一株抗腫瘤活性的粗榧內生真菌的鑒定及其產物特性初步研究

摘 要：利用傳統分類學方法、電子顯微鏡觀察、18S rDNA和ITS序列的測定以及系統發育分析對一株分離自粗榧抗腫瘤活性內生真菌HCCBl621進行分類鑒定，并對其產物抗腫瘤活性進行了初步研究，各種指標鑒定其為木霉屬真菌綠色木霉(Trichoderma virlde Pers.ex Fr)，該菌株經發酵培養120h，抗瘤活性達最強；活性在pH4～9范圍內穩定；60℃處理1h，活性穩定，這些特性為活性產物的分離純化和穩定性研究提供了必要的參考。

關鍵詞：粗榧；內生真菌；鑒定；抗瘤活性

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A 文章編號：1007－7847(2007)03－0233－05

植物內生真菌是指生活在植物體內或生活史的一定階段處于植物體內的真菌，它的涵蓋面相當廣，包括菌根真菌和植物病原菌以及存在于健康植物的莖葉中不形成明顯病癥的真菌，植物內生真菌在植物微生態系統中與宿主植物建立了和諧的協同進化關系，其次生代謝產物十分豐富，從中發掘為人類可利用的資源，意義重大。

1993年，美國蒙大拿州立大學的Strobcl小組在短葉紅豆杉內生真菌(Taxomyces andreanae)中發現抗腫瘤藥物紫杉醇以來，植物來源的內生真菌抗腫瘤藥物重新被引起重視，人們陸續從多種植物內生真菌中分離到喜樹堿等抗腫瘤活性物質，本研究在進行了大規模抗腫瘤活性菌株的篩選后，選取其中一株分離自粗榧根部并且表現出較強抗腫瘤活性的內生真菌進行了較系統的研究，現將部分結果報道如下。

1 材料與方法

1．1 菌種來源

菌株HCCBl621由上海來益生物藥物研究開發中心保藏。

1．2培養基

固體培養基：Difco^TMPDA培養基和麥芽汁浸膏培養基。

液體培養基(％)：葡萄糖1.0，玉米粉1.0，黃豆粉2.0，KH₂PO₄ 0.1，pH自然。

1．3 菌株HCCBl621的分類鑒定

1．3．1 菌株的形態特征觀察

根據《真菌鑒定手冊》方法，采用平皿插片觀察菌落形態，電子顯微鏡下觀察菌絲體大小，形狀、表面特征及是否有橫隔、孢子大小、形狀、類型、顏色等，對照確定菌株的種屬地位。

1．3．2 基因組DNA提取、PCR擴增、序列測定

采用氯化芐法提取基因組DNA，根據真菌18S rDNA保守區設計引物，ITS(包括ITS1，5.8SrDNA，ITS2)序列用通用引物ITS4和ITS5擴增，引物由上海生物工程有限公司合成。

18S rDNA引物序列

Pf:5‘AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’， Pf:5‘-CGACGGGCGGTGTGTAC-3’;

ITS引物序列

ITS4: 5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS5: 5‘-GGAAGTAAAAGTAACAAGG-3’.

反應體系：18S rDNA：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP2μL，Pf，Pr各2μL，25mmol/LMgCl₂ 2μL，DNA模板2μL，Taq聚合酶0.5μL，加ddH₂O至50μL。

ITS：10×PCR buffrer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 2μL，ITSl，1TS4各1μL，25mmol/L MgCl₂1.5μL，DNA模板2×L，Taq聚合酶0.2μL，加ddH₂O至30μL。

PCR擴增條件：18S rDNA：94℃預變性5min，94℃變性30s，56℃退火30S，72℃延伸80s，30個循環，最后72℃延伸10min。

ITS：94℃預變性1min，93℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，最后72℃延伸10min。

用Gel exraction Kit從膠中純化回收PCR產物，測序工作由大連寶生物公司完成。

1．3．3 序列分析

將測序獲得的18S rDNA和ITS序列通過與GenBank中核酸數據庫序列進行Blast分析，利用Clustal x軟件包構建系統發育樹。進行親緣關系和系統發育分析。

1．4 供試細胞株及抗腫瘤活性檢測方法

人肺癌腺細胞A549和大腸癌細胞LoVo，上海醫藥工業研究院藥理室檢測，具體步驟采用體外細胞毒測定的MTY法，用MK-2全自動酶標儀在570nm波長下測定OD值，按公式計算對腫瘤細胞生長的抑制率(IC％)。

IC％＝((對照組OD值－實驗組OD值)/(對照組OD值))×100％

1．5 菌株HCCBl621發酵代謝產物生物活性物質的穩定性試驗

1．5．1 培養時間對菌株代謝產物活性的影響

將種子液接入發酵培養基，每隔24h取樣一次，以跟蹤腫瘤細胞抑制率，考察不同時間菌株代謝產物活性的變化。

1．5．2 不同pH對菌株代謝產物活性的影響

分別調節發酵上清液pH值為2、4、7、9、10、11以及正常發酵完pH7.4送樣測活，考察活性物質對酸堿的耐受程度。

1．5．3 不同處理溫度對菌株代謝產物活性的影響

分別于常溫(25℃)、40℃、60℃、80℃、100℃處理發酵樣品1h送樣測活，考察不同溫度對代謝產物活性齣影響。

2 結果與分析

2．1 HCCBl621菌株的鑒定

采用形態觀察的方法，HCCBl621菌株在PDA培養基28℃培養4d菌落直徑達到90mm(圖1)，菌落呈灰綠色粉狀，菌落背面呈紅棕色，營養菌絲透明光滑、有隔，0.6～1.4μm寬，孢子梗從氣生菌絲中分生，2.5～6.5μm(圖2A)，分生孢子梗呈二叉狀或二叉狀分枝，分枝角度多為銳角或近于直角，菌叢密集，分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，直立，分枝，小枝常對生，頂端不膨大，上生分生孢子團，分生孢子不串生，球形，淺色或無色，2.1～3.4μm(圖2B)，對照《真菌鑒定手冊》將HCCBl621初步歸屬為木霉屬(TrichodermaPers.ex Fr)。

