等離子體－紫外線復(fù)合誘變選育高產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌

摘 要：以產(chǎn)還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-20為出發(fā)菌株，采用氬氣等離子體射線、紫外照射及兩者的復(fù)合誘變處理，獲得一株高產(chǎn)GSH的釀酒酵母優(yōu)良菌株(S.cerevisiae)DU－20，結(jié)果表明該菌株具有穩(wěn)定的遺傳性能，GSH含量與產(chǎn)量分別比出發(fā)菌株提高了78.33％～118.4％。

關(guān)鍵詞：氬氣；離子束；復(fù)合誘變；谷胱甘肽；釀酒酵母

中圖分類號(hào)：Q93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007－7847(2007)03－0238－04

還原型谷胱甘肽(Glutathione，CSH)是由L，谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的一種同時(shí)含有γ-谷氨酸和巰基的生物活性三肽化合物，CSH在生物體內(nèi)具有多種重要的生理功能，特別是對(duì)于維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用，自1921年Hopkins首先發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽的存在以來(lái)，GSH不僅作為試劑廣泛用于生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)的研究測(cè)定中，而且已成為一種重要的生化藥物，隨著GSH更多的功能和性質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，人們?cè)谑称诽砑觿⑴R床醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)上對(duì)它的興趣在日益增長(zhǎng)，其需求量不斷增加。

高產(chǎn)GSH菌種的選育是國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)，目前報(bào)道的菌種選育方法主要是傳統(tǒng)的化學(xué)誘變方法(亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等)和物理誘變方法(紫外線和X射線)相結(jié)合，這樣的誘變方法，效率較低，產(chǎn)量提高的幅度也不大，本研究以產(chǎn)GSH的啤酒酵母菌株SC-20為出發(fā)菌株，通過(guò)等離子和紫外線的復(fù)合誘變，經(jīng)HgCl₂和ZnCl₂，抗性交替篩選，并采用高通量篩選方法，得到一株GSH含量與產(chǎn)量分別比出發(fā)菌株提高了78.33％和118.4％的突變株，本研究結(jié)果為該菌種的選育以及進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 菌種

啤酒酵母(saccharomyces cerevisiae)SC-20，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1．2培養(yǎng)基

1．2．1 YEPD培養(yǎng)基(斜面培養(yǎng)及平板純化用)(g/L)

葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，瓊脂20，pH自然。

1．2．2 搖瓶篩選培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖50，酵母粉5，Na₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 3，MgSO₂0.5，pH自然。

1．3 主要儀器

低能離子注入機(jī)，本校電氣與電子工程學(xué)院脈沖功率中心提供：Anke TGL-16G型超低溫離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；722S分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司：島津UV-2550紫外一可見(jiàn)光光度計(jì)，日本產(chǎn)。

1．4 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)谷胱甘肽、5，5′-二硫代雙(二硝基苯甲酸)[5，5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]為Sigma公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．5 方法

1．5．1 生物量的測(cè)定

取5mL發(fā)酵液，室溫下8000r/min離心5min收集菌體，去離子水洗滌菌體兩次后，85℃烘干至恒重后稱重。

1．5．2 GSH提取液制備

利用熱水抽提法。

1．5．3 GSH產(chǎn)量測(cè)定

采用DTNB顯色法，

1．5．4 誘變處理

1．5．4．1 UV誘變

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液5mL，離心并以無(wú)菌生理鹽水洗兩次，還原至原體積，轉(zhuǎn)入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，磁力攪拌，紫外燈(功率15w，照射距離35cm)照射一定時(shí)間，通過(guò)改變照射時(shí)間控制致死率。

1．5．4．2 等離子誘變

等離子體射線殺菌曲線的制作：取適量啤酒酵母菌懸液進(jìn)行氬氣等離子體射線輻照處理，輻照時(shí)間分別為0、10、20、30、40、50、60s，氬氣等離子器照射條件：工作電壓：5kV；頻率：20kHz；放電間隙：8.5mm；處理物距電極距離：2.5cm；注入氣體：氬氣；溫度：16.7℃；濕度：69％，將經(jīng)過(guò)不同輻照時(shí)間處理的菌液適當(dāng)稀釋涂平板，培養(yǎng)72h，根據(jù)處理前后的活菌數(shù)計(jì)算致死率，以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)作圖。

1．5．4．3 等離子和UV復(fù)合誘變

經(jīng)等離子處理過(guò)的菌體直接進(jìn)行紫外誘變即可，通過(guò)改變照射時(shí)間控制致死率。

誘變后的菌體以10倍梯度稀釋涂布于YEPD完全培養(yǎng)基，與稀釋度相同但未經(jīng)誘變的菌體對(duì)比計(jì)算致死率，上述3種誘變方式均將致死率控制在60％～80％。

1．5．5 抗性篩選物濃度的確定

經(jīng)誘變處理稀釋后的菌液分別涂布于不同質(zhì)量濃度的ZnCl₂和HgCl₂抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)72h，與相同稀釋度誘變處理后的菌體比較計(jì)算致死率，若致死率為60％～70％，則選定此質(zhì)量濃度進(jìn)行篩選。

1．5．6 初篩

將誘變處理的菌懸液經(jīng)梯度稀釋后涂布在抗性平板上，待其長(zhǎng)出菌落后，經(jīng)氯仿熏蒸破壁，噴上DTNB顯色劑，選取顯色圈的較大、顏色較深、顯色時(shí)間較長(zhǎng)的誘變菌株作為復(fù)篩的出發(fā)菌株。

