)制備大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，從懷孕17d的產(chǎn)前大鼠中分離出胚胎的皮質(zhì)神經(jīng)元，放置人賴氨酸包被的12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為每孔2×10⁶個，細(xì)胞在神經(jīng)培養(yǎng)基(NBM，Life Technologies，Grand Island，NY，USA)中生長，并含有25mmol/L谷氨酸(美國Sigma公司)、0.5mmol/L谷氨酰胺、1％抗細(xì)菌、抗霉菌溶液和2％B27(Life Technologies)，培養(yǎng)條件保持在37℃，5％CO₂，相對濕度為98％，培養(yǎng)基每4d換一次，經(jīng)過8～10d的培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率在70％時，用Ad.GFP(對照組)或Ad.GFP.fatl感染細(xì)胞(直接把病毒顆粒加入到培養(yǎng)基中)，24h后換正常的培養(yǎng)液，48h后，進行紫外熒光顯微拍照、基因表達、細(xì)胞增殖、凋亡和花生四烯酸類(前列腺素PGE₂)的定量分析。

1．3 RNA分析

使用RPAⅢ試劑盒(Ambion，Austin，TX，USA)通過核糖核酸酶保護性分析測定fat-1轉(zhuǎn)錄的mRNA，首先用總RNA分離試劑(TRIzol:Gibo公司)按說明書從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA，含有fat-1基因的質(zhì)粒pCE8線性化后作為轉(zhuǎn)錄模板，在體外使用[α-³³p]UTP、T7多聚酶(Riboprobe System，T7 kit，Promega，Madison，WI，USA)轉(zhuǎn)錄反義RNA，與從神經(jīng)元中提取出來的總RNA進行雜交，用核糖核酸酶消化以去除非雜交RNA和探針，被保護的雜交雙鏈RNA：RNA在5％變性凝膠中電泳分離，干膠后放射自顯影，β-actin的探針用作內(nèi)參照。

1．4 凋亡的誘導(dǎo)以及細(xì)胞生長的檢測

通過撤除生長因子誘導(dǎo)凋亡，轉(zhuǎn)染48h后，培養(yǎng)基換成神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基，含有25μmol/L的谷氨酸(Sigma)，0.5μmol/L谷氨酰胺，生長因子撤除24h后，應(yīng)用Vybrant^MT凋亡分析試劑(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)檢測細(xì)胞的凋亡，簡言之，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞，接著把細(xì)胞放于含有Hoechst 33342(1mL/L)和propidimiodide(PI)(1mL/L)的冰冷PBS中20～30min，然后顯微拍照和凋亡百分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計，即在同一視野下，查出感染細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，后者與前者之比即是凋亡百分?jǐn)?shù)。

細(xì)胞生長或生存力的檢測采用MTF細(xì)胞增殖試劑盒(Roche Diagnostic Corporation)，在每個孔中加入MTY試劑100μL，保溫4h后，在每孔中加入1mL溶解液，然后37℃過夜，用分光光度儀在600nm波長測定吸光度。

1．5 花生四烯酸類物質(zhì)(前列腺素E2)的測定

前列腺素E，的測定采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Assay Designs，Ann Arbor，MI，USA)(與前列腺素E₃的交叉反應(yīng)幾率為16％)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)(1％牛血清)洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，然后放置于含鈣離子載體(5μmol/L)的PBS緩沖液中保溫，10min后條件[生緩沖液陜復(fù)，用于二十烷類的測定。

1．6 數(shù)據(jù)分析

細(xì)胞生存力(MTT)和二十烷類(前列腺素E₂)水平的數(shù)據(jù)比較采用Student's t-test，所有分析都是每組6孔細(xì)胞，并且每一部分實驗重復(fù)3次，顯著性界限值為p＜0.05。

2 結(jié)果

2．1 攜帶fat-1基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建質(zhì)粒fat-1cDNA經(jīng)EcoR V/Kpn I切割后，插入到pAdTrack-CMV載體中，并與腺病毒骨架載體pAdEasy 1進行同源重組，得到重組的腺病毒Ad.GFP.fat1，攜帶2個基因fat-1和GFP(圖1所示為其圖譜)，另外還得到克隆Ad.GFP(只攜帶綠熒光蛋白基因GFP，作為報告基因)，用作對照病毒，重組腺病毒載體DNA用Pac I和BamH I消化，序列測定進行鑒定，結(jié)果都表明該重組載體的結(jié)構(gòu)是正確的(圖2)。

