人端粒酶催化亞單位啟動子調控自殺基因ＨＳＶ－ＴＫ腫瘤細胞特異性表達載體的構建

摘 要：將自殺基因TK插入質粒pGL3-hTp和pGL3-Control中，取代其上的熒光素酶基因，分別構建hTERT啟動子和SV40啟動子調控的TK基因表達質粒pGL3-hTp-hK和pGL3-SV40-TK，酶切和PCR鑒定結果顯示重組質粒pCL3-hTp-TK和pGL3-Sv40-TK構建成功；用脂質體法將pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬時轉染端粒酶陽性的人肺腺癌細胞株A549及端粒酶陰性的人胚肺成纖維細胞株MRC-5，RT-PCR顯示轉染pCL3-SV40-TK的細胞A549和MRC-5均有TK mRNA表達，轉染pcL3-hTp-TK的A549細胞中也有TK mRNA表達，但轉染pCL3-hTp-rX的MRC-5細胞無TK mRNA表達，提示hTERT啟動子可以調控自殺基因HSV-TK(在肺癌細胞中靶向表達，可能是腫瘤靶向性基因治療中比較理想的轉錄調控元件。

關鍵詞：肺癌；自殺基因；端粒酶催化亞單位；靶向性表達

中圖分類號：R734.2 文獻標識碼：A 文章編號：1007－7847(2007)03－0273－06

人端粒酶催化亞單位(human telomerasecatalytic subunit，hTERT)是端粒酶的重要組成部分，其活性是端粒酶活性的決定性因素，幾乎所有分化成熟的正常體細胞均無端粒酶表達，而85％以上的腫瘤細胞中有高水平的端粒酶活性，因此，hTERT基因的表達也具有高度的腫瘤特異性，對端粒酶的深入研究結果顯示，hTERT基因表達的調節是多水平的，其中hTERT啟動子在轉錄水平的調控是最主要的調節機制，因此，作為轉錄調控元件的hTERT基因啟動子的轉錄活性也應該具有高度腫瘤特異性，基于此，如果用hTERT啟動子作為基因轉錄調控元件，來調控治療基因在腫瘤細胞中特異性表達，有可能實現腫瘤基因治療的靶向性，這方面的初步研究結果展示了令人鼓舞的前景，本研究采用基因工程方法構建了hTERT啟動子調控自殺基因HSV-TK的腫瘤細胞特異性表達載體，以探討hTERT啟動子作為肺癌靶向性基因治療中轉錄調控元件的可能性。

1 材料和方法

1．1 實驗材料

1．1．1 細胞

人肺腺癌細胞株A549和人胚肺成纖維細胞株MRC-5分別引自中國醫學科學院上海細胞庫和中國典型培養物保藏中心。

1．1．2 質粒

含SV40啟動子和增強子的熒光素酶報告質粒pGL3-Control，由四川大學華西醫院感染性疾病中心唐紅教授惠贈：含TK基因的質粒PCDNA3-TK由四川大學華西醫院車國衛博士惠贈，含1083bp的hTERT啟動子的質粒pGL3-hTp由本課題組在前一階段研究中構建。

1．1．3 主要試劑

限制性內切酶HindⅢ、Xba I、PCR試劑盒、RT-PCR試劑盒及DNA連接試劑盒DNA LigationKit Ver.2.1均為大連寶生物工程有限公司產品：脂質體Lipofectamine 2000、RNA提取試劑Trizol以及RPMI 1640、DMEM培養基均為Invitrogen公司產品；TK基因PCR引物由北京賽百盛公司合成；細胞基因組DNA提取試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒及PCR反應產物回收純化試劑盒均購自北京賽百盛公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 PCE擴增TK基因

以質粒PCDNA3-TK為模板擴增TK基因，TK基因上游引物序列為：5'CCCAAG CTTM CGC GTATGG cTr CGT AC 3'，下游引物序列為：5'CCCTCT AGA CCG GTA TrG TCT CCT TC 3'，上下游引物5′端分別帶有HindⅢ、Xba I的酶切位點(用下劃線標示)；PCR反應條件為：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環；72℃7min，反應結束后，取PCR產物6μL電泳，并送大連寶生物工程有限公司作DNA測序。

1．2．2 pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重組質粒的構建及鑒定。

質粒pGL3-hTp和pGL3-control作HindⅢ/XbaI雙酶切，用膠回收方法回收酶切產物中去除lu-ciferase基因片段的載體片段(分別約4.2kb和3.6Lb)，并與PCR擴增的TK基因的HindⅢ/XbaI雙酶切產物作連接反應(圖1，2)；反應液轉化大腸桿菌JM-109，用氨芐青霉素篩選陽性菌落，擴增，提取質粒，采用單酶切(HindⅢ)、雙酶切(HindⅢ/XbaI)和PCR方法鑒定。

1．2．3 轉染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTD-TK的細胞A549和MRC-5中TK基因表達的檢測

對數生長期的A549和MRC-5細胞，用脂質體法分別瞬時轉染重組質粒pGL3-SV40-TK(陽性對照組)、pGL3-hTp-TK(實驗組)和pGL3-hTp(陰性對照組)，轉染方法按照Lipofectamine 2000操作說明進行，72h后，提取DNA和RNA，并用PCR和R7-PCR方法檢測各轉染細胞中TK基因的存在和表達情況。