通過分子生物學方法，PCR獲得菌株HC-CBl621的18S rDNA(GenBank登錄號EF208957)和ITS(登錄號EF212000)的近全長序列，分別為1567bp，581bp，將18S rDNA的序列與GenBank數據庫中已經收錄的序列進行Blast分析，結果表明，與HCCBl621菌株18S rDNA相似性較高的序列主要分布于木霉屬，其中與之相似性最高的是綠色木霉(T.viride)和黃綠木霉(T.aureoviride)，相似性分別為99％和96％，由此初步判定HCCBl621為木霉屬中的一個種，這與形態學的常規鑒定保持一致。

為了進一步確認，選取GenBank中與HC-CBl621的ITS序列同源性高的系列菌株用于系統發育分析，其序列長為568～621bp，構建系統發育樹，外群為Hypocrea G.J，S97-96(序列亦來自GenBank)，由圖3可見，HCCBl621與綠色木霉(T.viride NR6938)組成一個單系類群(mono-phyletic group)，同源性達到99.2％，它們的親緣關系最近， 同時它們又位于鄰近的T.virideNR6940，6883，IMI，T2，CBSl64的小分支或平行支中，通過形態學特征觀察、18S rDNA以及1TS序列進行聚類分析，初步確定其為木霉屬真菌綠色木霉(T.viride Pers.ex Fr)，至于是否需要更進一步的細分如亞種或變種等，還需對更多的菌株進行序列分析，并結合形態特征、培養性狀與生理生化特性等多方面的研究來確定。

2．2 HCCBl621菌株發酵代謝產物活性的穩定性研究

2．2．1 培養時間對菌株代謝產物活性的影響

結果見圖4，在培養120h時取樣對腫瘤細胞株A549抑制率達到最大，活性最高，稀釋、1000倍后抑制率仍達將近60％，其抑制活性較其他時間差異顯著，因此120h為最佳發酵終止時間，

2．2．2 不同pH對代謝產物活性穩定性的影響

由圖5可以看出，發酵液在pH4～9之間活性保持穩定，其穩定性差異不顯著，對A549細胞株的抑制率在稀釋100倍后仍然可以達到60％以上，在pH低于4及大于9時活性穩定性明顯下降，稀釋1000倍后各pH條件下活性差異不是很明顯，一方面可能是由于活性物質的量太少，接近其檢出極限，也可能由于試驗誤差所致。

2．2．3 不同處理溫度對代謝產物活性穩定性的影響

發酵上清液在5種溫度下處理1h(見圖6)，60℃時稀釋1000倍后對細胞株A549的抑制率仍在50％以上，活性保持穩定，同比80℃下活性下降4倍多，抑制率只為12.19％，這表明活性物質在60℃以下可保持穩定，這一特性為活性產物的分離提供了有益的參考。

3 討論

本研究通過對來源于中草藥植物內生真菌的大規模分離，其發酵產物進行抗腫瘤模型篩選，得到多株抗腫瘤活性的功能菌株，比例約占總數的1.02％，其中分離自粗榧的菌株HCCBl621具有與粗榧所產生的三尖杉酯類生物堿相似的抗瘤活性，這一特性與人們提出的“協同進化”理論以及共生于中草藥植物的內生真菌能產生與其相似的生理活性物質是一致的，深入研究開發有望實現大規模工業化發酵生產，從而為抗癌藥物生產開辟新途徑。

在傳統的真菌分類學上，一直都是以形態學特征為主要鑒定標準，但在對相關屬、復合種或亞種的鑒定分類時，利用真菌較保守的18S rDNA以及ITS序列進行系統發育聚類分析和真菌的多樣性研究已經成為有效而快速的手段。

據報道，木霉屬真菌綠色木霉是常見的土壤真菌，大多分離自土壤，它適應性強，生長迅速，傳播蔓延快，分泌毒素破壞一些藥用、食用菌菌絲的細胞質，抑制菌絲的生長，在農業上它對多種農作物病原菌如棉花立枯病具有拮抗作用，可用于農業上農作物的生防菌，綠色木霉(T.viridePers.ex Fr)共生于藥用植物組織內部，并具有強烈抗人類腫瘤細胞的特性鮮見報道，本研究通過對菌株HCCBl621發酵代謝產物特性的初步探索，基本掌握了活性物質對溫度、酸堿的耐受程度，這為下游生物活性物質的分離純化工作提供了有益的參考，通過對代謝產物的分離純化，已獲得1個具有抗腫瘤活性的雜環類單體化合物，可見來源于不同生境的微生物能產生不同的生理活性物質，深入開發前景廣闊。對于分離到的抗瘤活性單體化合物，具體的結構鑒定及抗瘤效果將另文報道。

致謝：本文電鏡照片由華東師范大學電鏡組協助完成，在此表示感謝。

作者簡介：何玉華(1981－)，男，安徽宣城人，碩士研究生，主要從事微生物發酵工程研究；陳代杰(1957－)，男，上海市人，上海醫藥工業研究院研究員，博士生導師，通訊作者，主要從事微生物藥物研究開發與微生物新藥篩選的研發工作。