1．5．7 復(fù)篩

將初篩到的菌株從斜面接至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h后，以10％的接種量將菌株接至搖瓶培養(yǎng)基，每株3瓶，培養(yǎng)48h后測(cè)各菌株的GSH含量，根據(jù)單位體積發(fā)酵液的GSH含量確定高產(chǎn)菌株。

2 結(jié)果與討論

2．1 等離子體誘變選育

2．1．1 等離子體射線誘變劑量的確定

等離子輻射是直接在生物分子上沉積能量，引起基因突變，從而達(dá)到誘變育種的目的，采用該方法誘變具有突變頻率高、突變譜廣、生理?yè)p傷小等優(yōu)點(diǎn)，由等離子體射線殺菌致死率(見(jiàn)圖1)結(jié)果可以看出，等離子體射線對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的致死率之間存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)?shù)入x子體射線照射時(shí)間為30s時(shí)，啤酒酵母的致死率就達(dá)到了76.5％，但隨著時(shí)間的增加存活率下降有所緩和，并有一短時(shí)上升后又下降的過(guò)程，當(dāng)?shù)入x子體射線輻照時(shí)間為60s時(shí)，致死率為98.5％，這可能是由于離子注入到一定程度激活了菌體的修復(fù)機(jī)制，但當(dāng)注入時(shí)間繼續(xù)增加細(xì)胞損傷無(wú)法修復(fù)，本文選擇30s的輻照劑量作為誘變指標(biāo)。

2．1．2 菌株的等離子體射線誘變選育

對(duì)出發(fā)菌株啤酒酵母SC-20進(jìn)行等離子體射線誘變處理30s(此時(shí)致死率為76.5％)，將經(jīng)誘變處理后的菌懸液梯度稀釋，然后涂布于0.70g/LZnCl₂抗性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72h后，經(jīng)過(guò)上述方法的初篩和復(fù)篩，選出產(chǎn)量較高的突變株，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1中可以看出，經(jīng)過(guò)等離子體射線誘變處理后，其中D-5突變株GSH的產(chǎn)量為50.64mg/L，胞內(nèi)含量為6.18mg/g，比出發(fā)菌株分別提高46.53％和39.50％。

2．2 紫外線誘變選育

2．2．1 紫外線處理時(shí)間對(duì)菌體存活率的影響

用不同的照射時(shí)間對(duì)菌體進(jìn)行紫外線處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖2可以看出，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率增加，9min時(shí)全部致死，由于紫外線有較強(qiáng)的殺菌能力和誘變能力，較高的致死率有利于篩選優(yōu)良菌株，但是如果處理時(shí)間太長(zhǎng)，一些高活性菌株也可能致死，不利于篩選，選取45s為誘變處理時(shí)間。

2．2．2 菌株的紫外線誘變選育 對(duì)等離子誘變處理后的菌株D-5分別以不同照射時(shí)間進(jìn)行UV誘變，實(shí)驗(yàn)選取紫外照射時(shí)間為45s，致死率為63％，使用質(zhì)量濃度0.01％的氯化汞(此時(shí)致死率為67％)抗性平板篩選，獲得GSH產(chǎn)量較高的突變株U-9，其GSH的產(chǎn)量為58.08mg/L

2．3 等離子體和紫外復(fù)合誘變

對(duì)U-9進(jìn)行等離子體和UV復(fù)合誘變，先用等離子體照射，后用紫外燈照射，分別照射不同時(shí)間，控制致死率，實(shí)驗(yàn)選取等離子照射時(shí)間15s，紫外線照射時(shí)間20s，致死率為75％，使用的氯化鋅抗性平板篩選，得到胞內(nèi)GSH含量較高的突變株DU-20，生物量為9.56g/L，GSH產(chǎn)量為75.48mg/L，菌體胞內(nèi)GSH含量7.90mg/g，整個(gè)誘變、篩選過(guò)程中的生產(chǎn)性狀變化見(jiàn)表2。

2．4 誘變株的遺傳穩(wěn)定性

由于誘變菌株的形狀常常不穩(wěn)定，尤其是在連續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)，為了檢測(cè)菌株形狀是否穩(wěn)定，將誘變出的DU-20菌株在YEPD試管中連續(xù)傳10代，每代用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)檢測(cè)谷胱甘肽的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明，菌株DU-20斜面連續(xù)傳10代，谷胱甘肽產(chǎn)量下降5.36％，說(shuō)明該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 討論

等離子體和紫外線兩種誘變劑的交替和復(fù)合使用，有效避免了使用單一誘變劑產(chǎn)生的誘變飽和效應(yīng)，HgCl₂和ZnCl₂兩種抗性篩選物交替使用，避免了菌體對(duì)同一種抗性物質(zhì)產(chǎn)生的耐受性，通過(guò)復(fù)合誘變技術(shù)處理出發(fā)菌株(S.cerevisi-ae)SC-20，選育出GSH高產(chǎn)菌株(S.cerevisiae)DU-20，產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了118.4％，并且從獲得的誘變株的傳代實(shí)驗(yàn)得出，誘變株DU-20有良好的遺傳穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與有關(guān)報(bào)道微生物復(fù)合誘變優(yōu)于同一方法單獨(dú)誘變的結(jié)論相一致，同時(shí)證明等離子體技術(shù)在微生物育種中切實(shí)可行，為人工誘變以改善微生物的生產(chǎn)能力提供了一條新途徑。

作者簡(jiǎn)介：龐德欽(1978－)，女，河南南陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵研究；余龍江(1966－)，男，湖北黃梅人，華中科技大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者，主要從事資源生物學(xué)的研究。