2．2 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中fat-1基因的表達

轉(zhuǎn)染Ad.GFP.fatl后表達fat-1基因的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，在同時表達GFP后很容易在熒光顯微鏡下辨別出來(它表現(xiàn)為亮的綠色熒光)，轉(zhuǎn)染48h后，30％～40％的神經(jīng)元轉(zhuǎn)染成功，并表達GFP基因(圖4，a，A)，fat-1基因的表達情況使用核酸酶保護性分析(ribonuclease protection assay)mRNA顯示，fat-1 mRNA在Ad，GFP.fat.1感染的細(xì)胞中含量豐富，但在Ad.GFP(對照)感染的細(xì)胞中卻檢測不到fat-1mRNA(圖3)，因為大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞在正常情況下是缺乏該基因的，但對于內(nèi)參照基因β-actin，兩組細(xì)胞都有同樣高水平的表達，這個結(jié)果說明，在正常情況下缺乏fat-1基因的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中，腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的fat-1基因可以出現(xiàn)非常高的表達。

2．3 fat-1對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制

我們對基因轉(zhuǎn)移后的細(xì)胞增殖和凋亡進行分析，以確定fat-1表達對神經(jīng)元細(xì)胞生長的影響，凋亡的誘導(dǎo)是通過24h的生長因子的撤除，凋亡誘導(dǎo)24h后，用Hoeehst 33342(1mL/L)和PI對皮質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞進行染色，結(jié)果表明Ad.GFP.fat-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯少于Ad.GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞圖4E(b，B)和F(相對于對照，下降了32％)，這說明fat-1基因的表達可以有效地保護大鼠的皮質(zhì)神經(jīng)元免于凋亡。

2．4 MTT分析

為了確定fat-1基因的表達對細(xì)胞增殖的影響，在Ad.GFP.fat1感染2d后，用細(xì)胞增殖試劑盒測量(MTT，Roche Diagnostics Corporation)分析，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡后的MTT分析顯示，表達fat-1基因的細(xì)胞溶液，與對照(只表達GFP基因)相比，其600nm下的吸收值高出25％，即Ad.GFP.fat1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生存力明顯高于Ad.GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，統(tǒng)計分析顯示具有顯著差異(P＜0.05)(圖5)，Ad.GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞對凋亡的反應(yīng)沒有差別，這些結(jié)果表明，fat-1的表達能夠抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞生存力。

2．5 對花生四烯酸類物質(zhì)(前列腺素E₂)的影響

如前所述，在與衰老相關(guān)性的神經(jīng)退行性疾病和急性興奮毒素?fù)p傷如缺血中，兩個系列的二十烷類與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)，花生四烯酸(AA，20:4n-6)和二十碳五烯酸(EPA，20:5n-3)分別是n-6和n-3系列二十烷類的前體，為了檢測基因轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的AA和EPA含量的變化是否可以導(dǎo)致細(xì)胞中二十烷類產(chǎn)物的不同，我們先用鈣離子載體calcium ionophore A23187刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后采用酶聯(lián)免疫試劑盒測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中前列腺素E₂的含量，它是衍生自AA的主要的二十烷類，結(jié)果如圖6所示，表達fat-1的細(xì)胞中前列腺素E₂的含量比對照組細(xì)胞下降了25％±3.3％，這說明fat-1基因降低了花生四烯酸類物質(zhì)的含量。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)編碼n-6去飽和酶的C.elegensfat-1基因的表達可在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞有效表達，并降低細(xì)胞內(nèi)二十烷類物質(zhì)(前列腺素E₂)的含量，從而保護大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元免于凋亡，并增加其細(xì)胞生存力，這些結(jié)果表明基因轉(zhuǎn)移在對抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護作用，酷似補充n-3脂肪酸的保護效應(yīng)，并且闡明了降低細(xì)胞內(nèi)二十烷類物質(zhì)(前列腺素E₂)的含量在保護神經(jīng)元方面的重要性。