2 結果

2．1 TK基因的PCR產物電泳鑒定及DNA測序結果

電泳顯示，TK基因長度約1.1kb(圖3)；DNA測序結果與GenBank中TK基因序列完全一致(Ac-cession NP_044624)，長度為1131bp(圖4)。

2．2 pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重組質粒的鑒定

HindⅢ單酶切顯示，pGL3-hTp-TK長度為5.4kb，pGL3-SV40-TK長度為4.8kb；兩種質粒HindⅢ／Xba I雙酶切均在1.1kb位置出現DNA條帶(TK基因)，以兩種重組質粒為模板，PCR均擴增出廠K基因片段(圖5和圖6)。

2．3 轉染細胞中rx基因表達的檢測結果

轉染了質粒pGL3-h7p-TK和pGL3-SV40-TK的細胞株A549和MRC-5基因組DNA，PCR均擴增出TK基因(圖7)，說明pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK均成功轉入A549和MRC-5細胞：TK-PCR實驗結果顯示：轉染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5細胞均有TK mRNA表達，轉染pGL3-hTp-TK的細胞中，A549有TK mRNA表達，MRC-5無TK mRNA表達；轉染pGL3-hTp的A549和MRC-5細胞均無TKmRNA表達(圖8，9)。

3 討論

自殺基因治療是近年來腫瘤研究的熱點領域之一，也是目前最有可能有效應用于臨床的腫瘤基因治療策略之一，自殺基因是來源于病毒或細菌的一些藥物酶基因，如果將他們導人腫瘤細胞，其表達產物可以將某些無毒或低毒的藥物前體轉化為細胞毒性藥物，影響腫瘤細胞的DNA合成，導致細胞損傷，單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因是最具代表性的自殺基因，HSV-TK可以使核苷類似物如更昔洛韋，阿昔洛韋等磷酸化，生成環腺苷一磷酸，后者可以被細胞自身的激酶進一步磷酸化成為三磷酸鹽，這些三磷酸鹽通過DNA多聚酶α加入到DNA復制過程中，可導致DAN復制鏈終止及誘導DNA單鏈斷裂，在體外實驗和動物模型研究中，HSV-TK/GCV系統對多種腫瘤都顯示了令人鼓舞的治療效果；HSV-TK/GCV系統也是目前少數進行了Ⅲ期臨床試驗的腫瘤基因治療方案之一，然而，由于HSV-TK/GCV的治療作用缺乏腫瘤特異性，可能對正常細胞也具有損傷作用，Herraiz等的動物實驗顯示，HSV-TK/CCV有導致嚴重肝損害的可能，實現基因治療作用的腫瘤細胞靶向性，對提高自殺基因治療方法安全性及其臨床應用具重要意義。

應用某些組織特異性或腫瘤特異性基因啟動子從轉錄水平調控目的基因的表達，是實現腫瘤基因治療靶向性的重要途徑，這一方面的研究始于1993年，以往腫瘤靶向性基因治療研究中應用最多的基因轉錄調控元件有甲胎球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特異性抗原(PSA)基因的啟動子，大量研究結果證實了這種基因治療策略具有較強的可行性，但上述啟動子在靶向性基因治療中具有轉錄活性弱，應用范圍窄的局限性，因此，尋找轉錄活性強、腫瘤特異性高和應用范圍廣的基因轉錄調控元件有重要意義，人端粒酶催化亞單位(hTERT)是端粒酶的重要組份，是端粒酶活性的決定性因素，近年來的研究顯示，hTERT啟動子在轉錄水平的調控是hTERT基因表達的主要調節機制，國內外有多位研究者成功克隆了hTERT啟動子全長序列，并對其結構特點和轉錄功能作了深入研究，結果顯示hTERT啟動子的轉錄活性具有高度的腫瘤細胞特異性，在本課題的前期研究中，我們采用PCR方法成功克隆了1083 bp的hTERT啟動子片段，并檢測了它在多種肺癌細胞和正常細胞中的轉錄活性，結果顯示hTERT啟動子在各種肺癌細胞中均有不同的轉錄活性，在正常細胞中沒有轉錄活性，在本研究中，我們將自殺基因HSV-TK插入到含SV40啟動子和增強子的熒光素酶報告質粒pGL3-Control和我們前期研究中構建的DGL3-hTp質粒中，成功構建成pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK重組質粒，使TK基因的表達分別受到SV40啟動子和hTERT啟動子的轉錄調控，將pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK轉入端粒酶陽性的人肺腺癌細胞株A549和端粒酶陰性的人胚肺細胞株MRC-5，PCR實驗顯示，兩種重組質粒都成功轉入A549和MRC-5細胞；RT-PCR實驗顯示轉染了pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5均有TK mRNA，提示SV40啟動子對TK基因的轉錄調控不具有腫瘤細胞選擇性；轉染pGL3-hTp-TK的549也有TKmRNA表達，而MRC-5無TK mRNA表達，提示hTERT啟動子對TK基因表達的轉錄調控具有腫瘤細胞特異性，可能是腫瘤靶向性基因治療中較為理想的轉錄調控元件。

作者簡介：唐小軍(1973－)，男，四川安岳人，瀘州醫學院附屬醫院講師，博士，從事胸部腫瘤基礎研究及臨床工作；王艷萍(1966－)，女，四川廣漢人，四川大學華西醫院副教授，通訊作者，主要從事腫瘤基礎研究。