對動物模型和人類新生兒的研究顯示，n-3脂肪酸缺乏可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜和大腦的異常發(fā)育，尤其是早產(chǎn)兒，n-3 PUFA缺乏的動物模型會出現(xiàn)記憶力、空間性和皮層依賴性聽力的缺陷，以及視力的喪失，還有研究顯示人類許多神經(jīng)性疾病狀態(tài)與n-3 PUFA缺乏有關(guān)，值得重視的是，最近的調(diào)查顯示我們現(xiàn)在飲食中的n-6PUFAs過量，而n-3 PUFAs相對缺乏，造成組織中n-6 PUFAs過量、n-3 PUFAs缺乏，這可能就是包括神經(jīng)退化、癌癥在內(nèi)的現(xiàn)代病增加的原因之一，因此，找到一個合適的方法降低n-6PUFAs、增加n-3 PUFAs，對防治神經(jīng)性退化一類的病癥是非常必要的，目前，唯一的方法就是向飲食中添加n-3 PUFAs，因為他們不能被人體所合成，而必須從飲食中獲得，然而，飲食的方法卻有若干局限性，而能迅速轉(zhuǎn)化過量的內(nèi)源性n-6 PUFAs成為對應(yīng)的n-3 PUFAs的方法是最理想的。

基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用使得有可能調(diào)節(jié)人類細(xì)胞的脂肪酸組成而不需提供外源的n-3 PUFAs，我們目前的結(jié)果說明，腺病毒介導(dǎo)的n-6脂肪酸去飽和酶在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的表達，可以作為這一理想的方法，在不補充外源性n-3PUFAs的情況下，對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護作用，可對抗生長因子撤除誘導(dǎo)的凋亡，進而起到抗神經(jīng)性退化的效果。

有研究已經(jīng)表明，在衰老相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病中和急性興奮毒紊性損傷如缺血時，前列腺素與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)，在轉(zhuǎn)染Ad.GFP.fat-1 48h后，我們測定了前列腺素E₂的生成量，它是AA(n-6 PUFA)的主要衍生物，結(jié)果顯示，與僅轉(zhuǎn)染GFP的對照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染fat-1的細(xì)胞中前列腺素E，的生成量顯著下降，因此，fat-1表達的神經(jīng)保護陸作用部分是由于前列腺素的產(chǎn)生和分泌下降，這又減少了對整個細(xì)胞群的損傷作用。

前列腺素E₂生成量的下降可能是由于磷脂酶A2(PLA₂)的底物減少(n-6向n-3 PUFA轉(zhuǎn)變的結(jié)果)，或是由于n-3 PUFA對PLA₂活性的直接抑制，或是二者兼而有之，有研究已經(jīng)表明DHA(大腦n-3 PUFA存儲的主要形式)能夠影響AA的釋放，是前列腺素生物合成的有效的抑制劑，Shikano等也指出在體外有DHA存在時，PLA₂對AA的水解明顯減少，而且，H.Y.Kim等報道補充DHA能減少caspas-3的激活和表達，而它可以粘附和激活PLA₂誘導(dǎo)凋亡。

總之，病毒介導(dǎo)的n-3脂肪酸去飽和酶的基因fat-1轉(zhuǎn)移能夠抑制由生長因子撤除所誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡；不需要補充外源性n-3 PUFAs即可快速有效地降低二十烷類物質(zhì)，并因此對神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，與膳食干預(yù)相比，這種方法在平衡n-6:n-3脂肪酸方面更有效，因為它能自發(fā)地降低內(nèi)源性n-6PUFAs的水平，提高組織中n-3PUFA。的濃度，因此，本研究首次開辟了一種新穎有效的修飾哺乳動物神經(jīng)元細(xì)胞脂肪酸的方法，并且為基因治療作為中風(fēng)病人的一種輔助治療或化學(xué)干預(yù)手段提供了潛在的應(yīng)用基礎(chǔ)。

作者簡介：張金玉(1968－)，女，山東日照人，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院副教授，碩士，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。葛銀林(1957－)，男，河南新蔡人，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師，博士，通訊作者，主要從事基因治療研究。